كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن إلى جانب الجيل التالي من التسلسل (رقاقه-seq) هو أسلوب يستخدم لأقامه التفاعلات بين عوامل النسخ وتسلسل الجينوم التي تتحكم فيها. هذا البروتوكول يحدد تقنيات لأداء رقاقه-seq مع الاغشيه البيولوجية البكتيرية ، وذلك باستخدام السالمونيلا معوي سيرفار البكتيريا بيوفيلم البكتيرية كمثال.
الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن متبوعا بالتسلسل (رقاقه-seq) هو تقنيه التي يمكن استخدامها لاكتشاف الأهداف التنظيمية لعوامل النسخ ، والتعديلات هيستون ، وغيرها من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي. ويمكن أيضا استخدام بيانات الرقاقة المتسلسلة للعثور علي الربط التفاضلي لعوامل النسخ في الظروف البيئية المختلفة أو أنواع الخلايا. في البداية ، تم تنفيذ رقاقه من خلال التهجين علي ميكروصفيف (رقاقه تشيب) ؛ ومع ذلك ، أصبحت رقاقه-seq الطريقة المفضلة من خلال التطورات التكنولوجية ، وخفض الحواجز المالية للتسلسل ، وكميات هائله من إنتاج البيانات عاليه الجودة. ويرد في هذا البروتوكول وصف لتقنيات تنفيذ الرقاقات المتسلسلة مع الاغشيه البيولوجية البكتيرية ، وهي مصدر رئيسي للعدوى المستمرة والمزمنة. يتم تنفيذ رقاقه-seq علي السالمونيلا معوي سيرفار المكورات المعوية والخلايا المسوية ، واستهداف المنظم بيوفيلم الرئيسي ، csgd ، لتحديد الربط التفاضلي في نوعي الخلية. هنا ، فاننا نظهر الكمية المناسبة من بيوفيلم للحصاد ، وتطبيع لعينه التحكم بلانكتيتونيك ، بيوفيلم المجانسة للوصول عبر رابط ، وأداء الخطوات الروتينية المتسلسلة رقاقه للحصول علي نتائج التسلسل عاليه الجودة.
الاغشيه الحيوية البكتيرية ، والمجاميع الهيكلية للخلايا المضمنة في مصفوفة منتجه ذاتيا ، تقاوم الجفاف والمضادات البيولوجية والاستجابات المناعية المضيفة1. وعلي هذا النحو ، فانها تسبب التهابات المستمرة والمزمنة وتمثل تحديات فريدة للباحثين بسبب حلولهم للبقاء والانتقال. السالمونيلا المعوية سيرفار تياموريوم (s. وقد وجدت لإنشاء السكان غير متجانسة ظاهريا من المجاميع بيوفيلم التي تقاوم الجفاف والمضادات الحيوية ، والخلايا المسوية التي تعبر عن عوامل الضراوة في الثقافة البحتة عندما تتعرض للإجهاد البيئي (28 درجه مئوية ، والحد من المواد الغذائية)2. ينشا هذا اثنان خليه أنواع واجبه إلى تعبير [بيستابل] من الرئيسية [بيوفيلم] منظم, [ككب]3. لقد افترضنا ان هذا قد يكون استراتيجية الرهان التحوط للسالمونيلا، حيث الخلايا بلانكتونيك المشاركة في انتقال قصيرة الأجل وخلايا بيوفيلم قادره علي الاستمرار علي المدى الطويل في البيئة حتى فرصه لتصيب مضيف جديد ينشا2،4. تتميز العديد من العناصر التنظيمية التي تتحكم في التعبير الخاص ب csg operon بشكل جيد5. ومع ذلك ، وبصرف الفضل عن عدرا و csg operon6، معروفه الأهداف التنظيمية قليله من csg. ومن شان تحديد الشبكة التنظيمية CsgD مساعدتنا علي فهم أفضل لدوره حياه السالمونيلا والدور الذي تلعبه الاغشيه البيولوجية في الإرسال.
Chromatin ايمونوبريسيبيتيشن متبوعا التسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq) هو تقنيه قويه في الجسم الحي لتحديد الجينوم علي نطاق واسع من التفاعلات البروتين والحمض النووي ويوفر معلومات عن العمليات التنظيمية التي تنطوي علي عوامل النسخ ، والتعديلات هيستون ، أو التماثيل7. وقد استخدمت أحدث الدراسات هذه التقنية لتقييم ربط البروتين التفاضلي بين ظروف النمو وأنواع الخلايا8. في الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن (رقاقه) ، يتم إثراء شظايا الحمض النووي مع البروتينات المتفاعلة من خلال اختيار الأجسام المضادة من البروتينات المستهدفة. يتم حصاد الخلايا ويتم ربط البروتينات المرتبطة بالحمض النووي بالحمض النووي في الجسم المجري من خلال علاج الفورمالديهايد عبر الرابط. يتم الضغط علي الخلايا ، والإفراج عن محتويات الخلية ، ويتم الكشف عن الكروماتين في ما يقرب من 200-600 bp شظايا7. شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين المستهدف هي إيمونوبريسيبيتاتيد باستخدام الأجسام المضادة ، ومعزولة عن طريق أزاله التشابك متبوعا بهضم البروتين9. وتمثل شظايا الحمض النووي هذه مواقع ربط البروتين التي يقابلها التهجين إلى ميكروصفيف (رقاقه تشيب) أو عن طريق التسلسل العميق ورسم الخرائط لتسلسل الجينوم10،11. علي الرغم من ان التجارب رقاقه تشيب تسفر عن بيانات تنظيميه كافيه ، فهي محدوده بسبب استخدام تحقيقات مكلفه ، فضلا عن التهجين والتحيز صفيف12. رقاقه-seq لديها مجموعه ديناميكية أكبر مع زيادة القرار النيوكليوتيد والتغطية ، وتحسين نسبه الاشاره إلى الضوضاء ، والقطع الاثريه اقل بالمقارنة مع رقاقه رقاقه7.
وقد استخدمت رقاقه لتحليل sfh و ompr التنظيم في السالمونيلا سيرفار تياموريوم13،14، النصاب–الاستشعار AphA التنظيم في فيبريو الجينات15، اللائحة rpos في القولونية16، التنظيم التنظيمية التحكم في المتفطره السل17، المحتملة diguanylate الدوريات من خلال التنظيم amrz في الزائفة الزنجاريه18، فضلا عن vrasr التنظيم في المكورات العنقوديةالذهبية19. تبدا التجارب البكتيرية المتسلسلة التي تم وصفها بالخلايا المتنامية في الوسائط السائلة والحصاد في شكل خليه واحده. ومع ذلك ، فان تحليل الاغشيه البيولوجية والتنظيم الجيني المناظر يمثل مجموعه جديده من التحديات لتوليد بروتوكول الرقاقة المتسلسلة الناجح. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام رقاقه-seq للعثور علي الأهداف التنظيمية التفاضلية من CsgD ، S. منظم بيوفيلم الرئيسي بيوفيلم في أنواع الخلايا بيوفيلم و عوالق. يصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد الكميات المناسبة من بيوفيلم لرقاقه-seq ، حصاد بيوفيلم من ثقافة قارورة ، تطبيع بيوفيلم وعينات التحكم خليه واحده ، تجانس بيوفيلم ، وكامله ايمونوبريسيبيتيشن. سيكون ذلك مفيدا لدراسة الأهداف التنظيمية في الاغشيه البيولوجية البكتيرية ويمكن تكييفه للعديد من الأنواع.
هذا البروتوكول يحدد تقنيه لأداء رقاقه-seq مع السالمونيلا معوي سيرفار المكورات المعوية بيوفيلم وخلايا عوالق من الثقافة البحتة ، للعثور علي الأهداف التنظيمية للمنظم بيوفيلم الرئيسي ، csgd. ونحن نتوقع المعلومات التفاضلية الملزمة بسبب الاستقرار ثنائي csgd في نوعي الخلية ، مع مستويات عاليه في المجاميع بيوفيلم ومستويات منخفضه في الخلايا عوالق2،3. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية علي عوامل النسخ البكتيرية الأخرى ، وأنواع الخلايا ، أو ظروف النمو. وعلي وجه الخصوص ، يمكن تكييف هذه التقنية مع العوامل البيولوجية البكتيرية الأخرى باستخدام عامل تحويل محدد بالتجربة لوحده التشكيل الثنائية لكل وزن للوحدة من خلايا بيوفيلم.
رقاقه-seq يمكن ان تكون عرضه لتضخيم الخطا الفني من خلال التسلسل; ومع ذلك ، يمكن تاكيد في الخطوات الهامه منع هذا27. خصوصية الأجسام المضادة الاوليه مهمة لاختيار عامل النسخ المستهدف فقط والحمض النووي الذي يتحكم به خلال ايمونوبريسيبيتيشن7. وفي هذه التجربة ، تم دمج Csgd في علامة 3xFLAG المرمزة بالبلازما في 3 ‘ نهاية الجين ، والتي تتوافق مع المحطة C من csgd22. تم استخدام البلازميد p3xFLAG بدون csgd ك “السيطرة” (S. التيتيموريريوم 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). مبادئ توجيهيه ترميز يوصي بأداء المناعة مع الأجسام المضادة الاساسيه ضد البروتين من الفائدة ، والبقع من سلالات رقاقه وسلالات الحذف21. ومن المهم ضمان ان تكون ظروف النمو متسقة عبر النسخ المتماثلة للحد من التباين في نتائج ربط عوامل النسخ والتسلسل النهائي. ان واحده يكون حريصه ان يضمن [اينكوه] حجوم و[بر-فينوم] حاله نمو شروط متسقة, [بيوفيلم] حاله نمو في قارورة ثقافة متسقة4. من المهم التاكد من ان كل بيوفيلم قد تم كسره بعد التجانس ، لضمان الوصول المتساوي للكواشف ، وخاصه الفورمالديهايد عبر رابط ، إلى جميع الخلايا.
قد تمكن العديد من التعديلات الباحثين من استخدام هذا البروتوكول للبروتينات الأخرى التي تربط الحمض النووي ، وأنواع الخلايا ، والسلالات ، وظروف النمو ، أو معدات المختبر. إذا تم استخدامه للأنواع التي تشكل بيوفيلم غير S. التيفوئيد, عامل التحويل من مستعمره تشكيل وحدات لكل وحده الوزن بيوفيلم يحتاج إلى تحديد تجريبي من خلال حصاد كميات مختلفه من بيوفيلم, المجانسة بيوفيلم جيدا, وأداء التخفيفات التسلسلية والعد لوحه لخلق منحني القياسية, التي قد لا تكون دقيقه في الأوزان بيوفيلم اقل2. Sonicator نقل الطاقة ومقاومه نوع الخلية قد تختلف; ولذلك ، ينصح بفحص سونيكيشن للعثور علي عدد من رشقات ناريه سونيكيشن التي سوف تنتج نطاق حجم الجزء المطلوب لاعداد المكتبة المصب والتسلسل11. تفتيت الكروماتين بواسطة النوكوكال المجهرية هو بديل سونيكيشن التي تنتج عاليه الدقة من مواقع الشغل. ومع ذلك ، قد يعرض هذا الأسلوب التحيزالتجزئة 7,28. ويمكن تغيير نطاق حجم الحمض النووي اعتمادا علي مجموعات اعداد المكتبة المصب ومنصات التسلسل. ويمكن استخدام أساليب أخرى من التجانس بدلا من مطحنه خلاط. علي سبيل المثال ، قد يتم استبدال الخالط الانسجه الزجاجية ، ولكنها قد ايرودوليز أو تفكك بشكل غير كامل حتى biofilm. وفيما يتعلق بالضوابط ، يمكن تطبيع الحمض النووي قبل الإيمونوبريسيبيتاتي في المعالجة والتحليل بعد التسلسل. ويمكن استخدام التحكم وهميه IP مع مصل الأجسام المضادة الطبيعية المتطابقة الأنواع كعنصر تحكم وكذلك13.
يجب علي الباحثين النظر في القيود المفروضة علي هذه الطريقة عند النظر في تجربه الرقاقة المتسلسلة. قد تكون هناك حاجه إلى تعديلات كبيره للتكيف مع أنواع بيوفيلم أخرى. علي سبيل المثال ، مع السالمونيلا القابلة لأعاده التعليق الفوري من بيوفيلم في الاذاعه التلفزيونية يؤدي إلى فقدان قابله للقياس من المجاميع بيوفيلم. ايمونوبريسيبيتيشن استهداف الأهداف التنظيمية لعوامل النسخ في البكتيريا قد يؤدي إلى كميات صغيره جدا من الحمض النووي ، وهو تحد لتنقيه والكشف في الخطوات اللاحقة. يمكن تقديم التحيز اثناء القص والتلاعب المصب اثناء الكشف عن المكتبة9. الاضافه إلى ذلك ، لا يكشف هذا الأسلوب في مستويات التعبير المجرية استجابه لربط عامل النسخ. الباحثين الذين لديهم خبره قليله في المعلوماتية الحيوية قد يكون تحديا من قبل خط أنابيب التحليل. ويمكن ان تكون هذه الطريقة كثيفه الوقت ومكلفه ؛ ومع ذلك ، فان تكلفه التسلسل غالبا ما تكون اقل من المصفوفة الصغيرة وتتناقص مع مرور الوقت مع استمرار التحسينات التكنولوجية.
يصف قليل من طرق في الأدب رقاقه مع جراثيم, وكثير تجارب جرثوميه يبدا مع بسيطه حاله نمو شرط13,14,15,17,18. رقاقه اعداد عينه مع خلايا واحده واضحة ويقدم التحديات اقل من اعداد عينه رقاقه مع المجاميع بيوفيلم. اما بالنسبة لرقاقه-seq ،وقد استكملت الأساليب السابقة لدراسة الدوائر التنظيمية كومنولث الدول المستقلة ، بما في ذلك التطور المنهجي لل يغاندس عن طريق الإثراء الاسي (selex) ، اختبارات تحول التنقل الكهربي (emsa) ، رقاقه تشيب ، وحذف المروج وتحليل مراسل أو استبدالها رقاقه-seq رقاقه-seq هو استبدال رقاقه تشيب بسبب التكنولوجيات المتقدمة وتوافر التسلسل. ويوفر التسلسل العميق للباحثين كميات هائله من البيانات التي يمكنها تحديد المواقع ذات التقارب الملزم الأقل ودقه الزوج القاعدي الأعلى مع مواد بدء اقل من رقاقه تشيب11,30. تحليل البيانات رقاقه من الكائنات الحية مع جوده عاليه الجينوم المرجعي عموما سريعة ومحدده. بالاضافه إلى ذلك ، رقاقه-seq هو طريقه شامله لاكتشاف في سيليكو توقع المواقع ملزمه التي قد لا تكون مشغولة في جميع أنواع الخلايا ، ومرحله النمو ، أو الظروف البيئية31.
في المستقبل ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتسهيل فهم المرض البكتيري ، وخاصه الكائنات الحية التي تشكل البيوفيلم. الاعتماد الواسع لهذه التقنية وتوافر مجموعات البيانات الجديدة يمكن ان يؤدي إلى تكامل المعطيات لتحديد مجموعات من البروتينات التي تشارك في التحكم في العمليات الخلوية في الكائنات المجهرية التي تشكل بيوفيلم-32. الاضافه إلى ذلك ، يمكن دمج البيانات المتسلسلة بين الرقاقة والجيش الملكي النيبالي لبناء نماذج النظام التنظيمي33.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا البحث بمنحه من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (NSERC) (#2017-05737) إلى فصيل عبد القادر ومن خلال كرسي Jarislowsky في التكنولوجيا الحيوية. وكان النائب مدعوما بمنحه دراسية من خلال برنامج التدريب المتكامل في الامراض المعدية وسلامه الاغذيه والسياسة العامة (ITraP) في جامعه ساسكاتشوان.
ويود المؤلفون ان يشكروا داني دايل علي التصوير والتحرير.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |