Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit der Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-seq) ist eine Methode, die verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und den von ihnen kontrollierten genomischen Sequenzen herzustellen. Dieses Protokoll skizziert Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, wobei Salmonella enterica serovar Typhimurium bakterieller Biofilm als Beispiel verwendet wird.
Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die regulatorischen Ziele von Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen und anderen DNA-assoziierten Proteinen zu entdecken. ChIP-seq-Daten können auch verwendet werden, um differentiale Bindung von Transkriptionsfaktoren in verschiedenen Umgebungsbedingungen oder Zelltypen zu finden. Zunächst wurde ChIP durch Hybridisierung auf einem Mikroarray (ChIP-Chip) durchgeführt; ChIP-seq ist jedoch durch technologische Fortschritte, abnehmende finanzielle Hürden für die Sequenzierung und massive Mengen hochwertiger Datenproduktion zur bevorzugten Methode geworden. Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, einer Der Hauptquellen persistenter und chronischer Infektionen, werden in diesem Protokoll beschrieben. ChIP-seq wird auf Salmonella enterica serovar Typhimurium Biofilm und planktonischen Zellen durchgeführt, die auf den Master-Biofilm-Regulator CsgD abzielen, um die Differentialbindung in den beiden Zelltypen zu bestimmen. Hier zeigen wir die für die Ernte geeignete Menge an Biofilm, die Normalisierung zu einer planktonischen Kontrollprobe, die Homogenisierung des Biofilms für den Crosslinker-Zugriff und die Durchführung routinemäßiger ChIP-Seq-Schritte, um qualitativ hochwertige Sequenzierungsergebnisse zu erzielen.
Bakterielle Biofilme, strukturelle Aggregate von Zellen, die in eine selbst produzierte Matrix eingebettet sind, sind resistent gegen Austrocknung, Antibiotika und Wirtsimmunantworten1. Als solche verursachen sie anhaltende und chronische Infektionen und stellen Forscher aufgrund ihrer Überlebens- und Übertragungslösungen vor einzigartige Herausforderungen. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) wurde gefunden, um phänotypisch heterogene Populationen von Biofilm-Aggregaten zu etablieren, die gegen Austrocknung und Antibiotika resistent sind, und planktonischen Zellen, die Virulenzfaktoren in reine Kultur ausdrücken, wenn sie Umweltstress ausgesetzt sind (28 °C, Begrenzung von Nährstoffen)2. Diese beiden Zelltypen entstehen durch die bistabile Expression des Master-Biofilmregulators CsgD3. Wir haben vermutet, dass dies eine Bet-Hedging-Strategie für Salmonellensein kann, wo die planktonischen Zellen an der kurzfristigen Übertragung teilnehmen und Biofilmzellen in der Lage sind, langfristig in der Umwelt zu bleiben, bis eine Gelegenheit entsteht, einen neuen Wirt zu infizieren2,4. Viele der regulatorischen Elemente, die den csg-Operon-Ausdruck steuern, sind gut charakterisiert5. Abgesehen von adrA und dem csg operon6sind jedoch nur wenige regulatorische Ziele von CsgD bekannt. Die Identifizierung des CsgD-Regulierungsnetzes würde uns helfen, den Salmonellen-Lebenszyklus und die Rolle, die Biofilme bei der Übertragung spielen, besser zu verstehen.
Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine leistungsstarke In-vivo-Technik zur genomweiten Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen und liefert Informationen über regulatorische Prozesse mit Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen oder Nukleosomen7. Neuere Studien haben diese Technik verwendet, um die Differentialproteinbindung zwischen Wachstumsbedingungen und Zelltypen8zu bewerten. Bei Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) werden DNA-Fragmente mit interagierenden Proteinen durch Antikörperauswahl der Zielproteine angereichert. Die Zellen werden geerntet und DNA-bindende Proteine werden durch formaldehyd-Kreuzlinkerbehandlung mit der DNA in vivo vernetzt. Die Zellen werden lysiert, wodurch der Zellinhalt freigesetzt wird, und Chromatin wird in etwa 200–600 bp Fragmente7geschert. DNA-Fragmente, die an das Zielprotein gebunden sind, werden mit Antikörpern immunpräzipiert und durch De-Vernetzung isoliert, gefolgt von der Proteinverdauung9. Diese DNA-Fragmente stellen Proteinbindungsstellen dar, die durch Hybridisierung zu einem Mikroarray (ChIP-Chip) oder durch tiefe Sequenzierung und Kartierung zur Genomsequenz10,11ergänzt werden. Obwohl ChIP-Chip-Experimente ausreichende regulatorische Daten liefern, sind sie aufgrund des Einsatzes teurer Sonden sowie Hybridisierung und Array-Bias12begrenzt. ChIP-seq hat einen größeren Dynamikbereich mit erhöhter Nukleotidauflösung und -abdeckung, verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis und weniger Artefakten im Vergleich zu ChIP-Chip7.
ChIP wurde verwendet, um Sfh und OmpR Regulierung in Salmonella serovar Typhimurium13,14, Quorum-Sensing AphA Regulierung in Vibrio alginolyticus15, RpoS Regulierung in Escherichzu analysieren ia coli16, Virulenzregulator EspR-Regulierung bei Mycobacterium tuberculosis17, potentielle Digulylatcyclasen durch AmrZ-Regulierung in Pseudomonas aeruginosa18, sowie VraSR Regulierung in Staphylococcus aureus19. Die beschriebenen bakteriellen ChIP-Seq-Experimente beginnen mit dem Anbau von Zellen in flüssigen Medien und der Ernte in einzelliger Form. Die Analyse von Biofilmen und die entsprechende Genregulation stellen jedoch eine neue Reihe von Herausforderungen dar, um ein erfolgreiches ChIP-seq-Protokoll zu generieren. In diesem Protokoll wird ChIP-seq verwendet, um differenzielle regulatorische Ziele von CsgD, der S, zu finden. Typhimurium-Master-Biofilmregulator in Biofilm- und planktonischen Zelltypen. Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der geeigneten Mengen an Biofilm für ChIP-seq, Ernte Biofilm aus Kolbenkultur, Normalisierung Vonbiose und Einzelzell-Kontrollproben, Homogenisierung von Biofilm und vollständige Immunpräzipitation. Dies wird für die Untersuchung der regulatorischen Ziele in bakteriellen Biofilmen nützlich sein und kann für viele Arten angepasst werden.
Dieses Protokoll skizziert eine Technik zur Durchführung von ChIP-seq mit Salmonella enterica serovar Typhimurium Biofilm und planktonischen Zellen aus reiner Kultur, um regulatorische Ziele des Master-Biofilmregulators CsgD zu finden. Wir erwarten differenzielle Bindungsinformationen aufgrund der Bi-Stabilität von CsgD in den beiden Zelltypen, mit hohen Konzentrationen in Biofilmaggregaten und niedrigen Konzentrationen in planktonischen Zellen2,3. Diese Technik kann jedoch auch auf andere bakterielle Transkriptionsfaktoren, Zelltypen oder Wachstumsbedingungen angewendet werden. Insbesondere kann diese Technik mit einem experimentell ermittelten Umwandlungsfaktor für Die KBE pro Gewichtseinheit von Biofilmzellen an andere bakterielle Biofilme angepasst werden.
ChIP-seq kann durch Sequenzierung anfällig für die Verstärkung technischer Fehler sein; Eine Bestätigung bei kritischen Schritten kann dies jedoch verhindern27. Primäre Antikörperspezifität ist wichtig für die Auswahl nur des Zieltranskriptionsfaktors und der DNA, die es während der Immunpräzipation kontrolliert7. In diesem Experiment wurde csgD mit einem plasmidcodierten 3xFLAG-Tag am 3′-Ende des Gens verschmolzen, das dem C-Terminus von CsgD22entspricht. Das p3xFLAG-Plasmid ohne csgD wurde als “Kontrolle”(S. Typhimurium 14028 csgD + p3xFLAG). ENCODE-Richtlinien empfehlen die Durchführung von Immunoblots mit primärem Antikörper gegen das Protein von Interesse und Lysaten von ChIP-Stämmen und Deletionsstämmen21. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Wachstumsbedingungen in allen Replikationen konsistent sind, um die Variabilität der Transkriptionsfaktorbindung und der nachgelagerten Sequenzierungsergebnisse zu reduzieren. Wenn man darauf achtet, inokulum Größen und Pre-Inoculum Wachstumsbedingungen konsistent sind, Biofilm Wachstum in Kolbenkultur ist konsistent4. Es ist wichtig zu bestätigen, dass alle Biofilme nach der Homogenisierung auseinandergebrochen sind, um einen gleichberechtigten Zugang von Reagenzien, insbesondere Formaldehyd-Kreuzverlinkern, zu allen Zellen zu gewährleisten.
Mehrere Modifikationen können es Forschern ermöglichen, dieses Protokoll für andere DNA-bindende Proteine, Zelltypen, Stämme, Wachstumsbedingungen oder Laborgeräte zu verwenden. Wenn es für biofilmbildende Arten außer S. verwendet wird. Typhimurium, der Umrechnungsfaktor der koloniebildenden Einheiten pro Einheitsgewicht des Biofilms, muss experimentell bestimmt werden, indem verschiedene Mengen an Biofilm geerntet, der Biofilm gründlich homogenisiert und serielle Verdünnungen und Plattenzählungen ausgeführt werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die bei niedrigeren Biofilmgewichten2möglicherweise nicht genau ist. Sonicator Energieübertragung und Zelltypwiderstand können abweichen; Daher wird ein Beschallungstest empfohlen, um die Anzahl der Beschallungsbursts zu ermitteln, die den Fragmentgrößenbereich erzeugen, der für die Nachbereitung und Sequenzierung der Bibliothek erforderlich ist11. Chromatin-Fragmentierung durch Mikrokokken-Nuklease ist eine Alternative zur Beschallung, die eine hohe Auflösung von Belegungsstellen erzeugt; Diese Methode kann jedoch zu Fragmentierungsverzerrungen7,28führen. Der DNA-Größenbereich kann in Abhängigkeit von nachgeschalteten Bibliotheksvorbereitungskits und Sequenzierungsplattformen geändert werden. Anstelle der Mischermühle können andere Homogenisierungsmethoden eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Glasgewebe Homogenisator ersetzt werden, aber es kann Aerosolisieren oder unvollständig aufbrechen Biofilm. In Bezug auf die Kontrollen kann die vorimmunpräcipitate DNA in der Verarbeitung und Analyse der Nachsequenzierung normalisiert werden. Als Kontrollmittel kann auch eine Mock-IP-Steuerung mit artgerechtem normalem Antikörperserum verwendet werden13.
Forscher müssen die Einschränkungen dieser Methode berücksichtigen, wenn sie ein ChIP-seq-Experiment in Betracht ziehen. Erhebliche Änderungen können erforderlich sein, um sie an andere Biofilmtypen anzupassen. Zum Beispiel führt die sofortige Resuspension von Biofilm in PBS bei Salmonella Typhimurium zu einem messbaren Verlust von Biofilmaggregaten. Immunpräzipitation, die auf regulatorische Ziele von Transkriptionsfaktoren in Bakterien abzielt, kann zu sehr geringen Mengen an DNA führen, was eine Herausforderung für die Reinigung und detektion in späteren Schritten darstellt. Bias kann während des Scherens und der nachgeschalteten Manipulation während der Bibliothekserkennung9eingeführt werden. Darüber hinaus zeigt diese Methode keine In-vivo-Expressionsniveaus als Reaktion auf die Transkriptionsfaktorbindung. Forscher, die wenig Erfahrung in der Bioinformatik haben, können durch die Analysepipeline herausgefordert werden. Diese Methode kann zeitintensiv und teuer sein. Die Kosten für die Sequenzierung sind jedoch oft niedriger als bei einem Mikroarray und gehen im Laufe der Zeit zurück, da die technologischen Verbesserungen weiterhin vorgenommen werden.
Wenige Methoden in der Literatur beschreiben ChIP mit Bakterien, und die meisten bakteriellen Experimente beginnen mit einem einfachen Wachstumszustand13,14,15,17,18. Die ChIP-Probenvorbereitung mit Einzelzellen ist einfach und stellt weniger Herausforderungen dar als die ChIP-Probenvorbereitung mit Biofilmaggregaten. Was ChIP-seq betrifft, so wurden frühere Methoden zur Untersuchung von cis-regulatorischen Schaltkreisen, einschließlich der systematischen Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX), elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), ChIP-Chip, Promoter-Deletion und Reporteranalyse, durch ChIP-seq29ergänzt oder ersetzt. ChIP-seq ersetzt den ChIP-Chip aufgrund der fortschreitenden Technologien und der Verfügbarkeit der Sequenzierung. Die tiefe Sequenzierung bietet Forschern riesige Datenmengen, die Standorte mit geringerer Bindungsaffinität und höherer Basispaarauflösung mit weniger Ausgangsmaterial als ChIP-Chip11,30identifizieren können. Die Analyse von ChIP-Daten von Organismen mit hochwertigen Referenzgenomen ist im Allgemeinen schnell und spezifisch. Darüber hinaus ist ChIP-seq eine gründliche Methode zur Entdeckung in silico vorhergesagten Bindungsstellen, die möglicherweise nicht in allen Zelltypen, Wachstumsphasen oder Umgebungsbedingungen belegt sind31.
In Zukunft kann dieses Protokoll verwendet werden, um das Verständnis der bakteriellen Pathogenese, insbesondere biofilmbildender Organismen, zu erleichtern. Eine breite Anwendung dieser Technik und die Verfügbarkeit neuer Datensätze können zur Datenintegration führen, um Gruppen von Proteinen zu identifizieren, die zur Steuerung zellulärer Prozesse in biofilmbildenden Mikroorganismen mitlokalisieren32. Darüber hinaus können ChIP-seq- und RNA-seq-Daten integriert werden, um regulatorische Systemmodelle zu erstellen33.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde durch ein Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) an AW und durch den Jarislowsky Lehrstuhl für Biotechnologie unterstützt. MP wurde durch ein NSERC-CREATE-Stipendium im Rahmen des Integrated Training Program in Infectious Diseases, Food Safety and Public Policy (ITraP) an der Universität Saskatchewan unterstützt.
Die Autoren danken Dani Dale für die Dreharbeiten und Schnitte.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |