L’immunoprecipitazioni della cromatina abbinata al sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è un metodo utilizzato per stabilire le interazioni tra i fattori di trascrizione e le sequenze genomiche che controllano. Questo protocollo delinea le tecniche per l’esecuzione di ChIP-seq con biofilm batterici, utilizzando come esempio il biofilm batterico di Salmonella enterica serovar Typhimurium.
L’immunoprecipitazioni della cromatina seguita dal sequenziamento (ChIP-seq) è una tecnica che può essere utilizzata per scoprire gli obiettivi normativi dei fattori di trascrizione, delle modifiche agli istoni e di altre proteine associate al DNA. I dati ChIP-seq possono essere utilizzati anche per trovare l’associazione differenziale dei fattori di trascrizione in diverse condizioni ambientali o tipi di cellule. Inizialmente, ChIP è stato eseguito attraverso l’ibridazione su un microarray (ChIP-chip); tuttavia, ChIP-seq è diventato il metodo preferito attraverso i progressi tecnologici, riducendo le barriere finanziarie al sequenziamento e le enormi quantità di output di dati di alta qualità. Le tecniche di esecuzione di ChIP-seq con biofilm batterici, una delle principali fonti di infezioni persistenti e croniche, sono descritte in questo protocollo. ChIP-seq viene eseguito su biofilm di Typhimurium di Typhimurium e cellule planctoniche della Salmonella, mirando al regolatore principale del biofilm, CcGD, per determinare l’associazione differenziale nei due tipi di cellule. Qui, dimostriamo la quantità appropriata di biofilm da raccogliere, normalizzandosi in un campione di controllo planctonico, omogeneizzando biofilm per l’accesso cross-linker ed eseguendo passaggi ChIP-seq di routine per ottenere risultati di sequenziamento di alta qualità.
I biofilm batterici, aggregati strutturali di cellule incorporate in una matrice autoprodotta, sono resistenti alla disidratazione, agli antibiotici e alle risposte immunitarie dell’ospite1. Come tali, causano infezioni persistenti e croniche e presentano sfide uniche ai ricercatori a causa delle loro soluzioni alla sopravvivenza e alla trasmissione. Salmonella enterica sierovar Typhimurium (S. Typhimurium) è stato trovato per stabilire popolazioni fenotipicamente eterogenee di aggregati di biofilm che sono resistenti alla disidratazione e agli antibiotici, e cellule planctoniche che esprimono fattori di virulenza nella coltura pura quando esposte allo stress ambientale (28 gradi centigradi, limitando i nutrienti)2. Questi due tipi di cellule sorgono a causa dell’espressione bistabile del regolatore principale del biofilm, CsgD3. Abbiamo ipotizzato che questa possa essere una strategia di copertura delle scommesse per la Salmonella, dove le cellule planctoniche partecipano alla trasmissione a breve termine e le cellule di biofilm sono in grado di persistere a lungo termine nell’ambiente fino a quando non sorge l’opportunità di infettare un nuovo ospite2,4. Molti degli elementi normativi che controllano l’espressione csg operon sono ben caratterizzati5. Tuttavia, a parte adrA e l’operon csg 6, sono noti pochi obiettivi normativi di CsgD. L’identificazione della rete di regolamentazione CsgD ci aiuterebbe a comprendere meglio il ciclo di vita della Salmonella e il ruolo che i biofilm svolgono nella trasmissione.
L’immunoprecipitazioni della cromatina seguita dal sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è una potente tecnica in vivo per l’identificazione a livello di genoma delle interazioni proteina-DNA e fornisce informazioni sui processi normativi che coinvolgono fattori di trascrizione, modifiche agli istoni o nucleosomi7. Studi più recenti hanno utilizzato questa tecnica per valutare il legame differenziale delle proteine tra le condizioni di crescita e i tipi di cellule8. Nell’immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP), i frammenti di DNA con proteine interagenti vengono arricchiti attraverso la selezione degli anticorpi delle proteine bersaglio. Le cellule vengono raccolte e le proteine che legano il DNA sono collegate incrociatamente al DNA in vivo attraverso il trattamento cross-linker della formaldeide. Le cellule sono lised, rilasciando il contenuto della cella, e la cromatina viene tosata in circa 200-600 bp frammenti7. I frammenti di DNA legati alla proteina bersaglio sono immunoprecipitati con anticorpi e isolati per decrosslinking seguiti dalla digestione delle proteine9. Questi frammenti di DNA rappresentano siti di legame proteico abbinati per ibridazione a un microarray (ChIP-chip) o da sequenziamento profondo e mapping alla sequenza genoma10,11. Sebbene gli esperimenti ChIP-chip producano dati normativi adeguati, sono limitati a causa dell’uso di sonde costose, nonché dell’ibridazione e della distorsione degli array12. ChIP-seq ha una gamma dinamica più ampia con maggiore risoluzione e copertura dei nucleotidi, un migliore rapporto segnale-rumore e un minor numero di artefatti rispetto a ChIP-chip7.
ChIP è stato utilizzato per analizzare la regolazione Sfh e OmpR in Salmonella sierovar Typhimurium13,14, regolazione AphA quorum-sensing in Vibrio alginolyticus15, regolazione RpoS in Escherichi a coli16, regolatore di virulenza EspR regolazione in Mycobacterium tuberculosis17, potenziali cicliche diguanylate attraverso la regolazione Amr in Pseudomonas aeruginosa18, così come VraSR regolamento a Staphylococcus aureus19. Gli esperimenti batterici ChIP-seq che sono stati descritti iniziano con la crescita delle cellule nei supporti liquidi e la raccolta in forma singola di cellule. Tuttavia, l’analisi dei biofilm e la corrispondente regolazione genica rappresentano una nuova serie di sfide per generare un protocollo ChIP-seq di successo. In questo protocollo, ChIP-seq viene utilizzato per trovare obiettivi normativi differenziali di CsgD, il S. Regolatore di biofilm master di Typhimurium nei tipi di biofilm e cellule planctoniche. Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare la quantità appropriata di biofilm per ChIP-seq, raccogliere biofilm dalla coltura del fiascheno, normalizzare campioni di biofilm e di controllo a singola cellula, omogeneizzare il biofilm e l’immunoprecipitazioni completi. Questo sarà utile per studiare gli obiettivi normativi nei biofilm batterici e può essere adattato a molte specie.
Questo protocollo delinea una tecnica per eseguire ChIP-seq con Salmonella enterica sierovar biofilm e cellule planctoniche dalla coltura pura, per trovare obiettivi normativi del regolatore di biofilm master, CsgD. Ci aspettiamo informazioni di legame differenziale a causa della bistabilità della CsgD nei due tipi di cellule, con alti livelli negli aggregati dei biofilm e bassi livelli nelle celle planctoniche2,3. Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche ad altri fattori di trascrizione batterica, tipi di cellule o condizioni di crescita. In particolare, questa tecnica può essere adattata ad altri biofilm batterici utilizzando un fattore di conversione determinato sperimentalmente per la CFU per unità di peso delle cellule di biofilm.
ChIP-seq può essere soggetto all’amplificazione di errori tecnici tramite il sequenziamento; tuttavia, la conferma nei passaggi critici può impedire questo27. La specificità primaria degli anticorpi è importante per selezionare solo il fattore di trascrizione bersaglio e il DNA che controlla durante l’immunoprecipitazioni7. In questo esperimento, csgD è stato fuso in un tag 3xFLAG con codifica plasmide alla fine del gene, corrispondente al capo-C di CsgD22. Il plasmide p3xFLAG senza csgD è stato utilizzato come un “controllo” (S. Typhimurium 14028 -csgD – p3xFLAG). Le linee guida ENCODE raccomandano di eseguire immunoblot con anticorpo primario contro la proteina di interesse, e lisa dei ceppi ChIP e ceppi di eliminazione21. È importante assicurarsi che le condizioni di crescita siano coerenti tra le repliche per ridurre la variabilità nell’associazione dei fattori di trascrizione e nei risultati di sequenziamento a valle. Se si fa attenzione a garantire che le dimensioni dell’inoculo e le condizioni di crescita pre-inoculo siano costanti, la crescita dei biofilm nella cultura del fiaschetta è costante4. È importante confermare che tutti i biofilm sono stati separati dopo l’omogeneizzazione, per garantire la parità di accesso dei reagenti, in particolare del paradisi incrociato di formaldeide, a tutte le cellule.
Diverse modifiche possono consentire ai ricercatori di utilizzare questo protocollo per altre proteine che legano il DNA, tipi di cellule, ceppi, condizioni di crescita o attrezzature di laboratorio. Se viene utilizzato per specie che formano biofilm diverse da S. Typhimurium, il fattore di conversione delle unità formanti colonia per unità di peso del biofilm deve essere determinato sperimentalmente raccogliendo diverse quantità di biofilm, omogeneizzando accuratamente il biofilm ed eseguendo diluizioni seriali e il conteggio delle piastre per creare una curva standard, che potrebbe non essere accurata a pesi biofilm più bassi2. Trasferimento di energia Sonicator e resistenza al tipo di cellula possono differire; pertanto, si consiglia un saggio di sonicazione per trovare il numero di esplosioni di sonicazione che produrranno la gamma di dimensioni dei frammenti necessaria per la preparazione della libreria a valle e il sequenziamento11. La frammentazione della cromatina da nuclease micrococcale è un’alternativa alla sonicazione che produce alta risoluzione dei siti di occupazione; tuttavia, questo metodo può introdurre la distorsione della frammentazione7,28. La gamma di dimensioni del DNA può essere modificata a seconda dei kit di preparazione della libreria a valle e delle piattaforme di sequenziamento. Altri metodi di omogeneizzazione possono essere utilizzati al posto del mulino miscelatore. Ad esempio, un omogeneizzatore del tessuto di vetro può essere sostituito, ma può aerosolizzare o rompere in modo incompleto il biofilm. In termini di controlli, il DNA pre-immunoprecipitato può essere normalizzato nell’elaborazione e nell’analisi post-sequenziamento. Un controllo mock-IP con siero anticorpo normale abbinato a specie può essere utilizzato anche come controllo13.
I ricercatori devono considerare le limitazioni a questo metodo quando si considera un esperimento ChIP-seq. Potrebbero essere necessarie modifiche significative per adattarlo ad altri tipi di biofilm. Ad esempio, con Salmonella Typhimurium la sospensione immediata del biofilm in PBS porta alla perdita misurabile di aggregati di biofilm. L’immunoprecipitazioni mirare a bersagli normativi di fattori di trascrizione nei batteri può provocare piccole quantità di DNA, che è una sfida per la purificazione e il rilevamento nelle fasi successive. Bias può essere introdotto durante la tosatura e la manipolazione a valle durante il rilevamento della libreria9. Inoltre, questo metodo non rivela i livelli di espressione in vivo in risposta all’associazione del fattore di trascrizione. I ricercatori che hanno poca esperienza in bioinformatica possono essere sfidati dalla pipeline di analisi. Questo metodo può richiedere molto tempo e denaro; tuttavia, il costo del sequenziamento è spesso inferiore a quello di un microarray e sta diminuendo nel tempo man mano che si continuano a migliorare i miglioramenti tecnologici.
Pochi metodi nella letteratura descrivono ChIP con batteri, e la maggior parte degli esperimenti batterici inizia con una semplice condizione di crescita13,14,15,17,18. La preparazione dei campioni ChIP con singole cellule è semplice e presenta meno sfide rispetto alla preparazione dei campioni ChIP con le aggregazioni di biofilm. Per quanto riguarda ChIP-seq, i metodi precedenti di studio dei circuiti cis-regolatori, tra cui l’evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX), i saggi elettroforici per la mobilità (EMSA), ChIP-chip, la rimozione dei promotori e l’analisi dei reporter sono stati integrati o sostituiti da ChIP-seq29. ChIP-seq sta sostituendo ChIP-chip a causa dell’avanzata delle tecnologie e della disponibilità del sequenziamento. Il sequenziamento profondo fornisce ai ricercatori enormi quantità di dati in grado di identificare i siti con una minore affinità di legame e una risoluzione più elevata della coppia di basi con meno materiale iniziale rispetto a ChIP-chip11,30. L’analisi dei dati ChIP provenienti da organismi con genomi di riferimento di alta qualità è generalmente veloce e specifica. Inoltre, ChIP-seq è un metodo completo per scoprire in silico previsti siti di legame che non possono essere occupati in tutti i tipi di cellule, fase di crescita, o condizioni ambientali31.
In futuro, questo protocollo può essere utilizzato per facilitare la comprensione della patogenesi batterica, in particolare gli organismi che formano biofilm. Un’ampia adozione di questa tecnica e la disponibilità di nuovi set di dati possono portare all’integrazione dei dati per identificare gruppi di proteine che co-localizzano per controllare i processi cellulari nei microrganismi che formano biofilm32. Inoltre, i dati ChIP-seq e RNA-seq possono essere integrati per costruire modelli di sistema normativi33.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) ad AW e attraverso la cattedra Jarislowsky in Biotecnologia. MP è stato sostenuto da una borsa di studio NSERC-CREATE attraverso il programma di formazione integrata in malattie infettive, sicurezza alimentare e politica pubblica (ITraP) presso l’Università di Saskatchewan.
Gli autori ringraziano Dani Dale per le riprese e il montaggio.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |