Kromatin immunopræcipitation kombineret med næste generations sekvensering (ChIP-SEQ) er en metode, der anvendes til at etablere interaktioner mellem transkriptionsfaktorer og de genomiske sekvenser, de kontrollerer. Denne protokol skitserer teknikker til at udføre ChIP-SEQ med bakterielle biofilmer, ved hjælp af Salmonella enterica blev typhimurium bakteriel biofilm som et eksempel.
Kromatin immunopræcipitation efterfulgt af sekventering (ChIP-SEQ) er en teknik, der kan bruges til at opdage de reguleringsmæssige mål for transkriptionsfaktorer, Histon modifikationer og andre DNA-associerede proteiner. ChIP-SEQ data kan også bruges til at finde differentiel binding af transkriptionsfaktorer i forskellige miljøforhold eller celletyper. I første omgang blev ChIP udført gennem hybridisering på et mikroarray (ChIP-chip); Men, ChIP-SEQ er blevet den foretrukne metode gennem teknologiske fremskridt, faldende finansielle barrierer for sekvensering, og massive mængder af høj kvalitet data output. Teknikker til at udføre ChIP-SEQ med bakterielle biofilms, en vigtig kilde til vedvarende og kroniske infektioner, er beskrevet i denne protokol. ChIP-SEQ udføres på salmonella enterica blev typhimurium biofilm og planktoniske celler, der er rettet mod Master biofilm regulator, csgd, for at bestemme differentialbinding i de to celletyper. Her viser vi den passende mængde biofilm til høst, normalisering til en planktonisk kontrolprøve, homogenisering af biofilm for adgang på tværs af linker, og udføre rutinemæssige spån-SEQ trin for at opnå høj kvalitet sekvensering resultater.
Bakterielle biofilmer, strukturelle aggregater af celler indlejret i en egenproduceret matrix, er resistente over for udtørring, antibiotika, og vært immunresponser1. Som sådan, de forårsager vedvarende og kroniske infektioner og præsenterer unikke udfordringer for forskere på grund af deres løsninger på overlevelse og transmission. Salmonella enterica blev typhimurium (S. Typhimurium) har fundet at etablere phenotypisk heterogene populationer af biofilm aggregater, der er resistente over for udtørring og antibiotika, og plankton celler, der udtrykker virulensfaktorer i ren kultur, når de udsættes for miljømæssig stress (28 °C, begrænsende næringsstoffer)2. Disse to celletyper opstår på grund af bistabilt udtryk af Master biofilm regulator, CsgD3. Vi har en hypotese om, at dette kan være en satsning-afdækning strategi for salmonella, hvor planktoniske celler deltager i kortsigtede transmission og biofilm celler er i stand til at fortsætte på lang sigt i miljøet, indtil en mulighed for at inficere en ny vært opstår2,4. Mange af de regulerende elementer, der styrer CSG operon udtryk er velkarakteriseret5. Bortset fra ADRA og CSG operon6er der dog kun få lovbestemte mål for csgd. Identificering af csgd-regulerings netværket vil hjælpe os til bedre at forstå salmonella livscyklussen og den rolle, som biofilm spiller i transmissionen.
Chromatin immunopræcipitation efterfulgt af høj gennemløb sekvensering (ChIP-SEQ) er en kraftfuld in vivo teknik til Genome-dækkende identifikation af protein-DNA-interaktioner og giver oplysninger om reguleringsprocesser, der involverer transkriptionsfaktorer, Histon modifikationer, eller nukleosomer7. Nyere undersøgelser har brugt denne teknik til at vurdere differentiale proteinbinding mellem vækstbetingelser og celletyper8. I kromatin immunopræcipitation (ChIP), DNA-fragmenter med interagerende proteiner er beriget gennem antistof udvælgelse af målproteiner. Celler høstes og DNA-bindende proteiner er tværbundet til DNA in vivo gennem formaldehyd Cross-linker behandling. Celler er lysed, frigive celleindholdet, og kromatin er klippet i ca 200 – 600 BP fragmenter7. DNA fragmenter bundet til målet protein er immunoprecipitated ved hjælp af antistof, og isoleret ved de-crosslinking efterfulgt af protein fordøjelse9. Disse DNA-fragmenter repræsenterer protein bindingssteder, der matches af hybridisering til et mikroarray (chip-chip) eller ved dyb sekvensering og kortlægning til genom-sekvensen10,11. Selv om ChIP-chip eksperimenter giver passende lovgivningsmæssige data, er de begrænset på grund af brugen af dyre sonder, samt hybridisering og array bias12. ChIP-SEQ har et større dynamisk område med øget nukleotidopløsning og dækning, forbedret signal-støj-forhold og færre artefakter i forhold til ChIP-chip7.
ChIP er blevet anvendt til at analysere SFH-og ompr-forordningen i salmonella blev typhimurium13,14, quorum-sensing APHA forordning i Vibrio alginolyticus15, rpos forordning i Escherichia coli16, virulens regulator espr forordning i Mycobacterium tuberkulose17, potentielle diguanylatcyclaser gennem amrz forordning i Pseudomonas aeruginosa18, samt vrasr forordning i Staphylococcus aureus19. De bakterielle ChIP-SEQ eksperimenter, der er blevet beskrevet begynde med voksende celler i flydende medier og høst i enkelt celle form. Analysen af biofilmer og den tilsvarende gen-forordning udgør imidlertid et nyt sæt udfordringer, der skal føre til en vellykket ChIP-SEQ-protokol. I denne protokol anvendes ChIP-SEQ til at finde differentierede regulatoriske mål for CsgD, S. Typhimurium Master biofilm regulator i biofilm og plankton celletyper. Denne protokol beskriver de teknikker, der anvendes til at bestemme de relevante mængder af biofilm til spån-SEQ, høst biofilm fra kolbe kulturen, normalisere biofilm og enkelt celle kontrolprøver, homogeniserer biofilm og komplet immunopræcipitation. Dette vil være nyttigt til at studere de reguleringsmæssige mål i bakterielle biofilmer og kan tilpasses til mange arter.
Denne protokol skitserer en teknik til at udføre ChIP-SEQ med salmonella enterica blev typhimurium biofilm og planktoniske celler fra ren kultur, at finde reguleringsmæssige mål for Master biofilm regulator, csgd. Vi forventer differens binding oplysninger på grund af den bi-stabilitet af csgd i de to celletyper, med høje niveauer i biofilm aggregater og lave niveauer i planktoniske celler2,3. Men, denne teknik kan også anvendes til andre bakterielle transkriptionsfaktorer, celletyper, eller vækstbetingelser. Denne teknik kan især tilpasses andre bakterielle biofilmer ved hjælp af en eksperimentelt bestemt omregningsfaktor for CFU pr. vægtenhed af biofilm celler.
ChIP-SEQ kan være tilbøjelige til at forstærke tekniske fejl gennem sekvensering; Men, bekræftelse på kritiske trin kan forhindre denne27. Primær antistof specificitet er vigtig for kun at udvælge måltranskriptionsfaktoren og den DNA, den kontrollerer under immunopræcipitation7. I dette eksperiment blev csgd smeltet til et plasmid-kodet 3xFLAG-tag ved den 3 ‘ ende af genet, svarende til C-endestation af csgd22. P3xFLAG plasmid uden csgD blev anvendt som en “kontrol” (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). Encode retningslinjer anbefaler at udføre immunoblots med primære antistof mod det protein af interesse, og lysater af ChIP stammer og sletning stammer21. Det er vigtigt at sikre, at vækstbetingelserne er konsistente på tværs af replikater for at reducere variabiliteten i transkriptionsfaktor binding og downstream-sekvensering af resultater. Hvis man er omhyggelig med at sikre, at inokulum størrelser og præ-inokulum vækstbetingelser er konsistente, er biofilm vækst i kolbe kulturen konsistent4. Det er vigtigt at bekræfte, at alle biofilm er brudt ud efter homogenisering, for at sikre lige adgang for reagenser, især formaldehyd Cross-linker, til alle celler.
Flere modifikationer kan gøre det muligt for forskerne at bruge denne protokol til andre DNA-bindende proteiner, celletyper, stammer, vækstbetingelser eller laboratorieudstyr. Anvendes til andre biofilm-dannende arter end S. Typhimurium, omregningsfaktoren for kolonidannende enheder pr. enhed vægt af biofilm skal bestemmes eksperimentelt ved høst forskellige mængder af biofilm, homogenisering af biofilm grundigt, og udfører serielle fortyndinger og plade tælling at skabe en standardkurve, som ikke kan være nøjagtige ved lavere biofilm vægte2. Sonicator energioverførsel og celletype resistens kan afvige; Derfor anbefales en sonikering analyse for at finde antallet af sonikering brister, der vil producere det fragment størrelsesinterval, der kræves til downstream-bibliotekets forberedelse og sekvensering11. Kromatin fragmentering af micrococcal nuclease er et alternativ til sonikering, der producerer høj opløsning af belægnings steder; Men, denne metode kan indføre fragmentering bias7,28. DNA-størrelsesintervallet kan ændres afhængigt af downstream-bibliotekets forberedelses kits og sekventering platforme. Andre metoder til homogenisering kan anvendes i stedet for Blanderen mølle. For eksempel kan en glasvæv homogenisator erstattes, men det kan aerosolize eller ufuldstændigt nedbryde biofilm. Med hensyn til kontrol, præ-immunoprecipitate DNA kan normaliseres i post-Sequencing behandling og analyse. En mock-IP kontrol med Arts-matchede normale antistof serum kan bruges som en kontrol samt13.
Forskerne skal overveje begrænsningerne i denne metode, når de betragter et ChIP-SEQ-eksperiment. Det kan være nødvendigt at foretage væsentlige ændringer for at tilpasse det til andre biofilm-typer. For eksempel, med salmonella typhimurium øjeblikkelig opblanding af biofilm i PBS fører til målbare tab af biofilm aggregater. Immunopræcipitation rettet mod regulatoriske mål for transkriptionsfaktorer i bakterier kan resultere i meget små mængder af DNA, hvilket er en udfordring for rensning og detektion på senere trin. Bias kan indføres under klipning og nedstrøms manipulation under biblioteks detektering9. Desuden afslører denne metode ikke in vivo-ekspressionsniveauer som reaktion på transkriptionsfaktor binding. Forskere, der har ringe erfaring inden for Bioinformatik, kan blive udfordret af analyse rørledningen. Denne metode kan være tidskrævende og dyr; men omkostningerne ved sekvensering er ofte lavere end et mikroarray og er faldende over tid, da teknologiske forbedringer fortsat gøres.
Få metoder i litteraturen beskrive ChIP med bakterier, og de fleste bakterielle eksperimenter begynder med en simpel vækst betingelse13,14,15,17,18. Spån prøveforberedelse med enkeltceller er ligetil og præsenterer færre udfordringer end spån prøveforberedelse med biofilm aggregater. Hvad angår ChIP-SEQ, er tidligere metoder til undersøgelse af CIS-regulatoriske kredsløb, herunder systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX), elektroforetiske mobilitets Skift assays (EMSA), chip-chip, promotor-sletning og reporter-analyse blevet suppleret eller erstattet af chip-SEQ29. ChIP-SEQ erstatter ChIP-chip på grund af fremme af teknologier og tilgængelighed af sekvensering. Deep sekvensering giver forskerne massive mængder data, der kan identificere websites med lavere bindingsaffinitet og højere base pair opløsning med mindre udgangsmateriale end chip-chip11,30. Analyse af ChIP data fra organismer med reference genomer af høj kvalitet er generelt hurtig og specifik. Desuden er ChIP-SEQ en grundig metode til at opdage i silico forudsagte bindingssteder, der måske ikke er besat i alle celletyper, vækstfase, eller miljømæssige forhold31.
I fremtiden kan denne protokol bruges til at lette forståelsen af bakteriel patogenese, især biofilm-dannende organismer. Bred anvendelse af denne teknik og tilgængeligheden af nye datasæt kan føre til dataintegration for at identificere grupper af proteiner, der samlokaliserer for at kontrollere cellulære processer i biofilm-dannende mikroorganismer32. Desuden kan data fra ChIP-SEQ og RNA-SEQ integreres for at opbygge reguleringssystem modeller33.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) til AW og gennem Jarislowsky-stolen inden for bioteknologi. MP blev støttet af en NSERC-skabe stipendium gennem det integrerede uddannelses program i smitsomme sygdomme, fødevaresikkerhed og offentlig politik (ITraP) på University of Saskatchewan.
Forfatterne vil gerne takke Dani dale for at filme og redigere.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |