L’immunoprécipitation de chromatine couplée au séquençage de prochaine génération (ChIP-seq) est une méthode employée pour établir des interactions entre des facteurs de transcription et les séquences génomiques qu’ils contrôlent. Ce protocole décrit les techniques d’exécution du ChIP-seq avec des biofilms bactériens, en utilisant Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bactérien à titre d’exemple.
L’immunoprécipitation de chromatine suivie du séquençage (ChIP-seq) est une technique qui peut être employée pour découvrir les cibles réglementaires des facteurs de transcription, des modifications d’histone, et d’autres protéines ADN-associées. Les données ChIP-seq peuvent également être utilisées pour trouver une liaison différentielle des facteurs de transcription dans différentes conditions environnementales ou types de cellules. Initialement, ChIP a été effectué par hybridation sur un microarray (ChIP-puce); cependant, ChIP-seq est devenu la méthode préférée grâce aux progrès technologiques, à la diminution des obstacles financiers au séquençage et à des quantités massives de données de haute qualité. Les techniques d’exécution de ChIP-seq avec des biofilms bactériens, une source majeure d’infections persistantes et chroniques, sont décrites dans ce protocole. ChIP-seq est réalisé sur Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm et cellules planctoniques, ciblant le régulateur maître de biofilm, CsgD, pour déterminer la liaison différentielle dans les deux types de cellules. Ici, nous démontrons la quantité appropriée de biofilm à récolter, normalisant à un échantillon de commande planctonique, homogénéisant le biofilm pour l’accès de cross-linker, et exécutant des étapes courantes de ChIP-seq pour obtenir des résultats de séquençage de haute qualité.
Les biofilms bactériens, agrégats structurels de cellules incorporées dans une matrice autoproduite, sont résistants à la dessiccation, aux antibiotiques et aux réponses immunitaires de l’hôte1. En tant que tels, ils causent des infections persistantes et chroniques et présentent des défis uniques aux chercheurs en raison de leurs solutions à la survie et à la transmission. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) a été trouvé pour établir des populations phénotypiquement hétérogènes d’agrégats de biofilms qui sont résistants à la dessiccation et aux antibiotiques, et les cellules planctoniques qui expriment des facteurs de virulence dans la culture pure lorsqu’ils sont exposés au stress environnemental (28 oC, limitant les nutriments)2. Ces deux types de cellules surviennent en raison de l’expression bistable du régulateur maître de biofilm, CsgD3. Nous avons émis l’hypothèse qu’il pourrait s’agit d’une stratégie de couverture de pari pour Salmonella, où les cellules planctoniques participent à la transmission à court terme et les cellules biofilm sont en mesure de persister à long terme dans l’environnement jusqu’à ce qu’une occasion d’infecter un nouvel hôte se pose2,4. Bon nombre des éléments réglementaires qui contrôlent l’expression de l’opéron csg sont bien caractérisés5. Cependant, en dehors de l’adrA et de la csg operon6, peu d’objectifs réglementaires de csgD sont connus. L’identification du réseau de réglementation csgD nous aiderait à mieux comprendre le cycle de vie de Salmonella et le rôle que jouent les biofilms dans la transmission.
L’immunoprécipitation de chromatine suivie du séquençage à haut débit (ChIP-seq) est une technique in vivo puissante pour l’identification à l’échelle du génome des interactions protéine-ADN et fournit des informations sur les processus réglementaires impliquant des facteurs de transcription, des modifications d’histone, ou des nucléosomes7. De nouvelles études ont utilisé cette technique pour évaluer la liaison différentielle des protéines entre les conditions de croissance et les types de cellules8. Dans l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP), les fragments d’ADN avec les protéines interagissant sont enrichis par la sélection d’anticorps des protéines cibles. Les cellules sont récoltées et les protéines liant l’ADN sont reliées à l’ADN in vivo par le traitement du liaison croisée du formaldéhyde. Les cellules sont lysées, libérant le contenu de la cellule, et la chromatine est cisaison dans environ 200 à 600 fragments de bp7. Les fragments d’ADN liés à la protéine cible sont immunoprécipités à l’aide d’anticorps, et isolés par dé-croisement suivi d’une digestion protéique9. Ces fragments d’ADN représentent des sites de liaison protéique s’adéquation avec l’hybridation à un microréseau (ChIP-chip) ou par le séquençage profond et la cartographie de la séquence génomique10,11. Bien que les expériences de puces ChIP produisent des données réglementaires adéquates, elles sont limitées en raison de l’utilisation de sondes coûteuses, ainsi que de l’hybridation et du biais de tableau12. ChIP-seq a une plus grande plage dynamique avec une résolution et une couverture nucléotides accrues, un rapport signal-bruit amélioré et moins d’artefacts par rapport à La puce ChIP7.
ChIP a été utilisé pour analyser la réglementation Sfh et OmpR dans Salmonella serovar Typhimurium13,14, quorum-détection AphA règlement dans Vibrio alginolyticus15, réglementation RpoS à Escherichi a coli16, virulence régulateur EspR réglementation dans Mycobacterium tuberculosis17, cyclases diguanylate potentiel par la réglementation AmrZ dans Pseudomonas aeruginosa18, ainsi que VraSR règlement dans Staphylococcus aureus19. Les expériences bactériennes ChIP-seq qui ont été décrites commencent par la croissance des cellules dans les médias liquides et la récolte sous forme de cellules individuelles. Cependant, l’analyse des biofilms et la régulation génétique correspondante représentent un nouvel ensemble de défis pour générer un protocole ChIP-seq réussi. Dans ce protocole, ChIP-seq est utilisé pour trouver des cibles réglementaires différentielles de CsgD, le S. Régulateur de biofilm maître de Typhimurium dans le biofilm et les types de cellules planctoniques. Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les quantités appropriées de biofilm pour ChIP-seq, récolter le biofilm de la culture des flacons, normaliser les échantillons de biofilm et de contrôle cellulaire unique, homogénéiser le biofilm et l’immunoprécipitation complète. Cela sera utile pour l’étude des cibles réglementaires dans les biofilms bactériens et peut être adapté pour de nombreuses espèces.
Ce protocole décrit une technique pour effectuer ChIP-seq avec Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm et cellules planctoniques de la culture pure, pour trouver des cibles réglementaires du régulateur maître biofilm, CsgD. Nous nous attendons à des informations de liaison différentielles en raison de la bi-stabilité de csgD dans les deux types de cellules, avec des niveaux élevés dans les agrégats de biofilms et de faibles niveaux dans les cellules planctoniques2,3. Cependant, cette technique peut également être appliquée à d’autres facteurs de transcription bactérienne, types de cellules, ou des conditions de croissance. En particulier, cette technique peut être adaptée à d’autres biofilms bactériens à l’aide d’un facteur de conversion déterminé expérimentalement pour le poids cFU par unité de cellules biofilm.
ChIP-seq peut être sujette à l’amplification de l’erreur technique par le séquençage ; cependant, la confirmation à des étapes critiques peut empêcher ce27. La spécificité primaire des anticorps est importante pour sélectionner uniquement le facteur de transcription cible et l’ADN qu’il contrôle pendant l’immunoprécipitation7. Dans cette expérience, csgD a été fusionné à un plasmide-encodé 3xFLAG tag à l’extrémité 3′ du gène, correspondant au C-terminus de CsgD22. Le plasmide p3xFLAG sans csgD a été utilisé comme un «contrôle» (S. Typhimurium 14028 csgD et p3xFLAG). Les lignes directrices enCODE recommandent d’effectuer des immunoblots avec des anticorps primaires contre la protéine d’intérêt, et des lysates des souches chIP et souches de suppression21. Il est important de s’assurer que les conditions de croissance sont uniformes entre les répliques afin de réduire la variabilité des résultats de liaison des facteurs de transcription et de séquençage en aval. Si l’on prend soin de s’assurer que les tailles d’inoculum et les conditions de croissance pré-inoculum sont cohérentes, la croissance du biofilm dans la culture des flacons est cohérente4. Il est important de confirmer que tous les biofilms ont été brisés après l’homogénéisation, afin d’assurer l’égalité d’accès des réactifs, en particulier le liaison croisée de formaldéhyde, à toutes les cellules.
Plusieurs modifications peuvent permettre aux chercheurs d’utiliser ce protocole pour d’autres protéines liant l’ADN, les types de cellules, les souches, les conditions de croissance ou l’équipement de laboratoire. S’il est utilisé pour des espèces de biofilms autres que S. Le typhimurium, le facteur de conversion des unités de formation de colonies par unité de poids du biofilm doit être déterminé expérimentalement en récoltant différentes quantités de biofilm, en homogénéisant le biofilm à fond, et en effectuant des dilutions en série et le comptage des plaques pour créer une courbe standard, qui peut ne pas être exacte à des poids biofilm inférieurs2. Le transfert d’énergie sonicator et la résistance de type cellulaire peuvent différer ; par conséquent, un essai de sonication est recommandé pour trouver le nombre d’éclats de sonication qui produiront la gamme de taille de fragment requise pour la préparation et le séquençage de bibliothèque en aval11. La fragmentation de chromatine par nucléase micrococcique est une alternative à la sonication qui produit la haute résolution des emplacements d’occupation ; cependant, cette méthode peut introduire le biais de fragmentation7,28. La plage de taille de l’ADN peut être modifiée en fonction des trousses de préparation des bibliothèques en aval et des plates-formes de séquençage. D’autres méthodes d’homogénéisation peuvent être utilisées à la place de l’usine de mélangeur. Par exemple, un homogénéisateur de tissu en verre peut être substitué, mais il peut aérosol ou briser incomplètement le biofilm. En termes de contrôles, l’ADN pré-immunoprécipité peut être normalisé dans le traitement et l’analyse post-séquençage. Un contrôle de la propriété intellectuelle simulé e avec un sérum d’anticorps normal assorti à l’espèce peut être utilisé comme un contrôle ainsi13.
Les chercheurs doivent tenir compte des limites de cette méthode lorsqu’ils envisagent une expérience ChIP-seq. Des modifications importantes peuvent être nécessaires pour l’adapter à d’autres types de biofilms. Par exemple, avec Salmonella Typhimurium, la résuspension immédiate du biofilm dans le PBS entraîne une perte mesurable d’agrégats de biofilms. L’immunoprécipitation ciblant les cibles réglementaires des facteurs de transcription dans les bactéries peut entraîner de très petites quantités d’ADN, ce qui est un défi pour la purification et la détection à des étapes ultérieures. Les biais peuvent être introduits lors de la tonte et de la manipulation en aval lors de la détection de la bibliothèque9. En outre, cette méthode ne révèle pas les niveaux d’expression in vivo en réponse à la liaison facteur de transcription. Les chercheurs qui ont peu d’expérience en bioinformatique peuvent être mis au défi par le pipeline d’analyse. Cette méthode peut être longue et coûteuse; cependant, le coût du séquençage est souvent inférieur à un microréseau et diminue avec le temps à mesure que des améliorations technologiques continuent d’être apportées.
Peu de méthodes dans la littérature décrivent ChIP avec des bactéries, et la plupart des expériences bactériennes commencent par une condition de croissance simple13,14,15,17,18. La préparation de l’échantillon ChIP avec des cellules individuelles est simple et présente moins de défis que la préparation de l’échantillon ChIP avec des agrégats de biofilms. En ce qui concerne Le ChIP-seq, les méthodes précédentes d’étude des circuits cis-régulateurs, y compris l’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX), les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), la suppression de la puce ChIP, la suppression des promoteurs et l’analyse des journalistes ont été complétées ou remplacées par ChIP-seq29. ChIP-seq remplace la puce ChIP en raison de l’avancement des technologies et de la disponibilité du séquençage. Le séquençage profond fournit aux chercheurs des quantités massives de données qui peuvent identifier des sites avec une affinité de liaison plus faible et une résolution de paire de base plus élevée avec moins de matériel de départ que ChIP-chip11,30. L’analyse des données ChIP provenant d’organismes dont les génomes de référence de haute qualité est généralement rapide et spécifique. En outre, ChIP-seq est une méthode approfondie pour découvrir dans les sites de liaison prévus silico qui peuvent ne pas être occupés dans tous les types de cellules, la phase de croissance, ou les conditions environnementales31.
À l’avenir, ce protocole pourra être utilisé pour faciliter la compréhension de la pathogénie bactérienne, en particulier des organismes qui forment des biofilms. L’adoption générale de cette technique et la disponibilité de nouveaux ensembles de données peuvent mener à l’intégration des données afin d’identifier les groupes de protéines qui colocalisent pour contrôler les processus cellulaires dans les micro-organismes de formation de biofilms32. En outre, les données ChIP-seq et RNA-seq peuvent être intégrées pour construire des modèles de systèmes de réglementation33.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été appuyée par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) (#2017-05737) à AW et par l’entremise de la Chaire Jarislowsky en biotechnologie. Le député a reçu l’appui d’une bourse du CRSN-CREATE dans le cadre du Programme intégré de formation sur les maladies infectieuses, la salubrité des aliments et les politiques publiques (ITraP) de l’Université de la Saskatchewan.
Les auteurs souhaitent remercier Dani Dale pour le tournage et le montage.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |