כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף הדור הבא (שבב-seq) היא שיטה המשמשת ליצירת אינטראקציות בין גורמי שעתוק ואת רצפי גנומי הם שולטים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות עבור ביצוע שבב-seq עם ביומאמים חיידקיים, באמצעות סלמונלה בידור החיידק Typhimurium בקטריות כדוגמה.
כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף (שבב-seq) היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לגלות את המטרות הרגולטוריות של גורמי שעתוק, שינויים היסטון, ו-DNA אחרים הקשורים חלבונים. נתוני שבב-seq יכולים לשמש גם כדי למצוא כריכה דיפרנציאלית של שעתוק גורמים בתנאים סביבתיים שונים או סוגי תאים. בתחילה, שבב בוצע באמצעות היברידיזציה על מיקרוarray (שבב צ’יפ); עם זאת, שבב-seq הפך את השיטה המועדפת באמצעות פיתוחים טכנולוגיים, הפחתת מחסומים פיננסיים לרצף, וכמויות מסיבית של פלט נתונים באיכות גבוהה. טכניקות של ביצוע שבב-seq עם ביויואמים חיידקיים, מקור מרכזי של זיהומים מתמידים וכרוניים, מתוארים בפרוטוקול זה. שבב-seq מבוצע על סלמונלה בידור serovar ביוהיריום ותאי פלנקטון, מיקוד הרגולטור הראשי ביוilm, csgd, כדי לקבוע את הכריכה הדיפרנציאלית בשני סוגי התא. כאן, אנו מדגימים את הכמות המתאימה של הביו-היקף לקציר, נורמליזציה למדגם בקרת פלנקטון, הומוגניזציה עבור גישה חוצת-מקשר, וביצוע צעדים שגרתיים של שבב-seq כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה ברצף.
ביואמים חיידקיים, אגרגטים מבניים של תאים המוטבעים במטריצה מיוצרת עצמית, עמידים בפני התייבשות, אנטיביוטיקה ותגובות החיסון המארחות1. ככאלה, הם גורמים לזיהומים מתמידים וכרוניים ומציגים אתגרים ייחודיים לחוקרים בשל הפתרונות שלהם להישרדות ושידור. סלמונלה בידור שירומויום (S. Typhimurium) נמצא להקים אוכלוסיות הטרוגנית בדרך כלל של אגרגטים ביוארגור העמידים בפני התייבשות ואנטיביוטיקה, ותאי פלנקטון אשר מבטאים גורמים התקפה אלימה בתרבות טהורה כאשר נחשפים לחץ סביבתי (28 ° צ’, הגבלת חומרים מזינים)2. שני סוגי תאים אלה נובעים בשל ביטוי bistable של הרגולטור הראשי של הביוilm, CsgD3. יש לנו שיערו כי זה יכול להיות אסטרטגיה מגידור ההימור עבור סלמונלה, כאשר התאים פלנקטון להשתתף שידור לטווח קצר ותאי ביוilm מסוגלים להתמיד לטווח ארוך בסביבה עד הזדמנות להדביק מארח חדש נובע2,4. רבים מרכיבי הרגולציה השולטים בביטוי csg אופרון מאופיינים היטב5. עם זאת, מלבד adra ו csg אופרון6, מטרות רגולטוריות מעטים של csg ידועים. זיהוי הרשת התקינה CsgD יעזור לנו להבין טוב יותר את מחזור החיים של סלמונלה ואת התפקיד כי ביוילאמים לשחק בשידור.
כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף התפוקה הגבוהה (שבב-seq) היא חזקה בטכניקה vivo עבור זיהוי הגנום-כולל של אינטראקציות חלבון-DNA ומספק מידע על תהליכים הרגולציה מעורבים גורמי שעתוק, שינויים היסטון, או נוקלאוטיזומים7. מחקרים חדשים יותר השתמשו בטכניקה זו כדי להעריך את כריכת החלבון הדיפרנציאלי בין תנאי גדילה וסוגי תאים8. ב כרומטין immunoprecipitation (שבב), שברי דנ א עם חלבונים אינטראקציה מועשר באמצעות נוגדנים מבחר של חלבונים היעד. תאים הם קוצרים ו-DNA מחייב חלבונים הם מקושרים ל-DNA ב vivo דרך פורמלדהיד חוצה מקשר הטיפול. תאים הם מוקפצים, שחרור תוכן התאים, ו כרומטין הוא השזרמו כ 200 – 600 שברי bp7. שברי דנ א כרוך חלבון היעד הם immunoprecipitated באמצעות נוגדן, ומבודד על ידי דה-crosslinking קישור ואחריו עיכול החלבון9. שברי ה-DNA הללו מייצגים אתרי כריכת חלבון בהתאמה הכלאה למיקרומערך (שבב שבב) או על ידי רצף עמוק ומיפוי לרצף הגנום10,11. למרות הניסויים שבב צ’יפ להניב נתונים רגולציה נאותה, הם מוגבלים בשל השימוש בבדיקות יקרות, כמו גם היברידיזציה הטיה מערך12. שבב-seq יש טווח דינמי גדול יותר עם רזולוציה מוגברת נוקלאוטיד וכיסוי, יחס אות לרעש משופר, ופחות פריטים בהשוואה שבב שבב7.
שבב שימש לניתוח ה-sfh ו-ompr ב סלמונלה serovar typhimurium13,14, ויסות החישה של apha ב- vibrio alginolyפטיקוס15, תקנה rpos בתוך eschia coli16, התקפה אלימה הרגולטור ברגולציה ב- פטרת השחפתdiguanylate, פוטנציאל של בקרת amrz באמצעות התקנה של הפסאודומונס aeruginosa18, כמוגם vrasr . בסדר. הניסויים החיידקיים שבב-seq שתוארו להתחיל עם הגדלת תאים במדיה נוזלי וקצירת בצורת תא בודד. עם זאת, ניתוח של ביואילאמים ותקנות הגנים המתאימים מייצג קבוצה חדשה של אתגרים כדי ליצור פרוטוקול שבב-seq מוצלח. בפרוטוקול זה, שבב-seq משמש כדי למצוא מטרות הרגולציה הדיפרנציאלי של CsgD, S. הרגולטור הראשי של היומוופריום. בתוך ביוilm ובסוגי תאי הפלאנטוניק פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות כדי לקבוע את הכמויות המתאימות של הביו-משתמשים עבור שבב-seq, ביוכי הקציר מתרבות הבקבוקון, לנרמל את השימוש בדגימות ובקרת תאים בודדים, המגון ביוilm והשלמת immunoprecipitation. זה יהיה שימושי עבור לימוד מטרות הרגולציה של ביויואמים חיידקיים ניתן להתאים עבור מינים רבים.
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לביצוע שבב-seq עם סלמונלה enterica serovar ביויויום ותאי פלנקטון מהתרבות הטהורה, כדי למצוא מטרות רגולטוריות של הרגולטור הראשי של ביוilm, csgd. אנו מצפים למידע כריכה משלים בשל היציבות הדו של csgd בשני סוגי התא, עם רמות גבוהות באגרגטים של ביוilm ורמות נמוכות בתאי פלנקטון2,3. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות גם להחיל על גורמים אחרים בקטריות שעתוק, סוגי תאים, או תנאי גדילה. בפרט, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לביואמים בקטריאליים אחרים באמצעות פקטור המרה קבוע של CFU למשקל יחידה של תאי ביויוונים.
שבב-seq יכול להיות נוטה הגברה של שגיאה טכנית באמצעות רצף; עם זאת, אישור בשלבים קריטיים יכול למנוע27זה. ספציפיות נוגדן עיקרי חשוב לבחור רק את מקדם שעתוק היעד ואת ה-DNA הוא שולט במהלך immunoprecipitation7. בניסוי זה, Csgd היה התמזגו תג פלאסיים מקודד 3xFLAG בקצה 3 ‘ של הגן, המתאים C-הטרמינוס של csgd22. P3xFLAG פלמיד ללא csgD שימש “שליטה” (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). הנחיות הצפנה ממליצים ביצוע החומרים האימונוts עם הנוגדן העיקרי נגד חלבון הריבית, ו lysates של זני שבב מחיקה זנים21. חשוב להבטיח שתנאי הגדילה יהיו עקביים באמצעות שכפול כדי להפחית את השונות בכריכה של גורם שעתוק ובתוצאות רצף הזרם. אם מישהו מקפיד להבטיח את הגודל ותנאי הגדילה הטרום-מוגדרים עקביים, הגידול הביואמיל בתרבות הבקבוקון הוא עקבי4. חשוב לאשר כי כל הביו, התפרקה לאחר לקות המגון, כדי להבטיח גישה שווה של ריאגנטים, במיוחד פורמלדהיד צולבות מקשר, לכל התאים.
מספר שינויים עשויים לאפשר לחוקרים להשתמש בפרוטוקול זה עבור החלבונים אחרים המחייבים DNA, סוגי תאים, זנים, תנאי גדילה, או ציוד מעבדה. אם הוא משמש עבור מינים היוצרים של ביוונים מאשר S. Typhimurium, גורם ההמרה של המושבה להרכיב יחידות למשקל יחידה של ביוilm צריך להיות באופן קבוע הניסויים על ידי איסוף כמויות שונות של ביוilm, הומוגניזציה באופן יסודי, וביצוע מדלל סדרתי וספירת צלחות כדי ליצור עיקול רגיל, אשר עשוי לא להיות מדויק על משקולות נמוכה יותר משקל2 Sonicator העברת אנרגיה תא התנגדות סוג עשוי להיות שונה; לפיכך, sonication מומלץ למצוא את מספר ההתפרצויות הsonication שיפיקו את טווח גודל הקטע הנדרש עבור הכנת הספרייה ורצף11של המטה. פיצול כרומטין על ידי מmicrococcal נוקלאז היא חלופה sonication המייצרת ברזולוציה גבוהה של אתרי תפוסת; עם זאת, שיטה זו עשויה להציג פיצולהטיה 7,28. את טווח גודל ה-DNA ניתן לשנות בהתאם ערכות הכנה ספריית במטה ופלטפורמות רצף. ניתן להשתמש בשיטות אחרות של הומוגון במקום טחנת המיקסר. לדוגמה, הומוגניצר רקמת זכוכית עשוי להיות מוחלף, אבל זה עשוי ניקה או באופן מוחלט לשבור את הבייוilm. במונחים של שולטת, pre-immunoprecipitate DNA ניתן לנרמל בעיבוד לאחר רצפי וניתוח. בקרת מדמה-IP עם מינים התואמים סרום רגיל יכול לשמש כפקד כמו גם13.
החוקרים חייבים לשקול את המגבלות על שיטה זו כאשר בהתחשב ניסוי שבב-seq. ייתכן שיהיה צורך בשינויים משמעותיים כדי להתאים אותו לסוגי ביוונים אחרים. לדוגמה, עם סלמונלה typhimurium מיידית השעיית מחדש של ביוilm ב-PBS מוביל לאובדן מדיד של אגרגטים ביוilm. Immunoprecipitation פילוח מטרות רגולטוריות של גורמי שעתוק בחיידקים עלול לגרום כמויות קטנות מאוד של דנ א, אשר הוא אתגר לטיהור ואיתור בשלבים מאוחרים יותר. הטיה ניתן להציג במהלך הטיה מניפולציה במורד במהלך זיהוי הספרייה9. בנוסף, שיטה זו אינה חושפת ברמות ביטויים vivo בתגובה לכריכה של גורם שעתוק. חוקרים בעלי ניסיון מועט בביואינפורמטיקה עשויים להיות מאותגרים על-ידי צינור הניתוח. שיטה זו עשויה להיות אינטנסיבית ויקרה בזמן; עם זאת, עלות הרצף נמוכה לעתים קרובות ממיקרו-מערך והיא יורדת לאורך זמן כאשר השיפורים הטכנולוגיים ממשיכים להתבצע.
כמה שיטות בספרות לתאר שבב עם חיידקים, והניסויים החיידקיים ביותר להתחיל במצב גדילה פשוטה13,14,15,17,18. ההכנה לדגימת שבב עם תאים בודדים היא פשוטה ומציגה פחות אתגרים מאשר הכנה לדגימת שבב עם אגרגטים של ביוilm. באשר שבב-seq, השיטות הקודמות של לימוד המעגלים cis-רגולציה, כולל האבולוציה שיטתית של ליגניות על ידי העשרה מעריכית (SELEX), הניידות electrophoretic משמרת (EMSA), שבב שבב, מחיקה מקדם וניתוח עיתונאי השלימה או הוחלף על ידי שבב-seq29. שבב-seq הוא החלפת שבב שבב בשל התקדמות טכנולוגיות וזמינות של רצף. רצף עמוק מספק לחוקרים כמויות אדירות של נתונים שיכולים לזהות אתרים בעלי זיקה מחייבת נמוכה יותר ורזולוציה של זוג בסיסי גבוה יותר עם חומר התחלתי פחות מאשר שבב-שבב11,30. ניתוח של נתוני שבב מתוך אורגניזמים עם התייחסות באיכות גבוהה גנום הוא בדרך כלל מהיר וספציפי. בנוסף, ChIP-seq היא שיטה יסודית לגילוי באתרי הכריכה החזויים שאינם כבושים בכל סוגי התאים, בשלב הגדילה, או בתנאי הסביבה31.
בעתיד, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקל על הבנה של פתוגנזה בקטריאלי, במיוחד אורגניזמים היוצרים. אימוץ נרחב של טכניקה זו וזמינות של מערכות נתונים חדשות יכולות להוביל לאינטגרציית נתונים כדי לזהות קבוצות של חלבונים הניתנים לשימוש בשיתוף פעולה לשליטה בתהליכים סלולריים במיקרואורגניזמים היוצרים מיקרואורגניזמים32. בנוסף, שבב-seq ו-RNA-seq נתונים ניתן לשלב כדי לבנות מערכת הרגולציה דגמי33.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היה נתמך על ידי מענק מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה (NSERC) (#2017-05737) ל-AW ודרך כיסא Jarislowsky בביוטכנולוגיה. MP היה נתמך על ידי מלגה NSERC-ליצור באמצעות תוכנית הדרכה משולבת מחלות זיהומיות, בטיחות מזון ומדיניות ציבורית (ITraP) באוניברסיטת ססקצ’ואן.
המחברים רוצים להודות לדני דייל על הצילומים והעריכה.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |