차세대 염기서열 분석(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 전사 인자와 그들이 제어하는 게놈 서열 사이의 상호 작용을 확립하는 데 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 세균성 생물막으로 ChIP-seq를 수행하기 위한 기술을 간략하게 설명하고, 살모넬라 테레카 혈청바르 티피무리움 세균 생물막을 예로 사용한다.
순화질 면역 침전은 시퀀싱(ChIP-seq)에 이어 전사 인자, 히스톤 변형 및 기타 DNA 관련 단백질의 조절 표적을 발견하는데 사용될 수 있는 기술이다. ChIP-seq 데이터는 또한 상이한 환경 조건 또는 세포 유형에서 전사 인자의 차동 결합을 찾는데 사용될 수 있다. 처음에, ChIP는 마이크로어레이(ChIP-chip)에 대한 혼성화를 통해 수행되었다; 그러나 ChIP-seq는 기술 발전, 시퀀싱에 대한 재정적 장벽 감소, 대량의 고품질 데이터 출력을 통해 선호되는 방법이 되었습니다. 지속적이고 만성적인 감염의 주요 원인인 세균성 생물막으로 ChIP-seq를 수행하는 기술이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. ChIP-seq는 살모넬라 테네리카 혈청염 혈류, 티피무리움 생물막 및 플랑크토닉 세포상에서 수행되며, 마스터 생물막 조절기인 CsgD를 대상으로 두 세포 유형에서 미분 결합을 결정한다. 여기서, 우리는 수확할 생물막의 적정량을 입증하고, 플랑크토닉 대조군 시료로 정상화하고, 교차 링커 접근을 위한 생물막을 균질화하고, 고품질의 시퀀싱 결과를 얻기 위해 일상적인 ChIP-seq 단계를 수행합니다.
세균성 생물막, 자가 생산 된 매트릭스에 내장 된 세포의 구조적 응집체는 탈수, 항생제 및 숙주 면역반응에내성이 1. 이와 같이, 그(것)들은 지속적이고 만성 감염을 일으키는 원인이 되고 생존과 전송에 그들의 해결책 때문에 연구원에게 유일한 도전을 제출합니다. 살모넬라 엔티카 세로바르 티피무리움(S. 티피무리움)은 환경스트레스(28°C, 제한영양제)에 노출되었을 때 순수 배양에서 독성 인자를 발현하는 생물막 응집체, 및 플랑크토닉 세포의 전형적으로 이질적인 집단을 확립하는 것으로 밝혀졌다2. 이 2개의 세포 모형은 마스터 생물막 레귤레이터, CsgD3의이중 안정한 발현 때문에 생겨났습니다. 우리는 이것이 플랑크토닉 세포가 단기 전염에 참여하고 생물막 세포가 새로운 숙주에게 감염될 기회가 발생할 때까지 환경에서 장기적으로 지속될 수 있는 살모넬라에대한 내기 헤징 전략이 될 수 있다는 가설을 세웠습니다2,4. csg 오페론 발현을 제어하는 많은 조절 요소는5. 그러나, adrA 및 csg 오페론6을제외하고, CsgD의 몇몇 규제 표적은 알려져 있다. CsgD 규제 네트워크를 식별하면 살모넬라 수명 주기와 생물막이 전송에서 하는 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.
고처리량 시퀀싱(ChIP-seq)에 이어 크로마틴 면역 침전은 단백질-DNA 상호작용의 게놈 전반식별을 위한 강력한 생체 내 기술이며 전사 인자, 히스톤 변형 또는 뉴클레오좀7과관련된 규제 과정에 대한 정보를 제공한다. 새로운 연구는 성장 조건과 세포 유형 사이의 차동 단백질 결합을 평가하기 위해이 기술을 사용했다8. 염색질 면역 침전 (ChIP)에서, 상호 작용하는 단백질을 가진 DNA 단편은 표적 단백질의 항체 선택을 통해 풍부합니다. 세포는 수확되고 DNA 결합 단백질은 포름알데히드 가교 처리를 통해 생체 내 DNA에 가교됩니다. 세포는 lysed, 세포 내용물 방출, 및 염색질은 대략 200-600 bp 단편7로전이된다. 표적 단백질에 결합된 DNA 단편은 항체를 사용하여 면역침전되고, 단백질 소화에 이어 디크로스링크에 의해 분리된다9. 이들 DNA 단편은 마이크로어레이(ChIP-chip)에 대한 혼성화또는 게놈서열(10,11)에대한 깊은 시퀀싱 및 매핑에 의해 일치하는 단백질 결합 부위를 나타낸다. ChIP 칩 실험은 적절한 규제 데이터를 산출하지만 고가의 프로브의 사용뿐만 아니라 혼성화 및 어레이 바이어스12로인해 제한됩니다. ChIP-seq는 증가된 뉴클레오티드 분해능 및 커버리지, 개선된 신호 대 잡음 비, 그리고 ChIP 칩7에비해 더 적은 아티팩트를 가진 더 큰 동적 범위를 가지고 있습니다.
ChIP는 살모넬라 혈청바 티피무리움13,14, 비브리오 알기놀리틱스15, 대장균의RpoS 규정에서 Sfh 및 OmpR 조절을 분석하는 데 사용되었습니다. I16, 결핵균에 있는 독성 조절제 EspR 규정17, 슈도모나스 aeruginosa18에 있는 AmrZ 규정을 통해 잠재적인 diguanylate 사이클라제18,뿐만 아니라 VraSR 황색포도상구균의규정19. 기술된 세균성 ChIP-seq 실험은 액체 매체에 있는 세포를 성장하고 단 세포 양식에 있는 수확으로 시작됩니다. 그러나, 생물막 및 상응하는 유전자 조절의 분석은 성공적인 ChIP-seq 프로토콜을 생성하기 위한 새로운 과제세트를 나타낸다. 이 프로토콜에서, ChIP-seq는 CsgD, S의 차등 조절 표적을 찾는데 사용된다. 생물막 및 플랑크토닉 세포 유형에서 티피무리움 마스터 생물막 조절기. 이 프로토콜은 ChIP-seq에 대한 적절한 양의 생물막을 결정하고, 플라스크 배양으로부터 생물막을 수확하고, 생물막 및 단일 세포 제어 샘플을 정상화하고, 생물막을 균질화하고, 완전한 면역 침전을 하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이것은 세균성 생물막에 있는 규정하는 표적을 공부하기 위해 유용할 것이고 많은 종을 위해 적응될 수 있습니다.
이 프로토콜은 순수 배양으로부터 살모넬라 테레리카 세로바르 티피무리움 생물막 및 플랑크토닉 세포와 함께 ChIP-seq를 수행하기 위한 기술을 개략적으로 설명하고, 마스터 생물막 조절기인 CsgD의 규제 대상을 찾아낸다. 우리는 두 가지 세포 유형에서 CsgD의 이중 안정성으로 인한 차동 결합 정보를 기대하며, 생물막 응집체의 높은 수준과 플랑크토닉 세포의 낮은 수준2,3. 그러나, 이 기술은 또한 다른 세균 전사 인자, 세포 유형, 또는 성장 조건에 적용될 수 있다. 특히, 이 기술은 생물막 세포의 단위 중량당 CFU에 대한 실험적으로 결정된 변환 인자를 사용하여 다른 세균 생물막에 적응될 수 있다.
ChIP-seq는 시퀀싱을 통해 기술적 오류를 증폭하는 경향이 있을 수 있습니다. 그러나 중요한 단계에서 확인하면 이27을방지할 수 있습니다. 1차 항체 특이성은 면역침전 동안 대조군 전사 인자 및 DNA만을 선택하는 데 중요하다7. 본 실험에서, csgD는 3′ 유전자의 말단에서 플라스미드 인코딩된 3xFLAG 태그를 융합하였고, CsgD22의C-종단에 대응하였다. csgD가 없는 p3xFLAG 플라스미드는 “대조군”(S)으로사용되었다. 티피무리움 14028 □csgD + p3xFLAG). ENCODE 지침은 관심있는 단백질에 대하여 1 차적인 항체를 가진 면역blots를 능력을 발휘하는 것이 좋습니다, 및 ChIP 긴장 및 삭제 긴장21의용해. 전사 계수 바인딩 및 다운스트림 시퀀싱 결과의 가변성을 줄이기 위해 복제전반에 걸쳐 성장 조건이 일관되도록 하는 것이 중요합니다. 접종 크기 및 사전 접종 성장 조건이 일관되도록 주의하는 경우, 플라스크 배양에서의 생물막 성장은4. 모든 세포에 시약, 특히 포름알데히드 크로스 링커의 동등한 접근을 보장하기 위해 균질화 후 모든 생물막이 분해되었는지 확인하는 것이 중요합니다.
몇몇 수정은 연구원이 그밖 DNA 결합 단백질, 세포 모형, 긴장, 성장 조건, 또는 실험실 장비를 위해 이 프로토콜을 사용하는 가능하게 할 수 있습니다. S 이외의 생물막 형성 종에 사용되는 경우. 티피무리움, 생물막의 단위 중량당 콜로니 형성 단위의 변환 계수는 생물막의 상이한 양을 수확하고, 생물막을 철저히 균질화하고, 표준 곡선을 생성하기 위해 직렬 희석 및 플레이트 카운팅을 수행함으로써 실험적으로 결정되어야 하며, 이는 낮은 생물막 가중치에서 정확하지 않을 수 있다2. 초음파 처리기 에너지 전달 및 세포 유형 저항이 다를 수 있습니다. 따라서 초음파 분석기는 다운스트림 라이브러리 준비 및 시퀀싱(11)에필요한 조각 크기 범위를 생성하는 초음파 파열의 수를 찾는 것이 좋습니다. 마이크로 코칼 뉴클레아제에 의한 크로마틴 단편화는 점유 부위의 고해상도를 생성하는 초음파 처리의 대안입니다. 그러나,이 방법은 조각화 바이어스7,28을도입 할 수있다 . DNA 크기 범위는 다운스트림 라이브러리 준비 키트 및 시퀀싱 플랫폼에 따라 변경될 수 있습니다. 균질화의 다른 방법은 믹서 밀 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유리 조직 균질화제는 대체될 수 있지만, 에어로졸화되거나 불완전하게 생물막을 분해할 수 있다. 통제의 관점에서, 전 면역 침전제 DNA는 사후 염기서열 처리 및 분석에서 정규화될 수 있습니다. 종 일치 정상 항체 혈청을 이용한 모의 IP 대조군도13.
연구원은 ChIP-seq 실험을 고려할 때이 방법에 대한 한계를 고려해야합니다. 다른 생물막 유형에 적응하기 위해 상당한 수정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 살모넬라 티피무리움이 PBS에서 생물막의 즉각적인 재중단을 통해 생물막 응집체의 측정 가능한 손실로 이어집니다. 박테리아에 있는 전사 인자의 규정하는 표적을 표적으로 하는 면역 침전은 DNA의 아주 작은 양이 귀착될 수 있습니다, 이는 나중 단계에서 정화 그리고 검출을 위한 도전입니다. 라이브러리 감지 시 전단 및 다운스트림 조작 중에 바이어스가 도입될 수있습니다 9. 또한, 이 방법은 전사 인자 결합에 반응하여 생체 내 발현 수준을 드러내지 않는다. 생물 정보학에 있는 작은 경험이 있는 연구원은 분석 파이프라인에 의해 도전될 수 있습니다. 이 방법은 시간이 많이 들고 비용이 많이 들 수 있습니다. 그러나 시퀀싱 비용은 마이크로어레이보다 낮은 경우가 많으며 기술 개선이 계속됨에 따라 시간이 지남에 따라 감소하고 있습니다.
문헌에서 몇 가지 방법은 박테리아와 ChIP를 설명하고, 대부분의 세균 실험은 간단한 성장 조건으로 시작13,14,15,17,18. 단일 셀을 사용하여 ChIP 샘플 준비는 간단하며 생물막 응집체를 가진 ChIP 샘플 준비보다 적은 과제를 제시합니다. ChIP-seq에 관해서는, 지수 농축 (SELEX), 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA), ChIP 칩, 프로모터 삭제 및 리포터 분석에 의한 리간드의 체계적인 진화를 포함한 시스 규제 회로를 연구하는 이전 방법은 ChIP-seq29로보완되거나 대체되었습니다. ChIP-seq는 기술의 발전과 시퀀싱의 가용성으로 인해 ChIP 칩을 대체하고 있습니다. 심층 시퀀싱은 연구원에게 ChIP 칩11,30보다적은 시작 재료로 낮은 결합 선호도 및 더 높은 기본 쌍 해상도로 사이트를 식별 할 수있는 방대한 양의 데이터를 제공합니다. 고품질 기준 게놈을 가진 유기체에서 ChIP 데이터의 분석은 일반적으로 빠르고 구체적입니다. 부가적으로, ChIP-seq는 모든 세포 유형, 성장 단계, 또는 환경 조건에서 점유되지 않을 수 있는 실리코 예측 결합 부위에서 발견하기 위한 철저한 방법31이다.
미래에, 이 프로토콜은 세균성 병인, 특히 생물막 형성 유기체의 이해를 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 이 기술의 광범위한 채택 및 새로운 데이터 세트의 가용성은 생물막 형성 미생물(32)에있는 세포 프로세스를 통제하기 위하여 공동 지역화하는 단백질의 단을 확인하기 위하여 데이터 통합으로 이끌어 낼 수 있습니다. 또한, ChIP-seq 및 RNA-seq 데이터는 규제 시스템모델(33)을구축하기 위해 통합될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 자연 과학 및 공학 연구 위원회에서 보조금에 의해 지원 되었다 (NSERC) (#2017-05737) AW와 생명 공학에서 Jarislowsky 의자를 통해. MP는 서스 캐처 원 대학의 전염병, 식품 안전 및 공공 정책 (ITraP)의 통합 교육 프로그램을 통해 NSERC-CREATE 장학금을 지원받았습니다.
저자는 촬영 및 편집 다니 데일에게 감사드립니다.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |