Kromatin immunutfelling forente med neste-generasjon sekvensering (flis-SEQ) er en metoden pleide opprette vekselvirkningen imellom transkripsjon faktorene og det genomisk sekvenser de administrere. Denne protokollen skisserer teknikker for å utføre ChIP-SEQ med bakteriell biofilm, ved hjelp av Salmonella enterica serovar tyfimurium bakteriell biofilm som et eksempel.
Kromatin immunutfelling etterfulgt av sekvensering (ChIP-SEQ) er en teknikk som kan brukes til å oppdage regulatoriske mål av transkripsjon faktorer, histone modifikasjoner, og andre DNA-assosiert proteiner. ChIP-SEQ data kan også brukes til å finne differensial binding av transkripsjon faktorer i ulike miljøforhold eller celletyper. I utgangspunktet ble ChIP utført gjennom hybridisering på en Microarray (ChIP-chip); Imidlertid, ChIP-SEQ er blitt det foretrakk metoden igjennom teknisk fremskritt, avtagende finansiell barriere å sekvensering, og svær beløpene av høy-kvalitet data produksjon. Teknikker for å utføre ChIP-SEQ med bakteriell biofilm, en stor kilde til vedvarende og kroniske infeksjoner, er beskrevet i denne protokollen. ChIP-SEQ utføres på Salmonella enterica serovar tyfimurium biofilm og planktoniske celler, rettet mot Master biofilm regulator, CsgD, å bestemme differensial binding i de to celletyper. Her viser vi riktig mengde biofilm å høste, normalisere til en planktoniske kontroll prøve, homogenisere biofilm for kryss-linker tilgang, og utføre rutine ChIP-SEQ trinn for å få høy kvalitet sekvensering resultater.
Bakteriell biofilm, strukturelle aggregater av celler innebygd i en selv-produsert matrise, er motstandsdyktig mot uttørking, antibiotika, og vert immunresponser1. Som sådan, de forårsaker vedvarende og kroniske infeksjoner og presentere unike utfordringer til forskere på grunn av sine løsninger til overlevelse og overføring. Salmonella enterica serovar Tyfimurium (S. Tyfimurium) har blitt funnet å etablere phenotypically heterogene populasjoner av biofilm aggregater som er resistente mot uttørking og antibiotika, og planktoniske celler som uttrykker virulens faktorer i ren kultur når de utsettes for miljømessige stress (28 ° c, begrensende næringsstoffer)2. Disse to celletyper oppstår på grunn av bistabile uttrykk for Master biofilm regulator, CsgD3. Vi har hypotetisk gjennomsnitt at dette kan være en innsats-sikring strategi for Salmonella, der planktoniske cellene delta i kortsiktige overføring og biofilm celler er i stand til å vedvare langsiktig i miljøet før en mulighet til å infisere en ny vert oppstår2,4. Mange av de regulatoriske elementer som styrer CSG operon Expression er godt karakterisert5. Men bortsett fra adrA og CSG operon6, få regulatoriske mål av CsgD er kjent. Identifisering av CsgD regulatoriske nettverk vil hjelpe oss til å bedre forstå Salmonella livssyklus og rollen som biofilm spille i overføringen.
Kromatin immunutfelling føle etter av høy-produksjon sekvensering (flis-SEQ) er en kraftfull inne vivo teknikk for Genova-bred legitimasjonen av protein-DNA vekselsvirkningene og skaffer beskjed opp på regulere prosesser innvolvere transkripsjon faktorene, histone modifiseringer, eller nucleosomes7. Nyere studier har brukt denne teknikken til å vurdere differensial proteinbinding mellom vekstforhold og celletyper8. I kromatin immunutfelling (ChIP), er DNA-fragmenter med samspill proteiner beriket gjennom antistoff valg av målet proteiner. Celler høstes og DNA-bindende proteiner er krysskoblet til DNA in vivo gjennom formaldehyd Cross-linker behandling. Celler er lysert, slippe celleinnholdet, og kromatin er skåret inn om lag 200-600 BP fragmenter7. DNA-fragmenter bundet til målet proteinet er immunoprecipitated ved hjelp av antistoff, og isolert av de-Cross Linking etterfulgt av protein fordøyelsen9. Disse DNA-fragmentene representerer proteinbinding nettsteder matchet av hybridisering til en Microarray (ChIP-chip) eller ved dyp sekvensering og kartlegging til Genova sekvensen10,11. Selv om ChIP-chip eksperimenter yield tilstrekkelige regulatoriske data, de er begrenset på grunn av bruk av dyre sonder, samt hybridisering og array bias12. Flis-SEQ har en større drivkraft omfang med forhøyet nukleotid resolution og presseomtalen, forbedret signal-å-bråk forhold, og færre artefakter når sammenlignet med flis-flis7.
ChIP har blitt brukt til å analysere SFH og OmpR regulering i Salmonella serovar tyfimurium13,14, quorum-sensing AphA regulering i Vibrio alginolyticus15, RpoS regulering i Escherichia coli16, virulens regulator EspR regulering i Mycobacterium tuberkulose17, potensielle diguanylate cyclases gjennom AmrZ regulering i Pseudomonas aeruginosa18, så vel som VraSR regulering i Staphylococcus aureus19. Den bakterielle ChIP-SEQ eksperimenter som har blitt beskrevet begynner med voksende celler i flytende Media og høsting i enkelt celle form. Analyse av biofilm og tilsvarende gen regulering representerer imidlertid et nytt sett med utfordringer for å generere en vellykket ChIP-SEQ-protokoll. I denne protokollen, ChIP-SEQ brukes til å finne differensial regulatoriske mål av CsgD, S. Tyfimurium Master biofilm regulator i biofilm og planktoniske celletyper. Denne protokollen beskriver teknikker som brukes til å bestemme de riktige mengdene av biofilm for ChIP-SEQ, høste biofilm fra kolbe kultur, normalisere biofilm og enkelt cellekontroll prøver, homogenisere biofilm, og fullstendig immunutfelling. Dette vil være nyttig for å studere regulatoriske mål i bakteriell biofilm og kan tilpasses for mange arter.
Denne protokollen skisserer en teknikk for å utføre ChIP-SEQ med Salmonella enterica serovar tyfimurium biofilm og planktoniske celler fra ren kultur, for å finne regulatoriske mål av Master biofilm regulator, CsgD. Vi forventer differensial bindende informasjon på grunn av bi-stabiliteten av CsgD i de to celletyper, med høye nivåer i biofilm aggregater og lave nivåer i planktoniske celler2,3. Imidlertid kan denne teknikken også brukes til andre bakterielle transkripsjon faktorer, celletyper, eller vekstforhold. Spesielt kan denne teknikken tilpasses andre bakterielle biofilm ved hjelp av en eksperimentelt bestemt Omregningsfaktor for CFU per enhet vekt av biofilm celler.
ChIP-SEQ kan være tilbøyelig til forsterkning av teknisk feil gjennom sekvensering; bekreftelse på kritiske trinn kan imidlertid forhindre denne27. Primær antistoff spesifisitet er viktig for å velge bare målet transkripsjon faktor og DNA det styrer under immunutfelling7. I dette eksperimentet ble csgD smeltet til en plasmider-kodet 3xFLAG-kode på 3-enden av genet, tilsvarende C-Terminus i csgD22. Den p3xFLAG plasmider uten csgD ble brukt som en “kontroll” (S. Tyfimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). KODE retningslinjer anbefaler å utføre immunoblots med primære antistoff mot protein av interesse, og lysater av ChIP stammer og sletting stammer21. Det er viktig å sikre at vekst forholdene er konsekvente på tvers av replikerer for å redusere variasjoner i transkripsjon faktor binding og nedstrøms sekvensering resultater. Hvis man er nøye med å sikre inokulum størrelser og pre-inokulum vekstforhold er konsekvente, biofilm vekst i kolbe kultur er konsistent4. Det er viktig å bekrefte at alle biofilm har blitt brutt fra hverandre etter homogenisering, for å sikre lik tilgang av reagenser, spesielt formaldehyd Cross-linker, til alle celler.
Flere modifikasjoner kan gjøre det mulig for forskere å bruke denne protokollen for andre DNA-bindende proteiner, celletyper, belastninger, vekstforhold eller laboratorieutstyr. Hvis den brukes til biofilm andre arter enn S. Tyfimurium, Omregningsfaktor av koloni forming enheter per enhet vekt av biofilm må fastsettes eksperimentelt ved høsting ulike mengder biofilm, homogenisere biofilm grundig, og utføre seriell fortynninger og plate telling å lage en standard kurve, som kanskje ikke er nøyaktig ved lavere biofilm vekter2. Sonicator energi overføring og celle type motstand kan variere; Derfor er en sonikering-analysen anbefales å finne antall sonikering sprekker som vil produsere fragment størrelsesområdet som kreves for nedstrøms biblioteket forberedelse og sekvensering11. Kromatin fragmentering av micrococcal nuklease er et alternativ til sonikering som produserer høy oppløsning av belegg områder; Denne metoden kan imidlertid innføre fragmentering bias7,28. DNA-størrelsesområdet kan endres avhengig av nedstrøms biblioteket forberedelse kits og sekvensering plattformer. Andre metoder for homogenisering kan brukes i stedet for mikseren mill. For eksempel kan et glass vev homogenisator erstattes, men det kan aerosolize eller ufullstendig bryte opp biofilm. Når det gjelder kontroller, kan pre-immunoprecipitate DNA bli normalisert i post-sekvensering prosessering og analyse. En mock-IP kontroll med arter-matchet normalt antistoff serum kan brukes som en kontroll i tillegg13.
Forskning må betenke begrensningene å denne metoden når betenke en flis-SEQ eksperiment. Det kan være nødvendig med betydelige endringer for å tilpasse den til andre biofilm typer. For eksempel, med Salmonella tyfimurium umiddelbare blanding av BIOFILM i PBS fører til målbar tap av biofilm aggregater. Immunutfelling målretting regulatoriske mål av transkripsjon faktorer i bakterier kan resultere i svært små mengder DNA, som er en utfordring for rensing og deteksjon på senere trinn. Bias kan innføres under klipping og nedstrøms manipulasjon under biblioteket deteksjon9. I tillegg, denne metoden ikke avslører i vivo uttrykks nivåer som svar på transkripsjon faktor binding. Forskere som har liten erfaring i bioinformatikk kan bli utfordret av analysen rørledningen. Denne metoden kan være tidkrevende og dyrt; Imidlertid er kostnaden for sekvensering ofte lavere enn en Microarray og er synkende over tid som teknologiske forbedringer fortsetter å bli gjort.
Noen metoder i litteraturen beskriver ChIP med bakterier, og de fleste bakterielle eksperimenter begynner med en enkel vekst tilstand13,14,15,17,18. ChIP prøve utarbeidelse med enkeltceller er grei og presenterer færre utfordringer enn ChIP prøveforberedelse med biofilm aggregater. Idet for flis-SEQ, foregående metoder av studerer CIS-regulere krets, inkluderer systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse (SELEX), Elektroforetiske transportabel Skift analyser (EMSA), flis-flis, promoter overstrekingen og reporter analyse ha blitt supplert eller erstattet av flis-SEQ29. ChIP-SEQ erstatter ChIP-chip på grunn av fremmarsj teknologier og tilgjengelighet av sekvensering. Deep sekvensering gir forskere med massive mengder data som kan identifisere områder med lavere bindende affinitet og høyere base pair oppløsning med mindre Start materiale enn ChIP-chip11,30. Analyse av ChIP data fra organismer med høy kvalitet referanse genomer er generelt rask og spesifikk. I tillegg er ChIP-SEQ en grundig metode for å oppdage i silisiummangan spådd bindende områder som kanskje ikke er opptatt i alle celletyper, vekstfase, eller miljømessige forhold31.
I fremtiden, kan denne protokollen brukes til å lette forståelsen av bakteriell patogenesen, spesielt biofilm-forming organismer. Fleksibel bruk av denne teknikken og tilgjengelighet av nye datasett kan føre til data integrasjon for å identifisere grupper av proteiner som co-lokalisere å kontrollere cellulære prosesser i biofilm-forming mikroorganismer32. Dessuten, flis-SEQ og RNA-SEQ data kan integrert å bygge regulere system modeller33.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) til AW og gjennom Jarislowsky Chair i bioteknologi. MP ble støttet av en NSERC-CREATE stipend gjennom Integrated Training program i smittsomme sykdommer, mattrygghet og offentlig politikk (ITraP) ved Universitetet i Saskatchewan.
Forfatterne vil gjerne takke Dani Dale for filming og redigering.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |