A imunoprecipitação de cromatina, juntamente com o sequenciamento de última geração (ChIP-seq), é um método usado para estabelecer interações entre fatores de transcrição e as sequências genômicas que eles controlam. Este protocolo descreve técnicas para a realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, usando salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme bacteriano como um exemplo.
A imunoprecipitação de cromatina seguida pelo sequenciamento (ChIP-seq) é uma técnica que pode ser usada para descobrir os alvos regulatórios de fatores de transcrição, modificações de histona e outras proteínas associadas ao DNA. Os dados chip-seq também podem ser usados para encontrar a ligação diferencial de fatores de transcrição em diferentes condições ambientais ou tipos de células. Inicialmente, o ChIP foi realizado por meio de hibridização em um microarray (chip ChIP); no entanto, chip-seq tornou-se o método preferido através de avanços tecnológicos, diminuindo as barreiras financeiras para sequenciamento, e enormes quantidades de saída de dados de alta qualidade. Técnicas de realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, uma das principais fontes de infecções persistentes e crônicas, são descritas neste protocolo. O ChIP-seq é realizado em salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm e células planctônicas, visando o regulador mestre de biofilme, CsgD, para determinar a ligação diferencial nos dois tipos de células. Aqui, demonstramos a quantidade adequada de biofilme para a colheita, normalizando-se em uma amostra de controle planctônico, homogeneizando o biofilme para acesso entre linker e realizando etapas rotineiras de ChIP-seq para obter resultados de sequenciamento de alta qualidade.
Biofilmes bacterianos, agregados estruturais de células embutidos em uma matriz auto-produzida, são resistentes à dessecação, antibióticos e host respostas imunes1. Como tal, eles causam infecções persistentes e crônicas e apresentam desafios únicos para os pesquisadores devido às suas soluções para a sobrevivência e transmissão. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. O tyfhimurium) foi encontrado para estabelecer populações fenotipicamente heterogêneas de agregados biofilme que são resistentes à dessecação e antibióticos, e células planctônicas que expressam fatores de virulência na cultura pura quando expostas ao estresse ambiental (28 °C, limitando nutrientes)2. Estes dois tipos de células surgem devido à expressão biestável do regulador biofilme mestre, CsgD3. Temos a hipótese de que esta pode ser uma estratégia de cobertura de aposta para Salmonella, onde as células planctônicas participar de células de transmissão de curto prazo e biofilme são capazes de persistir a longo prazo no ambiente até que uma oportunidade para infectar um novo hospedeiro surge2,4. Muitos dos elementos regulatórios que controlam a expressão csg operon são bem caracterizados5. No entanto, além de adra e o csg operon6, poucas metas regulamentares de CsgD são conhecidos. Identificar a rede regulatória csgd nos ajudaria a entender melhor o ciclo de vida de Salmonella e o papel que os biofilmes desempenham na transmissão.
A imunoprecipitação de cromatina, seguida de sequenciamento de alta produtividade (ChIP-seq) é uma poderosa técnica in vivo para identificação em todo o genoma de interações de dna de proteínas e fornece informações sobre processos regulatórios envolvendo fatores de transcrição, modificações de histona ou nucleossomos7. Estudos mais recentes têm usado esta técnica para avaliar a ligação proteica diferencial entre as condições de crescimento e os tiposde células 8. Na imunoprecipitação de cromatina (ChIP), fragmentos de DNA com proteínas interagindo são enriquecidos através da seleção de anticorpos das proteínas-alvo. As células são colhidas e as proteínas de ligação ao DNA estão cruzadas com o DNA in vivo através do tratamento cross-linker de formaldeído. As células são lysed, liberando o conteúdo celular, e cromatina é cortado em cerca de 200-600 fragmentos bp7. Fragmentos de DNA ligados à proteína alvo são imunoprecipitados usando anticorpos, e isolados por descruzamento seguido de digestão deproteínas 9. Estes fragmentos de DNA representam locais de ligação de proteína saqueados pela hibridização a um microarray (Chip ChIP) ou por sequenciamento e mapeamento profundo para a sequência do genoma10,11. Embora os experimentos com chip ChIP produzam dados regulatórios adequados, eles são limitados devido ao uso de sondas caras, bem como hibridização e viés de matriz12. ChIP-seq tem uma gama dinâmica maior com maior resolução de nucleotídeos e cobertura, melhor relação sinal-ruído, e menos artefatos quando comparado ao Chip ChIP7.
ChIP tem sido usado para analisar a regulamentação Sfh e OmpR em Salmonella serovar Typhimurium13,14, quorum-sensoriamento apha regulamento em Vibrio alginolyticus15, rpos regulamento em E scherichia coli16, regulamento espR regulador de virulência em Mycobacterium tuberculosis17, potenciais cicestas diguanylate através da regulamentação AmrZ em Pseudomonas aeruginosa18, bem como VraSR regulamento em Staphylococcus aureus19. Os experimentos bacterianos chip-seq que foram descritos começam com o cultivo de células em mídia líquida e colheita em forma de célula única. No entanto, a análise de biofilmes e regulação gênica correspondente representa um novo conjunto de desafios para gerar um protocolo ChIP-seq bem-sucedido. Neste protocolo, chip-seq é usado para encontrar diferencial metas regulamentares de CsgD, o S. Typhimurium mestre regulador biofilme em biofilme e tipos de células planctônicas. Este protocolo descreve técnicas usadas para determinar as quantidades apropriadas de biofilme para ChIP-seq, biofilme de colheita da cultura do frasco, normalizar amostras de biofilme e controle de células únicas, homogeneizar biofilme e imunoprecipitação completa. Isso será útil para estudar os alvos regulatórios em biofilmes bacterianos e pode ser adaptado para muitas espécies.
Este protocolo descreve uma técnica para a realização de ChIP-seq com Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme e células planctônicas da cultura pura, para encontrar alvos regulamentares do regulador biofilme mestre, CsgD. Esperamos informações diferenciais de ligação devido à biestabilidade da CsgD nos dois tipos de células, com altos níveis em agregados de biofilme e baixos níveis nas células planctônicas2,3. No entanto, esta técnica também pode ser aplicada a outros fatores de transcrição bacteriana, tipos de células ou condições de crescimento. Em particular, esta técnica pode ser adaptada a outros biofilmes bacterianos usando um fator de conversão experimentalmente determinado para A UE por unidade de peso das células biofilme.
O ChIP-seq pode ser propenso à amplificação de erro técnico por meio do sequenciamento; no entanto, a confirmação em etapas críticas pode evitar este27. A especificidade primária do anticorpo é importante para selecionar apenas o fator de transcrição alvo e o DNA que ele controla durante a imunoprecipitação7. Neste experimento, csgD foi fundido a uma etiqueta 3xFLAG codificada em plasmídeo na extremidade 3′ do gene, correspondente ao C-terminus de CsgD22. O plasmídeo p3xFLAG sem csgD foi usado como um “controle” (S. Typhimurium 14028 csgD + p3xFLAG). As diretrizes do ENCODE recomendam a realização de imunoblotes com anticorpos primários contra a proteína de interesse, e as lysates das cepas e tensões de exclusão chip21. É importante garantir que as condições de crescimento sejam consistentes em todas as réplicas para reduzir a variabilidade nos resultados de sequenciamento de fatores de transcrição e downstream. Se for preciso garantir que tamanhos de inóculo e condições de crescimento pré-inóculo sejam consistentes, o crescimento de biofilmes na cultura do frasco é consistente4. É importante confirmar que todo o biofilme foi quebrado após a homogeneização, para garantir a igualdade de acesso de reagentes, particularmente formaldeído cross-linker, para todas as células.
Várias modificações podem permitir que os pesquisadores usem esse protocolo para outras proteínas de ligação ao DNA, tipos de células, cepas, condições de crescimento ou equipamentos de laboratório. Se for usado para espécies biocinematográficas que não s. Typhimurium, o fator de conversão de unidades de formação de colônias por peso unitário de biofilme precisa ser determinado experimentalmente apartir da colheita de diferentes quantidades de biofilme, homogeneizando o biofilme completamente, e realizando diluições em série e contagem de placas para criar uma curva padrão, que pode não ser precisa em pesos de biofilme mais baixos2. A transferência de energia sonicator e a resistência do tipo celular podem diferir; portanto, um ensaio de sonication é recomendado para encontrar o número de explosões de somque irá produzir a faixa de tamanho do fragmento necessário para a preparação da biblioteca a jusante e seqüenciamento11. A fragmentação da cromatina por nuclease microcócica é uma alternativa à sonorização que produz alta resolução de locais de ocupação; no entanto, este método pode introduzir viés de fragmentação7,28. A faixa de tamanho do DNA pode ser alterada dependendo dos kits de preparação da biblioteca a jusante e das plataformas de sequenciamento. Outros métodos de homogeneização podem ser usados em vez da fábrica de batedeiras. Por exemplo, um homogeneizador de tecido de vidro pode ser substituído, mas pode aerossolizar ou quebrar incompletamente o biofilme. Em termos de controles, o DNA pré-imunoprecipitado pode ser normalizado no processamento e análise pós-sequenciamento. Um controle de mock-IP com soro de anticorpo normal compatível com espécies pode ser usado como um controle também13.
Os pesquisadores devem considerar as limitações a este método ao considerar um experimento ChIP-seq. Modificações significativas podem ser necessárias para adaptá-lo para outros tipos de biofilme. Por exemplo, com salmonella typhimurium resuspensão imediata de biofilme na PBS leva à perda mensurável de agregados biofilme. A imunoprecipitação que visa alvos regulatórios de fatores de transcrição em bactérias pode resultar em quantidades muito pequenas de DNA, o que é um desafio para a purificação e detecção em etapas posteriores. Viés pode ser introduzido durante a tosquia e manipulação a jusante durante a detecção da biblioteca9. Além disso, este método não revela níveis de expressão in vivo em resposta à ligação do fator de transcrição. Pesquisadores que têm pouca experiência em bioinformática podem ser desafiados pelo pipeline de análise. Este método pode ser intensivo em termos de tempo e caro; no entanto, o custo do sequenciamento é muitas vezes menor do que um microarray e está diminuindo ao longo do tempo como melhorias tecnológicas continuam a ser feitas.
Poucos métodos na literatura descrevem ChIP com bactérias, e a maioria dos experimentos bacterianos começa com uma simples condição de crescimento13,14,15,17,18. A preparação da amostra chip com células individuais é simples e apresenta menos desafios do que a preparação da amostra ChIP com agregados de biofilme. Quanto à ChIP-seq, métodos anteriores de estudo de circuitos cis-regulatórios, incluindo a evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX), ensaios de mudança de mobilidade eletrofética (EMSA), ChIP-chip, exclusão de promotores e análise de repórterforam complementados ou substituídos por ChIP-seq29. A ChIP-seq está substituindo o Chip ChIP devido ao avanço das tecnologias e à disponibilidade de sequenciamento. O sequenciamento profundo fornece aos pesquisadores grandes quantidades de dados que podem identificar sites com menor afinidade de ligação e maior resolução de pares de base com menos material inicial do que o Chip ChIP11,30. A análise dos dados do ChIP de organismos com genomas de referência de alta qualidade é geralmente rápida e específica. Além disso, chip-seq é um método completo para descobrir em silico previu sites de ligação que não podem ser ocupados em todos os tipos de células, fase de crescimento, ou condições ambientais31.
No futuro, este protocolo pode ser usado para facilitar a compreensão da patogênese bacteriana, particularmente organismos formadores de biofilme. A ampla adoção dessa técnica e a disponibilidade de novos conjuntos de dados podem levar à integração de dados para identificar grupos de proteínas que co-localizam para controlar processos celulares em microorganismos formadores debiofilme32. Além disso, os dados ChIP-seq e RNA-seq podem ser integrados para criar modelos de sistema regulatório33.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) (#2017-05737) para a AW e através da Cadeira Jarislowsky em Biotecnologia. O MP foi apoiado por uma bolsa NSERC-CREATE através do Programa Integrado de Treinamento em Doenças Infecciosas, Segurança Alimentar e Políticas Públicas (ITraP) da Universidade de Saskatchewan.
Os autores gostariam de agradecer a Dani Dale por filmar e editar.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |