Kromatin immunoprecipitation tillsammans med nästa generations sekvensering (ChIP-SEQ) är en metod som används för att etablera interaktioner mellan transkriptionsfaktorerna och de genomiska sekvenser de styr. Detta protokoll beskriver tekniker för att utföra ChIP-SEQ med bakteriella biofilmer, med hjälp av salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium bakteriell biofilm som ett exempel.
Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-SEQ) är en teknik som kan användas för att upptäcka de regulatoriska målen för transkriptionsfaktorer, histonmodifieringar och andra DNA-associerade proteiner. ChIP-SEQ-data kan också användas för att hitta differentiell bindning av transkriptionsfaktorer i olika miljöförhållanden eller celltyper. Inledningsvis, ChIP utfördes genom hybridisering på en microarray (ChIP-chip); ChIP-SEQ har dock blivit den bästa metoden genom tekniska framsteg, minskande ekonomiska hinder för sekvensering och stora mängder högkvalitativa data. Tekniker för att utföra ChIP-SEQ med bakteriella biofilmer, en viktig källa till ihållande och kroniska infektioner, beskrivs i detta protokoll. ChIP-SEQ utförs på salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium biofilm och plankton celler, med inriktning på Master biofilm regulator, csgd, att bestämma differential bindning i de två celltyper. Här visar vi lämplig mängd biofilm att skörda, normalisera till en plankton kontrollprov, homogenisering biofilm för Cross-Linker tillgång, och utföra rutinmässig chip-SEQ steg för att få högkvalitativa sekvensering resultat.
Bakteriella biofilmer, strukturella aggregat av celler inbäddade i en egenproducerad matris, är resistenta mot uttorkning, antibiotika, och värd immunsvar1. Som sådan, de orsakar ihållande och kroniska infektioner och presentera unika utmaningar för forskare på grund av deras lösningar för överlevnad och överföring. Salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium (S. Typhimurium) har befunnits etablera fenotypiskt heterogena populationer av biofilm aggregat som är resistenta mot uttorkning och antibiotika, och plankton celler som uttrycker virulensfaktorer i renkultur när de utsätts för miljö stress (28 ° c, begränsa näringsämnen)2. Dessa två celltyper uppstår på grund av bistabila uttryck av befälhavaren biofilm regulator, csgd3. Vi har en hypotes om att detta kan vara en bet-hedging strategi för salmonella, där plankton celler deltar i kortsiktiga överföring och biofilm celler kan kvarstå långsiktigt i miljön tills en möjlighet att infektera en ny värd uppstår2,4. Många av de reglerande element som styr CSG operon uttryck är väl kännetecknas5. Men bortsett från ADRA och CSG operon6, några regulatoriska mål av csgd är kända. Identifiera CsgD reglerings nätverket skulle hjälpa oss att bättre förstå salmonella livscykel och den roll som bio Films spela i transmission.
Kromatin immunoprecipitation följt av hög genomströmning sekvensering (ChIP-SEQ) är en kraftfull in vivo teknik för genomomfattande identifiering av protein-DNA interaktioner och ger information om regleringsprocesser som inbegriper transkriptionsfaktorer, histonmodifieringar, eller nukleosomer7. Nyare studier har använt denna teknik för att bedöma differentiell proteinbindning mellan tillväxtförhållanden och celltyper8. I kromatin immunoprecipitation (chip), DNA-fragment med samverkande proteiner berikas genom antikropps val av målproteiner. Celler skördas och DNA-bindande proteiner korslänkas till DNA in vivo genom behandling med formaldehydcross-Linker. Celler lyseras, frigöra cellinnehållet, och kromatin är klippt i cirka 200 – 600 BP fragment7. DNA-fragment bundna till målproteinet immunopreciteras med hjälp av antikroppar, och isoleras genom de-crosslinking följt av proteinnedbrytning9. Dessa DNA-fragment representerar proteinbindnings ställen matchas av hybridisering till en microarray (ChIP-chip) eller genom djupsekvensering och kartläggning till genomsekvensen10,11. Även om ChIP-chip experiment ger adekvat reglerande data, de är begränsade på grund av användningen av dyra sonder, samt hybridisering och array bias12. ChIP-SEQ har ett större dynamiskt omfång med ökad nukleotid upplösning och täckning, förbättrad signal-brus-förhållande, och färre artefakter jämfört med ChIP-chip7.
ChIP har använts för att analysera SFH och ompr förordning i salmonella serovar typhimurium13,14, kvorum-Sensing APHA förordning i Vibrio alginolyticus15, RPOS förordning i Escherichia coli16, virulens regulator espr förordning i Mycobacterium tuberculosis17, potentiella diguanylate cyklaser genom amrz förordning i Pseudomonas aeruginosa18, samt vrasr reglering i Staphylococcus aureus19. De bakteriella ChIP-SEQ-experiment som har beskrivits börjar med växande celler i flytande media och skörd i encellig form. Analys av biofilmer och motsvarande genreglering är dock en ny uppsättning utmaningar för att skapa ett lyckat ChIP-SEQ-protokoll. I detta protokoll används ChIP-SEQ för att hitta differentiella regleringsmål för CsgD, S. Typhimurium Master biofilm regulator i biofilm och plankton celltyper. Detta protokoll beskriver metoder som används för att fastställa lämpliga mängder biofilm för ChIP-SEQ, Harvest biofilm från Flask kultur, normalisera biofilm och Single cell kontroll prover, homogenisera biofilm, och fullständig immunoprecipitation. Detta kommer att vara användbart för att studera regulatoriska mål i bakteriella biofilmer och kan anpassas för många arter.
Detta protokoll beskriver en teknik för att utföra chip-SEQ med salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium biofilm och plankton celler från renkultur, att hitta regulatoriska mål för befälhavaren biofilm regulator, csgd. Vi förväntar oss differential bindningsinformation på grund av BI-stabiliteten hos csgd i de två celltyperna, med höga halter i bio Films aggregat och låga nivåer i plankton celler2,3. Denna teknik kan dock också tillämpas på andra bakteriella transkriptionsfaktorer, celltyper eller tillväxtförhållanden. I synnerhet kan denna teknik anpassas till andra bakteriella biofilmer med hjälp av en experimentellt bestämd omvandlingsfaktor för CFU per viktenhet biofilm celler.
ChIP-SEQ kan vara benägna att amplifiering av tekniska fel genom sekvensering; dock kan bekräftelse på kritiska steg förhindra detta27. Primär antikropp specificitet är viktigt för att välja endast målet transkription faktorn och DNA den kontroller under immunoprecipitation7. I detta experiment var csgd smält till en Plasmid-kodad 3xflag tagg vid 3 ‘ slutet av genen, som motsvarar C-terminus av csgd22. P3xFLAG plasmid utan csgD användes som en “kontroll” (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). Koda riktlinjer rekommendera att utföra Immunoblots med primär antikropp mot proteinet av intresse, och celllysat av chip stammar och strykningar stammar21. Det är viktigt att se till att tillväxtvillkoren är konsekventa över replikat för att minska variationer i transkriptionsfaktorbindningen och efterföljande sekvenserings resultat. Om man är noga med att säkerställa inokulum storlekar och pre-inokulum tillväxtvillkor är konsekventa, biofilm tillväxt i Flask kulturen är konsekvent4. Det är viktigt att bekräfta att alla biofilm har brutits sönder efter homogenisering, för att säkerställa lika tillgång till reagenser, särskilt formaldehyd Cross-Linker, till alla celler.
Flera ändringar kan göra det möjligt för forskare att använda detta protokoll för andra DNA-bindande proteiner, celltyper, stammar, tillväxtförhållanden eller laboratorieutrustning. Används för andra biofilmbildande arter än S. Typhimurium, omvandlingsfaktorn för kolonin bildar enheter per viktenhet biofilm måste bestämmas experimentellt genom att skörda olika mängder av biofilm, homogenisering biofilm grundligt, och utföra seriella utspädningar och plattan räkna för att skapa en standardkurva, som inte kan vara korrekt vid lägre biofilm vikter2. Ultraljudsapparat energiöverföring och celltyp resistens kan variera; Därför, en ultraljudsbehandling assay rekommenderas att hitta antalet ultraljudsbehandling skurar som kommer att producera fragment storleksintervall som krävs för nedströms bibliotek beredning och sekvensering11. Kromatin fragmentering av micrococcal Nuclease är ett alternativ till ultraljudsbehandling som ger hög upplösning av beläggning platser; Denna metod kan dock medföra fragmentering bias7,28. DNA-storleksintervall kan ändras beroende på nedströms bibliotek förberedelse kit och sekvensering plattformar. Andra metoder för homogenisering kan användas i stället för blandaren kvarnen. Till exempel kan en glas vävnad Homogenisatorer ersättas, men det kan aerosolize eller ofullständigt bryta upp biofilm. När det gäller kontroller, kan pre-immunoprecipitate DNA normaliseras i efter sekvensering bearbetning och analys. En mock-IP-kontroll med artmatchade normala antikropps serum kan användas som kontroll och13.
Forskare måste överväga begränsningarna för denna metod när man överväger en ChIP-SEQ experiment. Det kan krävas betydande ändringar för att anpassa det till andra typer av biofilmer. Till exempel, med salmonella typhimurium omedelbar resuspension av biofilm i PBS leder till mätbara förlust av biofilm aggregat. Immunoprecipitation inriktning regulatoriska mål av transkriptionsfaktorer i bakterier kan resultera i mycket små mängder av DNA, vilket är en utmaning för rening och detektion vid senare steg. Bias kan introduceras under kapning och nedströms manipulation under biblioteks detektering9. Dessutom avslöjar denna metod inte in vivo uttrycks nivåer som svar på transkriptionsfaktorbindningen. Forskare som har liten erfarenhet av bioinformatik kan utmanas av analyspipelinen. Denna metod kan vara tidskrävande och dyrt; men kostnaden för sekvensering är ofta lägre än en microarray och minskar med tiden som tekniska förbättringar fortsätter att göras.
Få metoder i litteraturen beskriver chip med bakterier, och de flesta bakteriella experiment börjar med en enkel tillväxtvillkor13,14,15,17,18. ChIP provberedning med enstaka celler är enkel och presenterar färre utmaningar än ChIP provberedning med biofilm aggregat. När det gäller ChIP-SEQ, tidigare metoder för att studera CIS-reglerande kretsar, inklusive systematisk utveckling av ligander genom exponentiell berikning (SELEX), elektroforetisk rörlighet Shift analyser (EMSA), ChIP-chip, promotor radering och reporter analys har kompletterats eller ersatts av ChIP-SEQ29. ChIP-SEQ ersätter ChIP-chip på grund av avancerad teknik och tillgång till sekvensering. Djupsekvensering ger forskare stora mängder data som kan identifiera platser med lägre bindnings tillhörighet och högre bas par upplösning med mindre utgångsmaterial än chip-chip11,30. Analys av ChIP data från organismer med hög kvalitet referens genom är i allmänhet snabb och specifik. Dessutom är ChIP-SEQ en grundlig metod för att upptäcka i silico förutspådda bindnings platser som inte kan upptas i alla celltyper, tillväxtfas eller miljöförhållanden31.
I framtiden kan detta protokoll användas för att underlätta förståelsen av bakteriell patogenes, särskilt biofilmbildande organismer. Ett brett antagande av denna teknik och tillgängligheten av nya datauppsättningar kan leda till dataintegrering för att identifiera grupper av proteiner som samlokaliserar för att styra cellulära processer i biofilmbildande mikroorganismer32. Dessutom kan ChIP-SEQ och RNA-SEQ-data integreras för att bygga regelsystem modeller33.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av ett bidrag från Naturvetenskaps-och Ingenjörsvetenskaps rådet (NSERC) (#2017-05737) till AW och genom Jarislowsky-stolen i bioteknik. MP stöddes av ett NSERC-CREATE-stipendium genom det integrerade utbildningsprogrammet i infektionssjukdomar, livsmedelssäkerhet och allmän ordning (ITraP) vid University of Saskatchewan.
Författarna skulle vilja tacka Dani Dale för filmning och redigering.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |