Summary
여기에 제시된 것은 포유류 신장에서 혈관 내피 성장 인자와 황체 형성 호르몬 사이의 상관관계를 입증하기 위해 피질 신장 추출물 제제 및 총 단백질 정규화를 활용하기 위한 프로토콜이다.
Abstract
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 신장에서 혈관 신생 및 혈관 투과성을 제어하는 데 도움이됩니다. 당뇨병 신증과 같은 신장 장애는 신장의 VEGF dysregulation와 관련이 있습니다. 신장에 있는 생리적인 조건의 밑에 VEGF를 통제하는 요인은 잘 이해되지 않습니다. 황체 형성 호르몬 (LH), 프로 혈관 신생 호르몬, 생식 기관에서 생리 VEGF 발현을 조절 하는 데 도움이. LH 수용체가 신장에서 발견된다는 것을 감안할 때, 우리는 Zietchick 연구소에서 LH가 또한 신장에 있는 VEGF 발현을 통제하는 것을 돕다는 가설을 세워주었습니다. 증거를 제공하기 위해, 우리는 LH 수준이 포유류 신장에서 VEGF 수준을 예측 할 수 있음을 보여주기 위해 목표로. 신장을 관련시키는 대부분의 VEGF 관련 조사는 모형으로 더 낮은 순서 포유동물을 이용했습니다 (즉, 설치류 및 토끼). 이 작업을 인체로 번역하기 위해, VEGF와 LH 사이의 관계를 고차 포유류(즉, 소 및 돼지 모델)에서 조사하기로 결정했다. 이 프로토콜은 신장 피질에서 총 단백질 용해를 사용합니다. 이 방법의 성공의 열쇠는 총 단백질에 의하여 분석물 수준 (신장 추출물에서)의 정상화 뿐만 아니라 죽음 직후에 도축장 동물에게서 신장의 조달을 포함합니다. 이 연구는 소와 돼지 신장 모두에서 LH와 VEGF 사이의 유의한 선형 관계를 성공적으로 보여줍니다. 결과는 두 가지 다른 종에서 재현 할 수 있습니다. 이 연구는 소와 돼지의 신장 추출물 사용이 특히 VEGF와 다른 세포체 간의 상관 관계를 검사하기 위해 신장 생리학 연구를 위한 우수하고 경제적이며 풍부한 자원이라는 증거를 제공합니다.
Introduction
혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)는 신장 및 다른 장기의 혈관 신생 및 혈관 투과성을 조절하는 데 도움을 주며1,2 (이하, VEGF-A는 VEGF로 지칭될 것이다). 신장에 있는 VEGF 수준은 단단한 적시성 통제의 밑에 있습니다. 신장 VEGF 수준이 상승하거나 우울할 때, 신장은 오작동할 수 있습니다. 예를 들어, 출생 후 3주 이내에, VEGF에 대한 포도극세포 특이적 이종이성 마우스는 내피증및 무혈 사구체(즉, 인간 자간전증에서 보인 신장 병변)를 개발하고, 말기 신부전은 3개월까지 이 헤테로고트에서 발생한다. Podocyte 특정 동형 접합 녹아웃은 출생의 1 일 안에 수소화 및 신부전으로정지합니다3,4.
한편, 신장 VEGF의 과발현은 단백뇨 및 사구체비대3,4를유발한다. 예를 들어, VEGF를 과발현하는 형질전환 토끼는 신병증의 초기 단계에서 증가된 사구체 여과 속도를 가진 진보적인 단백뇨를 나타내고, 그 다음에 는 후기3단계에서사구체 여과 속도 감소하였다. 당뇨병 성 신증, 당뇨병 성인에서 말기 신장 질환의 주요 원인, VEGF dysregulation와 강하게 관련2,5. 병리학적 조건 하에서 VEGF 발현을 유도하는 저산소증의 역할에 많은 주의를 기울였다5. 그러나, 생리적 조건 하에서 VEGF를 지배하는 요인은 (신장및 그밖 기관 둘 다) 잘 이해되지 않습니다2,6. 생리학적 및 병리학적 VEGF 조절에 관여하는 이러한 인자(산소 제외)를 식별하는 것은 중요한 사업이다.
황체 형성 호르몬 (LH), 프로 혈관 신생 호르몬, 난소와 고환 등 생식 기관에서 생리 VEGF 발현을 조절 하는 데 도움이7,8. 이전 연구는 LH가 또한 눈6,9,10과같은 비 생식 기관에서 VEGF를 조절하는 데 도움이 된다는 증거를 제공했다. LH 수용체는신장11,12의수질및 피질에서 발견된다. 참고로, 신장 관상피 세포뿐만 아니라 LH 수용체, VEGF11,12,13,14를발현한다. 이 두 가지 관찰을 함께 복용, 우리는 LH는 또한 신장에서 VEGF 발현을 조절하는 데 도움이 가설13,14. 이 LH/VEGF 관계의 증거를 제공하기 위하여, 제시된 프로토콜은 LH 수준이 신장에 있는 VEGF 수준을 예측할 수 있다는 것을 보여주기 위하여. 신장과 관련된 많은 이전 VEGF 관련 조사는 낮은 순서의 포유동물 모델 (즉, 설치류 및토끼)를 사용했습니다 2. 이 작업을 인체로 번역하기 위해, 연구는 높은 순서의 포유동물 (여기, 소 및 돼지 모델)에서 VEGF와 LH 사이의 관계를 검사합니다. 이 목적을 수행하기 위하여는, 총 단백질 lysate는 소 및 돼지 신장의 피질 지역으로부터 제조되었다.
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Protocol
이 연구에는 살아있는 동물이나 실험동물이 사용되지 않았습니다.
1. 조직 취급
- 아바토이르에서 도살 직후 소와 돼지 전체 신장을 조달하십시오. 실험실에 얼음에 수송.
- 실험실에 도착하면 50 mL의 얼음 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 신장을 헹구어 보라고합니다. 혈액을 완전히 제거하기 위해이 단계를 2x 반복하십시오.
- 추가 추출이 될 때까지 신장을 얼음(또는 냉장)에 보관하십시오.
2. 신장의 해부
- 멸균 가위, 집게, 칼 및 페트리 접시를 사용하여 신장을 해부하고 필요한 조직 부분을 절제하십시오.
- 신장 해부 전에 RIPA lysis 완충제 준비. 5 mM NaCl, 0.5 M EDTA, 1 M 트리스 (pH = 8.0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10 % 나트륨 디옥시콜레이트 및 10 % SDS를 이중 증류수에 녹인 다음 완전히 섞습니다. 사용하지 않을 때는 RIPA 용해 버퍼를 냉장 보관하십시오.
- 부드럽게 반 (시상 평면)에서 신장을 잘라 조직의 조각을 잘라 (50-70mm2)신장의 중앙에 피질 영역에서 (젖은 무게에 의해 80-100 mg의 무게).
- 조직 블록을 칼로 작은 조각으로 잘라 균질화 과정을 돕습니다.
- 조직을 다진 후, 얼음 차가운 1x RIPA 용해 추출 버퍼 1 mL로 마이크로 퍼지 튜브로 옮김을 옮김. 튜브를 얼음에 놓고 추가 추출할 때까지 놓습니다.
3. 조직 균질화
- 조직 상급 수집을 위한 특정 샘플 세부 사항으로 마이크로 퍼지 튜브에 라벨을 붙입니다.
- 멸균 프로브가있는 휴대용 균질 화기를 사용하여 추운 조건 (얼음 양동이의 샘플)에서 1-2 분 동안 조직을 균질화하여 조직의 덩어리가 보이지 않을 때까지 하십시오.
- 4°C에서 5분 동안 9,600 x g에서 냉장 원심분리기에서 원심분리를 위해 조직 추출물을 즉시 추출하였다.
- 원심분리기에서 튜브를 제거하고 얼음 양동이에 놓습니다.
- 상급체를 새로운 라벨이 붙은 마이크로 퍼지 튜브에 넣고 얼음위에 보관하십시오. 펠릿을 버리십시오.
- 동결 해동 주기를 피하기 위해 LH 및 VEGF-A 효소 연결 면역 흡착 분석(ELISA) 및 총 단백질 분석을 위해 초나토트의 별도의 알리쿼트(aliquots)를 각각 준비합니다.
4. 소와 돼지 LH 엘리사 분석
- 시판되는 황체 형성 호르몬(LH) ELISA 키트에 포함된 모든 ELISA 분석 성분을 2-8°C에서 보관합니다. 이는 항체, HRP-컨쥬게이트, 분석판(96웰), 캘리브레이터, 세척 완충제(20x 농축), 기판 A, 기판 B, 및 정지 용액을 포함한다. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.
- 분석기를 시작하기 전에 모든 시약과 분석판을 실온(RT)으로 가져온다. 분석, 밀봉에 필요한 수의 웰을 사용하고 사용하지 않은 웰을 사용할 때까지 4°C로 유지합니다.
- 이중 증류수로 세척 버퍼(20x 농축액 15mL)를 300 mL로 희석
- 어떤 솔루션없이 빈 우물을 설정합니다.
- 표준 또는 시료 50 μL을 각 웰(n= 2)에 추가한 다음, 고추냉이 과산화아제(hrp)-컨쥬게이트를 각각 잘 에 추가합니다. 즉시 각 우물에 항체 용액의 또 다른 50 μL을 추가하십시오. 플레이트를 밀봉하고 잘 섞은 다음 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 1x 세척 버퍼(200 μL/well)로 우물을 씻고 4회 반복합니다.
- 기판 A와 기판 B의 50 μL을 각각 잘 추가하고 측면에 있는 플레이트를 부드럽게 눌러 잘 섞습니다. 접시를 밀봉하고 37 °C에서 15 분 동안 15 분 동안 배양하십시오.
- 각 우물에 50 μL의 스톱 솔루션을 추가하고, 부드럽게 플레이트를 탭하고, 450 nm 파장에 설정된 분광광도계를 사용하여 플레이트를 읽습니다.
- 소와 돼지 LH 수치를 총 단백질로 정상화합니다(섹션 6 참조).
5. 소와 돼지 VEGF-A 엘리사 분석
- 시판되는 혈관 내피 성장 인자-A ELISA 키트에 포함된 모든 ELISA 분석 성분을 2-8°C에서 저장합니다. 이는 항체, HRP-컨쥬게이트, 분석판(96웰), 캘리브레이터, 세척 완충제(20x 농축), 기판 A, 기판 B, 및 정지 용액을 포함한다. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.
- 분석기를 시작하기 전에 모든 시약 및 분석 판을 RT에 가져오십시오.
- 이중 증류수로 세척 버퍼(20x 농축액 15mL)를 300 mL로 희석
- 표준 또는 샘플의 100 μL을 각 우물에 추가합니다(n = 2). 플레이트를 밀봉하고 잘 섞은 다음 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 각 우물에서 액체를 제거하고 각 웰에 검출 시약 A의 100 μL을 추가하고, 플레이트를 밀봉하고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양한다.
- 1x 세척 버퍼(400 μL/well)로 우물을 씻고 4x를 반복합니다.
- 검출 시약 B의 100 μL을 각 우물에 추가하고 부드럽게 측면에 있는 플레이트를 눌러 잘 섞습니다. 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 1 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
- 1x 세척 버퍼(400 μL/well)로 우물을 씻고 4x를 반복합니다.
- 각 우물에 90 μL의 기판 용액을 추가하고, 플레이트를 부드럽게 두드리고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 각 우물에 50 μL의 스톱 솔루션을 추가하고, 부드럽게 플레이트를 탭하고, 450 nm 파장에 설정된 분광광도계를 사용하여 플레이트를 읽습니다.
- 소와 돼지 VEGF-A 수준을 총 단백질로 정상화하십시오 (섹션 6).
6. 총 단백질 추정
- 표준 소 혈청 알부민 (BSA) 분석법으로 소 및 돼지 신장 추출물의 총 단백질을 견적 상업용 키트를 사용하여 (재료 표참조) 제조업체의 권고에 따라.
7. 통계분석
- 각 매말단의 평균, 중앙값 및 표준 편차를 계산합니다.
- Kolmogorov-Smirnov 테스트를 활용하여 일반 샘플 분포의 차이를 테스트하여 사용 시 파라메트릭 과파라메트릭 간에 결정합니다. 비파라메트릭 통계 테스트. 데이터가 일반적으로 분산된 경우 파라메트릭 테스트를 통해 통계 테스트를 수행합니다.
- 적절한 상황(예: 정규 데이터 분포)에서는 회귀 모델을 사용하여 LH와 VEGF-A 간의 선형 관계를 검사합니다.
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Representative Results
동물 유형 및 성별에 따라 LH 및 VEGF의 평균 및 중간 수준은 표 1에나타내고 있습니다. Kolmogorov-Smirnov 의 정상성 테스트에 의한 데이터의 정상성을 확인한 후, 선형 회귀 모델을 활용하여 LH와 VEGF 간의 관계를 조사했습니다. LH는 소 및 돼지 신장 모두에서 VEGF의 강력하고 유의한 예측인자(소 신장 모델: n=7,R2 = 0.86, p=0.002; 돼지 신장 모델: n=7; R2 = 0.66, p = 0.025).
LH/VEGF 선형 관계는 도 1(소 회귀 모델) 및 도 2(돼지 회귀 모델)에 도시되어 있습니다. 소 선형 방정식은 다음과 같습니다: VEGF 레벨 = 2.156 x LH 레벨 + 68.75. 돼지 선형 방정식은 다음과 같습니다: VEGF 레벨 = 196.7 x LH 레벨 + 47.94.
| 샘플 유형 | 남성 | 여성 | 모든 |
| 소 신장 | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg 총 단백질) | 평균: 27.47 (SD 13.3) | 평균: 19.5 (SD 2.1) | 평균: 24.06 (SD 10.8) |
| 중앙값: 25.7 | 중앙값: 19.9 | 중앙값: 19.9 | |
| VEGF (pg/mg 총 단백질) | 평균: 126.2 (SD 25.8) | 평균: 106.0 (SD 14.5) | 평균: 120.6 (SD 25.1) |
| 중앙값: 131.6 | 중앙값: 103.5 | 중앙값: 110.8 | |
| 포르신 신장 | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg 총 단백질) | 평균: 13.2 (SD 3.6) | 평균: 12.3 (SD 5.5) | 평균: 12.8 (SD 4.5) |
| 중앙값: 13.6 | 중앙값: 10.3 | 중앙값: 11.2 | |
| VEGF (pg/mg 총 단백질) | 평균: 2987.2 (SD 772.5) | 평균: 2354.1 (SD 932.4) | 평균: 2715.9 (SD 901.0) |
| 중앙값: 3324.67 | 중앙값: 2377.3 | 중앙값: 3226.4 |
표 1: 동물 유형 및 성별에 의한 평균 및 중간 LH 및 VEGF 수준.
도 1: 성인 소 신장에서 LH/VEGF 선형 관계(n=7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 성인 돼지 신장에서 LH/VEGF 선형 관계(n=7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물 사망 직후 abattoir에서 신장을 조달하는 것이이 방법론에서 성공의 열쇠입니다. 이것은 인간의 시체 대신 소와 돼지에서 장기를 활용의 주요 장점입니다. 인간 시체 기관이 조달 될 때까지 일반적으로 죽음의 시간에서 적어도 12-24 시간 지연이 있다. 신체 기관의 화학적 조성이 2시간 이내에 크게 변화하기 때문에15,16,인간 시체 신장에서의 VEGF-연구는 실제 상황을 반영하지 않을 수 있다. 이 프로토콜은 추출 후 동물 장기를 얼음에 즉시 조달하고 배치하는 것의 중요성을 크게 강조하지만 다른 연구자도이 단계를 우선 순위를 지정하는지 알 수 없습니다. 예를 들어, 최근 연구의 방법론 섹션(항생제 잔류물의 검출을 위해 소 및 돼지 신장 활용)은 동물 사망과 장기의 조달/냉장 사이의 시간 지연을 지정하지 않았다17.
이 연구는 시판되는 종별 ELISA를 통해 관심 분야(VEGF 및 LH)를 측정합니다. ELISA는 매우 민감하고, 함께 평가를 수행하기 쉽고, 강력한 결과를 산출18. 프로토콜의 중요한 단계는 총 단백질에 의한 (ELISA 측정) 분석물 수준의 정상화입니다. 피질 신장 추출물은 매우 이질적인 생물학적 물질입니다. 이에 비추어, 동물 들 사이 검사 수 수준을 비교할 수 있도록 보정 계수 필수적 이다. 따라서, 총 단백질에 의해 정규화되어, 우리 및 다른 사람들이 다른 이질적인 생물학적 물질(즉, 소변, 말린 혈액 반점 및유리체 유체)을 동일한 방식으로 성공적으로 정규화했기 때문에9,19,20.
이전 연구는 유리체 유체에서 LH와 VEGF 사이의 상관 관계 (소와 돼지 눈에서)는 총 단백질6에의해 정상화 후 매니페스트 것으로 나타났다. 중요한 것은, 이러한 정상화 단계는 출판된 VEGF 연구에서, 특히 ELISA 분석과 관련된 연구에서 자주 생략된다. 대신, VEGF 수준은 종종 밀리 리터 당 피코그램 같은 단위로 표현 (그리고 총 단백질의 밀리 그램 당 피코그램으로). 예를 들어, 9개의 상이한 ELISA 연구(유리체 VEGF 검토 문서에 포함되었던)에서 유리체 VEGF 측정중 어느 것도 임의의 보정 방법21,22에의해 정규화되지 않았다. ELISA 연구에서 VEGF 정규화의 이 부족은 VEGF가 유효한 바이오마커21,22로아직 검증되지 않은 이유를 부분적으로 설명할 수 있다.
대표적인 데이터의 제한된 샘플 크기에도 불구하고(소, n=7; 돼지, n=7), 이 프로토콜은 소 및 돼지 신장 모두에서 LH와 VEGF 사이의 강력하고 유의한 선형 관계를 입증한다. 즉, 성별에 맞게 조정된 다변량 분석을 수행할 수 있는 충분한 샘플 크기가 없었습니다. 이러한 분석을 수행할 수 있도록 이 연구를 더 큰 샘플 크기로 반복할 계획입니다. 그럼에도 불구하고, 제시된 결과는 포유류 신장에서 LH와 VEGF 사이의 잠재적인 연관성을 뒷받침한다.
이 작품은 신장에서 VEGF의 시간정적 조절에 대한 이해를 한층 더 강화하는 데 도움이 될 것으로 기대된다. 이 방법론의 질과 결과의 견고성은 두 가지 다른 종의 결과의 재현성에 의해 설명됩니다. 육류 생산을 위한 동물은 건강하기 때문에 도축장 동물의 신장 추출물사용은 주로 생리학을 연구하기 위한 것입니다. 그러나, 그들의 기관은 그들의 사용의 주요 한계인 병리학을 공부하기 를 위해 보다 적게 도움이 됩니다. 모두 모두, 소와 돼지에서 신장 추출 물의 사용은 우수, 경제, 그리고 정상적인 성인 신장의 연구에 대 한 풍부한 자원. 마지막으로, 이 프로토콜은 특히 VEGF와 다른 분석물 간의 상관 관계를 조사할 때 정상화를 위해 총 단백질을 활용하는 효과를 보여줍니다.
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Disclosures
지츠치크 연구소(ZRI)는 민간(비영리) 연구 기관이며, 타미 모브사스 박사(ZRI의 설립자이자 이사)는 안구 질환 치료에 생식샘자극호르몬 길항제를 사용하기 위한 특허 출원 및 검증된 특허를 보유하고 있습니다. 당뇨병. ZRI의 직원(생화학자)이 되는 것 이외에, A. Muthusamy 박사는 보고할 다른 재정적 갈등이 없습니다. A. Arivalagan (ZRI에서 여름 인턴, 미시간 대학의 학부 학생) 보고 할 다른 재정적 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 소와 돼지 신장을 제공 에 대한 Scholl의 도살장 (블리스 필드, MI)에 감사드립니다. 이 연구에는 보조금이 사용되지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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