Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utnyttja en kortikal njure extrakt beredning och totalprotein normalisering för att demonstrera sambandet mellan vaskulär endotelial tillväxtfaktor och luteiniserande hormon i däggdjurs njure.
Abstract
Vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) hjälper till att kontrollera angiogenes och vaskulär permeabilitet i njuren. Njursjukdomar, såsom diabetesnefropati, är förknippade med VEGF dysreglering i njuren. De faktorer som styr VEGF under fysiologisk tillstånd i njuren är inte väl förstådda. Luteiniserande hormon (LH), ett proangiogent hormon, hjälper till att reglera fysiologisk VEGF-uttryck i reproduktionsorgan. Med tanke på att LH-receptorer finns i njuren, vi, på Zietchick Research Institute, hypotes här att LH hjälper också reglera VEGF uttryck i njuren samt. För att bevisa, syftade vi till att visa att LH-nivåer har möjlighet att förutsäga VEGF nivåer i däggdjurs njure. De flesta VEGF-relaterade undersökningar som involverar njuren har använt lägre ordning däggdjur som modeller (dvs gnagare och kaniner). För att översätta detta arbete till den mänskliga kroppen, beslutades det att undersöka förhållandet mellan VEGF och LH i högre ordning däggdjur (dvs., nötkreatur och svin modeller). Detta protokoll använder den totala proteinlysat från njurcortex. Nycklarna till denna metod framgång inkluderar anskaffning av njurar från slakteri djur omedelbart efter döden samt normalisering av analyt nivåer (i njure extraktet) av totalprotein. Denna studie visar framgångsrikt ett betydande linjärt samband mellan LH och VEGF i både nötkreatur och svin njurar. Resultaten är reproducerbara i två olika arter. Studien ger stödjande belägg för att användningen av njure extrakt från kor och grisar är en utmärkt, ekonomisk, och riklig resurs för studiet av njurfysiologi, särskilt för att undersöka sambandet mellan VEGF och andra analyter.
Introduction
Vaskulär endotelial tillväxtfaktor a (VEGF-a), hjälper till att reglera angiogenes och vaskulär permeabilitet i njurarna och andra organ1,2(hädanefter , VEGF-a kommer att kallas VEGF). VEGF-nivåerna i njuren är under stram homeostatisk kontroll. När renal VEGF-nivåerna är förhöjda eller deprimerade, kan njuren fungera dåligt. Till exempel, inom 3 veckor efter födseln, möss med podocyte-specifik heterozygosity för VEGF utveckla endotelios och blodfria glomeruli (dvs, njurlesioner ses i mänsklig preeclampsi), och slutstadiet njursvikt förekommer i dessa heterozygoter av 3 månaders ålder. Podocyte-specifika homozygotiska Knockouts dör från hydrops och njursvikt inom 1 födelse dagen3,4.
Å andra sidan, överuttryck av renal VEGF orsakar proteinuri och glomerulär hypertrofi3,4. Till exempel, transgena kaniner som överuttrycker VEGF uppvisar progressiv Proteinuri med ökad glomerulär filtrationshastighet i tidiga stadier av nefropati, följt av minskad glomerulär filtrationshastighet i senare steg3. Diabetesnefropati, en viktig orsak till slutstadiet njursjukdom hos diabetiker vuxna, är starkt förknippad med VEGF dysreglering2,5. En hel del uppmärksamhet har betalats till rollen av hypoxi att inducera VEGF uttryck under patologiska villkor5. Emellertid är faktorerna som reglerar VEGF under fysiologiskt villkorar (både i njure och andra organ) inte väl förstådda2,6. Att identifiera dessa faktorer (förutom syre) som är involverade i fysiologisk och patologisk VEGF-reglering är ett viktigt företag.
Luteiniserande hormon (LH), ett proangiogent hormon, hjälper till att reglera fysiologisk VEGF-uttryck i reproduktionsorgan som äggstockarna och testiklarna7,8. Tidigare studier har gett belägg för att LH också hjälper till att reglera VEGF i icke-reproduktionsorgan, såsom ögon6,9,10. LH-receptorer finns i medulla och cortex av njure11,12. Av anmärkning, njurtubulär epitelceller, samt LH-receptorn, Express VEGF11,12,13,14. Med dessa två observationer tillsammans, vi hypotesen att LH också hjälper till att reglera VEGF uttryck i njuren13,14. För att bevisa detta LH/VEGF-förhållande syftar det presenterade protokollet till att visa att LH-nivåerna kan förutsäga VEGF-nivåer i njuren. Många tidigare VEGF-relaterade utredningar som involverar njuren har använt lägre ordningens däggdjurs modeller (dvs gnagare och kaniner)2. För att översätta detta arbete till den mänskliga kroppen, undersöker studien förhållandet mellan VEGF och LH i högre ordning däggdjur (här, nötkreatur och svin modeller). För att genomföra detta mål, total proteinlysat utarbetades från cortex regionen av nötkreatur och svin njurar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Inga levande eller experimentella djur användes för denna studie.
1. vävnads hantering
- Upphandla hela njurarna av nötkreatur och svin omedelbart efter slakt från ett slakteri. Transport på is till laboratoriet.
- Vid ankomsten till laboratoriet, skölj njurarna med 50 mL iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa detta steg 2x för att ta bort blod helt.
- Håll njurarna på is (eller kyld) tills ytterligare extraktion.
2. dissektion av njurar
- Använd steril sax, pinps, en kniv och petriskålar att dissekera njurarna och punktskatter den erforderliga vävnaden portion.
- Förbered RIPA lysis buffert före njure dissektion. Lös 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% natriumdeoxycholat och 10% SDS i dubbeldestillerat vatten, blanda sedan noggrant. Kylskåp RIPA lyseringsbufferten när den inte används.
- Försiktigt skära njurarna i hälften (sagittal plan) och skär en bit vävnad (50-70 mm2) från cortex regionen i mitten av njuren (väger 80-100 mg av våt vikt).
- Finhacka vävnads blocket i små bitar med en kniv för att hjälpa homogeniseringsprocessen.
- Efter att ha malning vävnaderna, överföra dem till en mikrofugrör tub med 1 ml iskall 1x Ripa lysis extraktion buffert. Placera rören i is tills ytterligare extraktion.
3. vävnad homogenisering
- Märk mikrofugrör rören med specifika prov Detaljer för vävnad supernatanten samling.
- Med hjälp av en handhållen homogenisator med en steril sond, sedan homogenisera vävnaderna för 1-2 min i kallt tillstånd (prover på ishink) tills inga bitar av vävnader är synliga.
- Ämne vävnads extrakt omedelbart för centrifugering i den kylda centrifugen vid 9 600 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Ta bort rören från centrifugen och placera dem på isskopan.
- Samla supernatanten i en ny märkt mikrofugrör Tube och lagra på is. Kassera pelleten.
- Förbered separata alikvoter av samman supernatanterna för LH och VEGF-en enzymkopplad immunosorbent analyser (Elisa) och totalprotein analys, respektive, för att undvika frys-Tina cykler.
4. nötkreatur och svin LH ELISA-analys
- Förvara alla ELISA-analyskomponenter som ingår i det kommersiellt tillgängliga luteiniserande hormonet (LH) ELISA-Kit (se tabell över material) vid 2-8 ° c. Detta inkluderar antikroppen, HRP-konjugat, analys platta (96 brunn), kalibratorer, tvättbuffert (20x koncentrat), substrat A, substrat B och stopplösning. Förbered alla reagenser enligt tillverkarens anvisningar.
- Innan analysen påbörjas, ta med alla reagenser och analys platta till rumstemperatur (RT). Använd erforderligt antal brunnar för analysen, tätningen och förvara de oanvända brunnarna vid 4 ° c tills de används.
- Späd tvättbufferten (15 mL 20x koncentrat) till 300 mL med dubbeldestillerat vatten
- Ställ in de tomma brunnarna utan någon lösning.
- Tillsätt 50 μL av standard eller prov till varje brunn (n = 2), tillsätt sedan ytterligare 50 μL pepparrotperoxidas (HRP)-konjugat till varje brunn. Tillsätt omedelbart ytterligare 50 μL antikropps lösning till varje brunn. Försegla plattan, blanda väl, och inkubera i 1 h vid 37 ° c.
- Tvätta brunnarna med 1x tvättbuffert (200 μL/brunn) och upprepa 4x.
- Tillsätt 50 μL substrat A och 50 μL substrat B i varje brunn, och blanda väl genom att försiktigt knacka på plattan på sidan. Försegla plattan och inkubera i 15 min vid 37 ° c i mörker i 15 min.
- Tillsätt 50 μL stopplösning i varje brunn, knacka försiktigt på plattan och läsplattan med spektrofotometern inställd på en 450 nm våglängd.
- Normalisera LH-nivåerna av nötkreatur och svin till totalt protein (se avsnitt 6).
5. nötkreatur och svin VEGF-ELISA-test
- Förvara alla ELISA-analyskomponenter som ingår i den kommersiellt tillgängliga vaskulära endoteliala tillväxtfaktorn-ett ELISA-Kit (se tabell över material) vid 2-8 ° c. Detta inkluderar antikroppen, HRP-konjugat, analys platta (96 brunn), kalibratorer, tvättbuffert (20x koncentrat), substrat A, substrat B och stopplösning. Förbered alla reagenser enligt tillverkarens anvisningar.
- Innan analysen påbörjas, ta med alla reagenser och analys plattan till RT. Använd erforderligt antal brunnar för analysen, försegla, och förvara de oanvända brunnarna vid 4 ° c tills de används.
- Späd tvättbufferten (15 mL 20x koncentrat) till 300 mL med dubbeldestillerat vatten
- Tillsätt 100 μL av standarden eller provet till varje brunn (n = 2). Försegla plattan, blanda väl, och inkubera i 2 h vid 37 ° c.
- Ta bort vätskan i varje brunn och tillsätt 100 μL detekterings reagens A i varje brunn, försegla plattan och inkubera i 1 h vid 37 ° c.
- Tvätta brunnarna med 1x tvättbuffert (400 μL/brunn) och upprepa 4x.
- Tillsätt 100 μL detekterings reagens B i varje brunn och blanda väl genom att försiktigt knacka på plattan på sidan. Försegla plattan och inkubera plattan i 1 h vid 37 ° c.
- Tvätta brunnarna med 1x tvättbuffert (400 μL/brunn) och upprepa 4x.
- Tillsätt 90 μL substratlösning i varje brunn, knacka försiktigt på plattan och inkubera i 1 h vid 37 ° c.
- Tillsätt 50 μL stopplösning i varje brunn, knacka försiktigt på plattan och läsplattan med spektrofotometern inställd på en 450 nm våglängd.
- Normalisera nötkreatur och svin VEGF-en nivå till totalt protein (avsnitt 6).
6. total protein uppskattning
- Uppskatta totalt protein från nötkreatur och svin njure extrakt av standard bovint serum albumin (BSA) analys med hjälp av en kommersiell Kit (se tabell över material) enligt tillverkarens rekommendationer.
7. statistisk analys
- Beräkna medelvärdet, medianvärdet och standardavvikelsen för varje analyt.
- Testa skillnaderna i prov distribution från normal användning Kolmogorov-Smirnov test för att bestämma, vid användningen, mellan parametriska vs. icke-parametriska statistiska tester. Om data normalt distribueras ska du utföra statistiska tester via parametriska tester.
- Under lämpliga omständigheter (t. ex. normal Datadistribution), utnyttja regressionsmodeller för att undersöka det linjära sambandet mellan LH och VEGF-A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medel-och median nivåerna av LH och VEGF efter djurtyp och kön visas i tabell 1. Efter att ha kontrollerat normaliteten av data genom Kolmogorov-Smirnov testning av normalitet, var linjära regressionsmodeller utnyttjas för att undersöka sambandet mellan LH och VEGF. LH konstaterades vara en stark och signifikant prediktor för VEGF i både nötkreatur och svin njurar (bovin njure modell: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; svin njure modell: n = 7; R2 = 0,66, p = 0,025).
Det linjära förhållandet LH/VEGF illustreras i figur 1 (bovin regressionsmodell) och figur 2 (porcin regressionsmodell). Den bovin linjära ekvationen är följande: VEGF-nivå = 2,156 x LH-nivå + 68,75. Den porcin linjära ekvationen är följande: VEGF nivå = 196,7 x LH nivåer + 47,94.
| Exempel på typ | Män | Kvinnor | Alla |
| Bovint njurar | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg totalt protein) | Medelvärde: 27,47 (SD 13,3) | Medelvärde: 19,5 (SD 2,1) | Medelvärde: 24,06 (SD 10,8) |
| Median: 25,7 | Median: 19,9 | Median: 19,9 | |
| VEGF (PG/mg totalt protein) | Medelvärde: 126,2 (SD 25,8) | Medelvärde: 106,0 (SD 14,5) | Medelvärde: 120,6 (SD 25,1) |
| Median: 131,6 | Median: 103,5 | Median: 110,8 | |
| Svin njurar | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg totalt protein) | Medelvärde: 13,2 (SD 3,6) | Medelvärde: 12,3 (SD 5,5) | Medelvärde: 12,8 (SD 4,5) |
| Median: 13,6 | Median: 10,3 | Median: 11,2 | |
| VEGF (PG/mg totalt protein) | Medelvärde: 2987,2 (SD 772,5) | Medelvärde: 2354,1 (SD 932,4) | Medelvärde: 2715,9 (SD 901,0) |
| Median: 3324,67 | Median: 2377,3 | Median: 3226,4 |
Tabell 1: medel-och medianvärden för LH och VEGF efter djurtyp och kön.
Figur 1: linjärt förhållande mellan LH och VEGF hos vuxna bovint njurar (n = 7). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: linjärt förhållande mellan LH och VEGF hos vuxna svin njurar (n = 7). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att skaffa njurar från slakteriet omedelbart efter djurens död är nyckeln till framgång i denna metodik. Detta är den största fördelen med att utnyttja organ från kor och grisar i stället för mänskliga kadaver. Det finns vanligtvis minst en 12-24 h fördröjning från tidpunkten för döden tills mänskliga kadaver organ upphandlas. Eftersom den kemiska sammansättningen av kroppsliga organ avsevärt förändras inom 2 h post-mortem15,16, VEGF-studier i mänskliga kadaver njurar kan inte återspegla verkliga omständigheter. Även om protokollet kraftigt betonar vikten av omedelbar upphandling och placering av djurorgan på is efter extraktion, är det inte känt om andra forskare också prioritera detta steg. Till exempel, den metod avsnitt av en nyligen studie (som utnyttjar nötkreatur och svin njurar för detektion av antibiotikum rester) angav inte tidsfördröjningen mellan djurens död och upphandling/kylning av organ17.
Denna studie mäter analyterna av intresse (VEGF och LH) med kommersiellt tillgängliga, artspecifika ELISAs. ELISAs är mycket känsliga, enkla att utföra analyser med, och ger robusta resultat18. Ett kritiskt kliver i protokollet är normaliseringen av (ELISA-mätt) analytjämnar vid sammanlagt protein. Den kortikala njure extraktet är en mycket heterogen biologisk substans. Mot bakgrund av detta är en korrektionsfaktor väsentlig så att analytnivåerna kan jämföras mellan djuren. Sålunda, normaliserad av totalprotein utfördes, eftersom vi och andra har framgångsrikt normaliserat andra heterogena biologiska substanser (dvs., urin, torkade blodfläckar, och glaskroppen vätska) på samma sätt9,19,20.
En tidigare studie visade att sambandet mellan LH och VEGF i glaskroppen vätska (från nötkreatur och svin ögon) endast manifesteras efter normalisering av totalprotein6. Viktigt är att detta normaliserings steg ofta utelämnas i publicerade VEGF-studier, särskilt i de som involverar ELISA-analyser. Istället, VEGF nivåer uttrycks ofta i enheter såsom picogram per milliliter (och inte som picogram per milligram totalt protein). Till exempel, ingen av de glaskroppen VEGF mätningar i nio olika Elisa-studier (som ingick i en glahaltiga VEGF översyn artikel) var normaliserade med någon korrektions metod21,22. Denna brist på VEGF-normalisering i Elisa-studier kan delvis förklara varför VEGF ännu inte har verifierats som en giltig biomarkör21,22.
Trots den begränsade urvalsstorleken på de representativa uppgifterna (nötkreatur, n = 7, svin, n = 7), uppvisar detta protokoll ett starkt och signifikant linjärt samband mellan LH och VEGF i njurar från nötkreatur och svin. Som sagt, det fanns inte en tillräckligt stor provstorlek för att utföra multivariat analyser justerat för kön. Vi planerar att upprepa denna studie med större urvalsstorlekar så att sådana analyser kan utföras. Ändå, de presenterade resultaten stödja den potentiella kopplingen mellan LH och VEGF i däggdjurs njure.
Det förväntas att detta arbete kommer att bidra till att ytterligare förstå den homeostatiska regleringen av VEGF i njuren. Både kvaliteten på denna metodik och robustheten i resultaten illustreras av reproducerbarheten av resultaten i två olika arter. Eftersom djur avsedda för köttproduktion är hälsosamma, är användningen av njure extrakt från slakteri djur främst för att studera fysiologi; men, deras organ är mindre användbart för att studera patologi, som är den huvudsakliga begränsningen av deras användning. Allt som allt, användningen av njurextrakt från kor och grisar är en utmärkt, ekonomisk, och riklig resurs för studiet av normala vuxna njurar. Slutligen, protokollet visar effektiviteten av att använda totalt protein för normalisering, särskilt när man undersöker korrelationer mellan VEGF och andra analyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zietchick Research Institute (ZRI) är en privat (för-vinstdrivande) forskningsinstitut, och Dr Tammy Movsas (grundare och chef för ZRI) har en pågående patentansökningar och validerade patent för användning av koriongonadotropin antagonister vid behandling av ögonsjukdomar och diabetes. Förutom att vara en anställd (biokemist) på ZRI, har Dr. A. Muthusamy inga andra ekonomiska konflikter att rapportera. A. Arivalagan (sommar praktikant på ZRI, grundutbildningsstudent vid University of Michigan) har inga andra ekonomiska konflikter att rapportera.
Acknowledgments
Författarna tackar Scholl ' s slakteri (Blissfield, MI) för att tillhandahålla nötkreatur och svin njurar. Ingen bidragsfinansiering utnyttjades för denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
