Summary
Presentert her er en protokoll for å utnytte en kortikale nyre ekstrakt forberedelse og total protein normalisering å demonstrere sammenhengen mellom vaskulær endothelial vekstfaktor og luteiniserende hormon i pattedyr nyre.
Abstract
Vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) bidrar til å kontrollere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrene. Nyre sykdommer, som diabetisk nefropati, er forbundet med VEGF feilregulering i nyrene. Faktorene som regulerer VEGF under fysiologiske forhold i nyrene er ikke godt forstått. Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogenic hormon, bidrar til å regulere fysiologiske VEGF uttrykk i reproduktive organer. Gitt at LH reseptorer er funnet i nyrene, vi, ved Zietchick Research Institute, hypotetisk gjennomsnitt her at LH også bidrar til å regulere VEGF uttrykk i nyre også. For å gi bevis, hadde vi som mål å vise at LH nivåene er i stand til å forutsi VEGF nivåer i pattedyr nyre. De fleste VEGF-relaterte undersøkelser som involverer nyrene har brukt lavere orden pattedyr som modeller (dvs. gnagere og kaniner). For å oversette dette arbeidet til menneskekroppen, ble det besluttet å undersøke forholdet mellom VEGF og LH i høyere orden pattedyr (dvs. storfe og svin modeller). Denne protokollen bruker den totale protein lysat fra nyre barken. Nøkler til denne metoden suksess inkluderer anskaffelse av nyrer fra slakteri dyr umiddelbart etter døden, samt normalisering av analytt nivåer (i nyre ekstrakt) av total protein. Denne studien demonstrerer vellykket en betydelig lineær sammenheng mellom LH og VEGF i både storfe og svin nyrer. Resultatene er reproduserbar i to forskjellige arter. Studien gir støtte bevis for at bruk av nyre ekstrakter fra kyr og griser er en utmerket, økonomisk og rikelig ressurs for studiet av nyre fysiologi, spesielt for å undersøke sammenhengen mellom VEGF og andre analytter.
Introduction
Vaskulær endothelial vekstfaktor A (VEGF-a), bidrar til å regulere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrene og andre organer1,2 (heretter, VEGF-a vil bli referert til som VEGF). VEGF nivåer i nyrene er under stram homøostatisk kontroll. Når nyre VEGF nivåer er forhøyet eller deprimert, nyre kan funksjonsfeil. For eksempel, innen 3 uker etter fødselen, mus med podocyte-spesifikke heterozygosity for VEGF utvikle endotheliosis og ublodig glomeruli (dvs. nyre lesjoner sett i Human preeclampsia), og slutt-stadium nyresvikt oppstår i disse heterozygotes av 3 måneders alder. Podocyte-spesifikke heterozygot Knockouts dø av hydrops og nyresvikt innen 1 dag etter fødselen3,4.
På den annen side, overuttrykte av nyre VEGF forårsaker proteinuri og glomerulær hypertrofi3,4. For eksempel, transgene kaniner som overekspresjon VEGF utstillingen progressive proteinuri med økt glomerulær filtrering priser i tidlige stadier av nefropati, etterfulgt av redusert glomerulær filtrering priser i senere stadier3. Diabetisk nefropati, en viktig årsak til sluttfasen nyresykdom hos diabetiker voksne, er sterkt assosiert med VEGF feilregulering2,5. Mye oppmerksomhet har blitt betalt til rollen som hypoksi i inducing VEGF uttrykk under patologisk forhold5. Men de faktorene som regulerer VEGF under fysiologiske forhold (både i nyre og andre organer) er ikke godt forstått2,6. Identifisere disse faktorene (med unntak av oksygen) som er involvert i fysiologiske og patologisk VEGF regulering er en viktig oppgave.
Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogenic hormon, hjelper regulere fysiologiske VEGF uttrykk i reproduktive organer som eggstokken og testikkel7,8. Tidligere studier har gitt bevis for at LH også bidrar til å regulere VEGF i ikke-reproduktive organer, slik som øynene6,9,10. LH reseptorer finnes i forlengede og cortex av nyrene11,12. Av notatet, nyre rørformede epitelceller, så vel som LH reseptor, Express VEGF11,12,13,14. Ved å ta disse to observasjonene sammen, hypotetisk gjennomsnitt vi at LH også bidrar til å regulere VEGF uttrykk i nyrene13,14. For å gi bevis på dette LH/VEGF forholdet, har den presenterte protokollen som mål å vise at LH nivåer er i stand til å forutsi VEGF nivåer i nyrene. Mange tidligere VEGF-relaterte undersøkelser som involverer nyrene har brukt lavere orden pattedyr modeller (dvs. gnagere og kaniner)2. For å oversette dette arbeidet til menneskekroppen, undersøker studien forholdet mellom VEGF og LH i høyere orden pattedyr (her, storfe og svin modeller). For å gjennomføre dette målet, total protein lysat ble fremstilt fra cortex regionen av storfe og svin nyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ingen levende eller eksperimentelle dyr ble brukt til denne studien.
1. håndtering av vev
- Anskaffe storfe og svin hele nyrer umiddelbart etter slakting fra en for slakterier. Transport på is til laboratoriet.
- Ved ankomst på laboratoriet, skyll nyrene med 50 mL av iskald fosfat bufret saltvann (PBS). Gjenta dette trinnet 2x for å fjerne blod helt.
- Hold nyrene på isen (eller nedkjølt) til videre ekstraksjon.
2. Disseksjon av nyrer
- Bruk sterile saks, tang, en kniv, og Petri retter å analysere nyrene og forbruksavgift den nødvendige vev delen.
- Klargjør RIPA lyseringsbuffer før nyre disseksjon. Løs opp 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% natrium natriumdeoksykolat og 10% SDS i dobbelt destillert vann, og bland deretter godt. Avkjøl RIPA lyse buffer når den ikke er i bruk.
- Skjær forsiktig nyrene i to (sagittal fly) og skjære et stykke vev (50-70 mm2) fra cortex-regionen i midten av nyrene (veiing 80-100 mg av våt vekt).
- Hakke vevet blokken i små biter med en kniv for å bistå homogenisering prosessen.
- Etter hakking av vevet, Overfør dem til et microfuge rør med 1 mL iskald 1x RIPA lyse avsugs buffer. Plasser rørene i isen til videre ekstraksjon.
3. tissue homogenisering
- Merk microfuge rørene med spesifikke prøve detaljer for vevs supernatanten samling.
- Ved hjelp av en håndholdt homogenisator med en steril sonde, deretter homogenisere vevet for 1-2 min i kalde forhold (prøver på is bøtte) til ingen biter av vev er synlige.
- Subject vevet ekstrakter umiddelbart for sentrifugering i nedkjølt sentrifuge ved 9 600 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Fjern rørene fra sentrifuger og plassere dem på isen bøtte.
- Samle supernatanten i en ny merket microfuge tube og lagre på isen. Kast pellet.
- Forbered separate alikvoter av supernatanter for LH og VEGF-A enzym-koblet immunosorbentanalyse analyser (ELISA) og total proteinanalyse, henholdsvis for å unngå fryse-tine sykluser.
4. storfe og svin LH ELISA analysen
- Oppbevar alle ELISA-analysen komponenter inkludert i kommersielt tilgjengelige luteiniserende hormon (LH) ELISA Kit (se tabell av materialer) ved 2-8 ° c. Dette inkluderer antistoff, HRP-bøy, analyse plate (96 brønn), kalibratorer, vaskebuffer (20x konsentrat), substrat A, substrat B og stopp løsning. Klargjør alle reagenser som anbefalt av produsentens instruksjoner.
- Før du starter analysen, må du ta med alle reagenser og analyse platen til romtemperatur (RT). Bruk det nødvendige antall brønner for analysen, forsegle og holde de ubrukte brønnene ved 4 ° c til bruk.
- Fortynne vaske bufferen (15 mL 20x konsentrat) til 300 mL med dobbel destillert vann
- Sett opp tomme brønner uten noen løsning.
- Tilsett 50 μL av standard eller prøve til hver brønn (n = 2), deretter legge til en annen 50 μL av pepperrot peroksidase (HRP)-bøye til hver brønn. Umiddelbart legge til en annen 50 μL av antistoff løsning til hver brønn. Forsegle platen, bland godt, og ruge for 1 t ved 37 ° c.
- Vask brønnene med 1x vaskebuffer (200 μL/brønn) og gjenta 4X.
- Tilsett 50 μL av substrat A og 50 μL av substrat B til hver brønn, og bland godt ved å trykke på platen på siden forsiktig. Forsegle platen og ruge i 15 min ved 37 ° c i mørket i 15 min.
- Tilsett 50 μL stopp løsning på hver brønn, trykk forsiktig på platen, og Les platen med spektrofotometer satt til en 450 nm bølgelengde.
- Normalisere storfe og svin LH nivåer til total protein (se pkt. 6).
5. storfe og svin VEGF-A ELISA analysen
- Oppbevar alle ELISA-analysen komponenter inkludert i kommersielt tilgjengelige vaskulær endothelial vekstfaktor-A ELISA kits (se tabell av materialer) ved 2-8 ° c. Dette inkluderer antistoff, HRP-bøy, analyse plate (96 brønn), kalibratorer, vaskebuffer (20x konsentrat), substrat A, substrat B og stopp løsning. Klargjør alle reagensene som anbefalt av produsentens instruksjoner.
- Før du starter analysen, må du ta med alle reagenser og analyse platen til RT. Bruk det nødvendige antall brønner for analysen, forsegle og oppbevar ubrukte brønner ved 4 ° c til bruk.
- Fortynne vaske bufferen (15 mL 20x konsentrat) til 300 mL med dobbel destillert vann
- Tilsett 100 μL av standarden eller prøven til hver brønn (n = 2). Forsegle platen, bland godt, og ruge for 2 t ved 37 ° c.
- Fjern væsken i hver brønn og tilsett 100 μL av deteksjon reagens A til hver brønn, forsegle platen og ruge for 1 time ved 37 ° c.
- Vask brønnene med 1x vaskebuffer (400 μL/brønn) og gjenta 4X.
- Tilsett 100 μL av deteksjon reagens B til hver brønn og bland godt ved å trykke på platen på siden forsiktig. Forsegle platen og ruge platen i 1 time ved 37 ° c.
- Vask brønnene med 1x vaskebuffer (400 μL/brønn) og gjenta 4X.
- Tilsett 90 μL av substrat løsning på hver brønn, trykk forsiktig på platen og ruge for 1 time ved 37 ° c.
- Tilsett 50 μL stopp løsning på hver brønn, trykk forsiktig på platen, og Les platen med spektrofotometer satt til en 450 nm bølgelengde.
- Normalisere storfe og svin VEGF-A nivåer til total protein (avsnitt 6).
6. total protein estimering
- Beregn total protein av storfe og svin nyre ekstrakter av standard blod serum albumin (BSA) analysen ved hjelp av en kommersiell Kit (se tabell over materialer) i henhold til produsentens anbefalinger.
7. statistisk analyse
- Beregn middelverdi, median og standardavvik for hver analytt.
- Test forskjellene i prøve fordelingen fra normal bruk Kolmogorov-Smirnov test for å bestemme, etter bruk, mellom parametrisk vs. ikke-parametriske statistiske tester. Hvis data er normalt distribueres, deretter utføre statistisk testing via parametriske tester.
- Under egnede forhold (for eksempel normal datadistribusjon), bruke regresjon modeller for å undersøke den lineære forholdet mellom LH og VEGF-A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennomsnittlig og median nivå av LH og VEGF av dyr type og kjønn er vist i tabell 1. Etter verifisere normalitet av data ved Kolmogorov-Smirnov testing av normalitet, lineær regresjon modeller ble benyttet for å undersøke forholdet mellom LH og VEGF. LH ble funnet å være en sterk og signifikant indikasjon på VEGF i både storfe og svin nyrer (storfe nyre modell: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; svin nyre modell: n = 7; R2 = 0,66, p = 0,025).
LH/VEGF lineære forhold er illustrert i figur 1 (storfe regresjon modell) og figur 2 (svin regresjon modell). Den lineære ligningen for storfe er som følger: VEGF Level = 2,156 x LH nivå + 68,75. Den svin lineære ligningen er som følger: VEGF Level = 196,7 x LH nivåer + 47,94.
| Eksempel type | Menn | Kvinner | Alle |
| Storfe nyrer | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg totalt protein) | Gjennomsnitt: 27,47 (SD 13,3) | Gjennomsnitt: 19,5 (SD 2,1) | Gjennomsnitt: 24,06 (SD 10,8) |
| Median: 25,7 | Median: 19,9 | Median: 19,9 | |
| VEGF (PG/mg totalt protein) | Gjennomsnitt: 126,2 (SD 25,8) | Gjennomsnitt: 106,0 (SD 14,5) | Gjennomsnitt: 120,6 (SD 25,1) |
| Median: 131,6 | Median: 103,5 | Median: 110,8 | |
| Svin nyrer | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg totalt protein) | Gjennomsnitt: 13,2 (SD 3,6) | Gjennomsnitt: 12,3 (SD 5,5) | Gjennomsnitt: 12,8 (SD 4,5) |
| Median: 13,6 | Median: 10,3 | Median: 11,2 | |
| VEGF (PG/mg totalt protein) | Gjennomsnitt: 2987,2 (SD 772,5) | Gjennomsnitt: 2354,1 (SD 932,4) | Gjennomsnitt: 2715,9 (SD 901,0) |
| Median: 3324,67 | Median: 2377,3 | Median: 3226,4 |
Tabell 1: Mean og median LH og VEGF nivåer av dyr type og kjønn.
Figur 1: LH/VEGF lineær sammenheng i nyrene i storfe (n = 7). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: LH/VEGF lineær relasjon i voksen svin nyrer (n = 7). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anskaffelse nyrer fra for slakterier umiddelbart etter at dyret død er nøkkelen til suksess i denne metodikken. Dette er den største fordelen med å utnytte organer fra kyr og griser i stedet for menneskelig levningene. Det er vanligvis minst en 12-24 h forsinkelse fra tidspunktet for dødsfallet til menneskelige Cadaver organer er anskaffet. Fordi den kjemiske sammensetningen av kroppslige organer betydelig endringer innen 2 h etter obduksjon15,16, VEGF-studier i Human Cadaver nyrer kan ikke gjenspeile virkelige omstendigheter. Selv om protokollen sterkt understreker viktigheten av umiddelbare anskaffelser og plassering av dyre organer på isen etter ekstraksjon, er det ikke kjent om andre forskere også prioritere dette trinnet. For eksempel, metodikken delen av en fersk studie (utnytte storfe og svin nyrer for påvisning av antibiotika rester) ikke spesifisere tidsforsinkelsen mellom dyr død og anskaffelse/nedkjøling av organene17.
Denne studien måler analytter av interesse (VEGF og LH) med kommersielt tilgjengelige, arter-spesifikke ELISAs. ELISAs er svært følsomme, enkle å utføre analyser med, og gir robuste resultater18. Et kritisk trinn i protokollen er normalisering av (ELISA-målt) analytt nivåer av total protein. Den kortikale nyre ekstrakt er en svært heterogen biologisk substans. I lys av dette, er en korreksjon faktor avgjørende slik at analytt nivåer kan sammenlignes mellom dyr. Dermed ble normalisert av total protein utført, siden vi og andre har lykkes normalisert andre heterogene biologiske stoffer (dvs., urin, tørkede blod flekker, og glasslegemet væske) på samme måte9,19,20.
En tidligere studie viste at sammenhengen mellom LH og VEGF i glasslegemet væske (fra storfe og svin øyne) bare manifesterer etter normalisering av totalt protein6. Viktigere er dette normalisering trinnet ofte utelatt i publiserte VEGF studier, spesielt i de som involverer ELISA analyser. I stedet, VEGF nivåer er ofte uttrykt i enheter som picogram per milliliter (og ikke som picogram per milligram av totalt protein). For eksempel, ingen av glasslegemet VEGF målinger i ni forskjellige Elisa studier (som var inkludert i en glasslegemet VEGF Review artikkel) ble normalisert av noen korreksjon metode21,22. Denne mangelen på VEGF normalisering i Elisa studier kan delvis forklare hvorfor VEGF ennå ikke er bekreftet som en gyldig biomarkør21,22.
Til tross for den begrensede utvalgsstørrelsen av representative data (storfe, n = 7; svin, n = 7), denne protokollen demonstrerer en sterk og betydelig lineær sammenheng mellom LH og VEGF i både storfe og svin nyrer. Når det er sagt, var det ikke en stor nok utvalgsstørrelse til å utføre multivariabel analyser justert for kjønn. Vi planlegger å gjenta denne studien med større utvalgsstørrelser, slik at slike analyser kan utføres. Likevel, de presenterte resultatene støtte den potensielle tilknytningen mellom LH og VEGF i pattedyr nyre.
Det forventes at dette arbeidet vil bidra til å fremme forståelsen av homøostatisk regulering av VEGF i nyrene. Både kvaliteten på denne metodikken og robusthet av funnene er illustrert ved reproduserbarhet av resultatene i to forskjellige arter. Fordi dyr bestemt for kjøttproduksjon er sunt, bruk av nyre ekstrakter fra slakteri dyr er primært for å studere fysiologi; men deres organer er mindre nyttig for å studere patologi, som er den viktigste begrensningen av deres bruk. Alt i alt, bruk av renal ekstrakter fra kyr og griser er en utmerket, økonomisk og rikelig ressurs for studiet av normal voksen nyrer. Til slutt demonstrerer protokollen effektiviteten ved å utnytte total protein for normalisering, spesielt når man undersøker sammenhenger mellom VEGF og andre analytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zietchick Research Institute (ZRI) er en privat (for-profit) forskningsinstitutt, og Dr. Tammy Movsas (grunnlegger og direktør for ZRI) har en ventende patentsøknader og validert patenter for bruk av gonadotropin motstandere i behandlingen av øyesykdommer og diabetes. Annet enn å være en ansatt (biokjemiker) på ZRI, har Dr. A. Muthusamy ingen andre økonomiske konflikter å rapportere. A. Arivalagan (sommer lærling ved ZRI, Undergraduate student ved University of Michigan) har ingen andre økonomiske konflikter å rapportere.
Acknowledgments
Forfatterne takker Scholl ' s slakteri (Blissfield, MI) for å gi storfe og svin nyrer. Ingen tilskuddsmidler ble benyttet for denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N.
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
