Summary
Aquí se presenta un protocolo para la utilización de una preparación de extracto renal cortical y la normalización total de proteínas para demostrar la correlación entre el factor de crecimiento endotelial vascular y la hormona luteinizante en el riñón de mamífero.
Abstract
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ayuda a controlar la angiogénesis y la permeabilidad vascular en el riñón. Los trastornos renales, como la nefropatía diabética, se asocian con la desregulación del VEGF en el riñón. Los factores que rigen el VEGF bajo condiciones fisiológicas en el riñón no se entienden bien. La hormona luteinizante (LH), una hormona pro-angiogénica, ayuda a regular la expresión fisiológica de VEGF en los órganos reproductivos. Dado que los receptores de LH se encuentran en el riñón, nosotros, en el Instituto de Investigación Zietchick, hipotetizó aquí que LH también ayuda a regular la expresión de VEGF en el riñón también. Para proporcionar evidencia, nuestro objetivo era demostrar que los niveles de LH son capaces de predecir los niveles de VEGF en el riñón de mamíferos. La mayoría de las investigaciones relacionadas con el VEGF relacionadas con el riñón han utilizado mamíferos de orden inferior como modelos (es decir, roedores y conejos). Para traducir este trabajo al cuerpo humano, se decidió examinar la relación entre VEGF y LH en mamíferos de mayor orden (es decir, modelos bovinos y porcinos). Este protocolo utiliza el lisado total de proteína de la corteza renal. Las claves del éxito de este método incluyen la adquisición de riñones de animales de matadero inmediatamente después de la muerte, así como la normalización de los niveles de analito (en el extracto renal) por proteína total. Este estudio demuestra con éxito una relación lineal significativa entre LH y VEGF en los riñones bovino y porcino. Los resultados son reproducibles en dos especies diferentes. El estudio proporciona evidencia de apoyo de que el uso de extractos renales de vacas y cerdos son un recurso excelente, económico y abundante para el estudio de la fisiología renal, particularmente para examinar la correlación entre el VEGF y otros analitos.
Introduction
El factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), ayuda a regular la angiogénesis y la permeabilidad vascular en el riñón y otros órganos1,2 (en adelante, el VEGF-A se denominará VEGF). Los niveles de VEGF en el riñón están bajo un estricto control homeostático. Cuando los niveles de VEGF renal son elevados o deprimidos, el riñón puede funcionar mal. Por ejemplo, dentro de las 3 semanas después del nacimiento, los ratones con heterocigosidad específica de podocitos para el VEGF desarrollan endotelisis y glomérulos sin sangre (es decir, lesiones renales que se ven en la preeclampsia humana), y la insuficiencia renal terminal se produce en estos heterocigotos a los 3 meses de edad. Los noqueos homocigoticos específicos de los podocitos mueren a causa de los hispé y la insuficiencia renal dentro de 1 día del nacimiento3,4.
Por otro lado, la sobreexpresión del VEGF renal causa proteinuria e hipertrofia glomerular3,4. Por ejemplo, los conejos transgénicos que sobreexpresan el VEGF presentan proteinuria progresiva con mayores tasas de filtración glomerular en las primeras etapas de nefropatía, seguidas de la disminución de las tasas de filtración glomerular en etapas posteriores3. La nefropatía diabética, una de las principales causas de la enfermedad renal terminal en adultos diabéticos, está fuertemente asociada con la desregulación VEGF2,5. Se ha prestado mucha atención al papel de la hipoxia en la inducción de la expresión VEGF en condiciones patológicas5. Sin embargo, los factores que rigen el VEGF en condiciones fisiológicas (tanto en el riñón como en otros órganos) no se entienden bien2,6. Identificar estos factores (excepto el oxígeno) que están involucrados en la regulación fisiológica y patológica del VEGF es una empresa importante.
La hormona luteinizante (LH), una hormona pro-angiogénica, ayuda a regular la expresión fisiológica de VEGF en órganos reproductivos como el ovario y testis7,8. Estudios anteriores han proporcionado evidencia de que LH también ayuda a regular el VEGF en órganos no reproductivos, como los ojos6,9,10. Los receptores LH se encuentran en la médula y la corteza del riñón11,12. Cabe destacar que las células epiteliales tubulares renales, así como el receptor LH, expresa VEGF11,12,13,14. Tomando estas dos observaciones juntas, hipotetizó que LH también ayuda a regular la expresión de VEGF en el riñón13,14. Para proporcionar evidencia de esta relación LH/VEGF, el protocolo presentado tiene como objetivo mostrar que los niveles de LH son capaces de predecir los niveles de VEGF en el riñón. Muchas investigaciones anteriores relacionadas con el VEGF relacionadas con el riñón han utilizado modelos de mamíferos de orden inferior (es decir, roedores y conejos)2. Para traducir este trabajo al cuerpo humano, el estudio examina la relación entre VEGF y LH en mamíferos de mayor orden (aquí, modelos bovinos y porcinos). Para llevar a cabo este objetivo, se preparó un lisato proteico total a partir de la región de la corteza de los riñones bovino y porcino.
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Protocol
No se utilizaron animales vivos o experimentales para este estudio.
1. Manejo de tejidos
- Procurar riñones enteros bovinos y porcinos inmediatamente después del sacrificio de un matadero. Transporte en hielo al laboratorio.
- A su llegada al laboratorio, enjuague los riñones con 50 ml de solución salina tamponada de fosfato helado(a) con fosfato helado. Repita este paso 2x para eliminar la sangre por completo.
- Mantenga los riñones en hielo (o refrigerados) hasta su posterior extracción.
2. Disección de riñones
- Use tijeras estériles, fórceps, un cuchillo y platos de Petri para diseccionar los riñones e extirpar la porción de tejido requerida.
- Prepare el tampón de lisis RIPA antes de la disección renal. Disolver 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH a 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% desoxicolato de sodio y 10% SDS en agua de doble destilación, luego mezclar a fondo. Refrigere el búfer de lisis RIPA cuando no esté en uso.
- Cortar suavemente el riñón por la mitad (plano sagital) y cortar un pedazo de tejido (50-70 mm2) de la región de la corteza en el centro del riñón (con un peso de 80-100 mg en peso húmedo).
- Picar el bloque de tejido en trozos pequeños con un cuchillo para ayudar al proceso de homogeneización.
- Después de picar los tejidos, transferirlos a un tubo de microfúgecona con 1 ml de tampón de extracción de lisis RIPA 1x en frío. Coloque los tubos en hielo hasta su posterior extracción.
3. Homogeneización de tejidos
- Etiquete los tubos de microfúcya con detalles específicos de la muestra para la recolección de sobrenadantes de tejido.
- Usando un homogeneizador portátil con una sonda estéril, luego homogeneiza los tejidos durante 1-2 minutos en condiciones frías (muestras en cubo de hielo) hasta que no haya trozos de tejidos visibles.
- Sujeto los extractos de tejido inmediatamente para centrifugación en la centrífuga refrigerada a 9.600 x g durante 5 min a 4 oC.
- Retire los tubos de la centrífuga y colóquelos en el cubo de hielo.
- Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de microfófuga etiquetado y almacenar en hielo. Deseche el pellet.
- Preparar alícuotas separadas de los sobrenatantes para los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas LH y VEGF-A (ELISA) y el análisis total de proteínas, respectivamente, para evitar ciclos de congelación-descongelación.
4. Ensayo Bovino y Porcino LH ELISA
- Almacene todos los componentes del ensayo ELISA incluidos en el kit ELISA de la hormona luteinizante (LH) disponible comercialmente (ver Tabla de materiales)a 2-8 oC. Esto incluye el anticuerpo, conjugado HRP, placa de ensayo (96 pozo), calibradores, tampón de lavado (concentrado 20x), sustrato A, sustrato B y solución de parada. Prepare todos los reactivos según lo recomendado por las instrucciones del fabricante.
- Antes de iniciar el ensayo, lleve todos los reactivos y la placa de ensayo a temperatura ambiente (RT). Utilice el número necesario de pozos para el ensayo, el sello y mantenga los pozos no utilizados a 4 oC hasta su uso.
- Diluir el tampón de lavado (15 ml de concentrado de 20x) a 300 ml con agua destilada doble
- Configure los pozos en blanco sin ninguna solución.
- Añadir 50 l de estándar o muestra a cada pocto (n a 2), luego añadir otros 50 l de peroxidasa de rábano picante (hrp)-conjugado a cada pocto. Inmediatamente añadir otros 50 l de solución de anticuerpos a cada poca. Sellar la placa, mezclar bien e incubar durante 1 h a 37oC.
- Lavar los pozos con 1 tampón de lavado (200 l/pozo) y repetir 4 veces.
- Añadir 50 s de sustrato A y 50 l de sustrato B a cada poca, y mezclar bien tocando suavemente la placa en el lado. Sellar la placa e incubar durante 15 min a 37oC en la oscuridad durante 15 min.
- Añadir 50 l de solución de tope a cada pocal, tocar suavemente la placa y leer la placa utilizando el espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 450 nm.
- Normalizar los niveles de LH bovina y porcina a proteína total (ver sección 6).
5. Ensayo Bovino y Porcino VEGF-A ELISA
- Almacene todos los componentes del ensayo ELISA incluidos en los kits ELISA de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular-A disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales)a 2-8 oC. Esto incluye el anticuerpo, conjugado HRP, placa de ensayo (96 pozo), calibradores, tampón de lavado (concentrado 20x), sustrato A, sustrato B y solución de parada. Prepare todos los reactivos según lo recomendado por las instrucciones del fabricante.
- Antes de iniciar el ensayo, lleve todos los reactivos y la placa de ensayo a RT. Utilice el número necesario de pozos para el ensayo, el sello y mantenga los pozos no utilizados a 4 oC hasta su uso.
- Diluir el tampón de lavado (15 ml de concentrado de 20x) a 300 ml con agua destilada doble
- Añadir 100 l de la norma o muestra a cada pocto (n x 2). Sellar la placa, mezclar bien e incubar durante 2 h a 37oC.
- Retirar el líquido en cada pocal y añadir 100 s de reactivo de detección A a cada poca, sellar la placa e incubar durante 1 h a 37 oC.
- Lavar los pozos con 1 tampón de lavado (400 l/pozo) y repetir 4 veces.
- Añadir 100 s de reactivo de detección B a cada pocto y mezclar bien tocando suavemente la placa en el lado. Sellar la placa e incubar la placa durante 1 h a 37oC.
- Lavar los pozos con 1 tampón de lavado (400 l/pozo) y repetir 4 veces.
- Añadir 90 ml de solución de sustrato a cada pocal, toque suavemente la placa e incubar durante 1 h a 37 oC.
- Añadir 50 l de solución de tope a cada pocal, tocar suavemente la placa y leer la placa utilizando el espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 450 nm.
- Normalizar los niveles de VEGF-A bovina y porcina a proteína total (sección 6).
6. Estimación total de proteínas
- Estimar la proteína total de los extractos renales bovinos y porcinos mediante el ensayo estándar de albúmina sérica bovina (BSA) utilizando un kit comercial (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
7. Análisis estadístico
- Calcule la media, la mediana y la desviación estándar de cada analito.
- Probar la divergencia de la distribución de la muestra de la aplicación normal utilizando Kolmogorov-Smirnov Test para decidir, en el uso, entre paramétrico vs. pruebas estadísticas no paramétricas. Si los datos se distribuyen normalmente, realice pruebas estadísticas a través de pruebas paramétricas.
- En circunstancias apropiadas (como la distribución normal de datos), utilice modelos de regresión para examinar la relación lineal entre LH y VEGF-A.
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Representative Results
Los niveles medios y medios de LH y VEGF por tipo de animal y por sexo se muestran en la Tabla 1. Después de verificar la normalidad de los datos por Kolmogorov-Smirnov Prueba de normalidad, se utilizaron modelos de regresión lineal para examinar la relación entre LH y VEGF. Se encontró que la LH era un predictor fuerte y significativo de VEGF tanto en los riñones bovinos como en los porcinos (modelo renal bovino: n a 7, R2 a 0,86, p a 0,002; modelo renal porcino: n a 7; R2 a 0,66, p a 0,025).
La relación lineal LH/VEGF se ilustra en la Figura 1 (modelo de regresión bovina) y en la Figura 2 (modelo de regresión porcina). La ecuación lineal bovina es la siguiente: nivel de VEGF a 2.156 x nivel LH + 68.75. La ecuación lineal porcina es la siguiente: nivel de VEGF a 196,7 x niveles lh + 47,94.
| Tipo de muestra | Machos | Hembras | todo |
| Riñón bovino | n 4 | n a 3 | n a 7 |
| LH (proteína total mUI/mg) | Media: 27,47 (SD 13.3) | Media: 19,5 (SD 2.1) | Media: 24,06 (SD 10,8) |
| Mediana: 25,7 | Mediana: 19,9 | Mediana: 19,9 | |
| VEGF (proteína total pg/mg) | Media: 126.2 (SD 25.8) | Media: 106.0 (SD 14.5) | Media: 120.6 (SD 25.1) |
| Mediana: 131.6 | Mediana: 103,5 | Mediana: 110.8 | |
| Riñón porcino | n 4 | n a 3 | n a 7 |
| LH (proteína total mUI/mg) | Media: 13,2 (SD 3.6) | Media: 12,3 (SD 5.5) | Media: 12,8 (SD 4.5) |
| Mediana: 13,6 | Mediana: 10,3 | Mediana: 11.2 | |
| VEGF (proteína total pg/mg) | Media: 2987.2 (SD 772.5) | Media: 2354.1 (SD 932.4) | Media: 2715.9 (SD 901.0) |
| Mediana: 3324.67 | Mediana: 2377.3 | Mediana: 3226.4 |
Tabla 1: Niveles medios y medios de LH y VEGF por tipo de animal y sexo.
Figura 1: Relación lineal LH/VEGF en riñones bovinos adultos (n.o 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Relación lineal LH/VEGF en riñones porcinos adultos (n.o 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La adquisición de riñones del matadero inmediatamente después de la muerte animal es la clave del éxito en esta metodología. Esta es la principal ventaja de utilizar órganos de vacas y cerdos en lugar de cadáveres humanos. Por lo general, hay al menos un retraso de 12-24 h desde el momento de la muerte hasta que se adquieren los órganos de cadáveres humanos. Debido a que la composición química de los órganos corporales cambia significativamente dentro de 2 h post-mortem15,16, estudios de VEGF en riñones cadáveres humanos pueden no reflejar circunstancias de la vida real. Aunque el protocolo hace hincapié en gran medida en la importancia de la adquisición inmediata y la colocación de órganos animales en el hielo después de la extracción, no se sabe si otros investigadores también priorizan este paso. Por ejemplo, la sección de metodología de un estudio reciente (utilizando riñones bovinos y porcinos para la detección de residuos de antibióticos) no especificaba el retraso temporal entre la muerte animal y la adquisición/refrigeración de los órganos17.
Este estudio mide los analitos de interés (VEGF y LH) con ELISA específicas de especies disponibles comercialmente. Los ELISA son altamente sensibles, fáciles de realizar ensayos con, y producen resultados robustos18. Un paso crítico en el protocolo es la normalización de los niveles de analito (medidos por ELISA) por proteína total. El extracto renal cortical es una sustancia biológica altamente heterogénea. A la luz de esto, un factor de corrección es esencial para que los niveles de analito se puedan comparar entre animales. Así, se realizó la normalización por proteína total, ya que nosotros y otros hemos normalizado con éxito otras sustancias biológicasheterogéneas (es decir, orina, manchas de sangre seca y líquido vítreo) de la misma manera9,19,20.
Un estudio previo mostró que la correlación entre LH y VEGF en el líquido vítreo (de los ojos bovinos y porcinos) sólo se manifiesta después de la normalización por proteína total6. Es importante destacar que este paso de normalización se omite con frecuencia en los estudios VEGF publicados, especialmente en aquellos que involucran ensayos ELISA. En su lugar, los niveles de VEGF a menudo se expresan en unidades como picograma por mililitro (y no como picograma por miligramo de proteína total). Por ejemplo, ninguna de las mediciones vítreas de VEGF en nueve estudios ELISA diferentes (que se incluyeron en un artículo de revisión vítreo VEGF) se normalizó mediante ningún método de corrección21,22. Esta falta de normalización de VEGF en los estudios ELISA puede explicar parcialmente por qué veGF aún no se ha verificado como un biomarcador válido21,22.
A pesar del limitado tamaño de la muestra de los datos representativos (bovino, n a 7; porcino, n a 7), este protocolo demuestra una relación lineal fuerte y significativa entre LH y VEGF en los riñones bovino y porcino. Dicho esto, no había un tamaño de muestra lo suficientemente grande como para realizar análisis multivariados ajustados por género. Planeamos repetir este estudio con tamaños de muestra más grandes para que se puedan realizar dichos análisis. Sin embargo, los resultados presentados apoyan la posible asociación entre LH y VEGF en el riñón de mamíferos.
Se espera que este trabajo ayude a comprender aún más la regulación homeostática del VEGF en el riñón. Tanto la calidad de esta metodología como la robustez de los hallazgos se ilustran por la reproducibilidad de los resultados en dos especies diferentes. Debido a que los animales destinados a la producción de carne son saludables, el uso de extractos renales de animales de matadero es principalmente para estudiar la fisiología; sin embargo, sus órganos son menos útiles para el estudio de la patología, que es la principal limitación de su uso. En total, el uso de extractos renales de vacas y cerdos son un recurso excelente, económico y abundante para el estudio de los riñones adultos normales. Por último, el protocolo demuestra la eficacia de la utilización de proteína sortea total para la normalización, especialmente cuando se examinan correlaciones entre el VEGF y otros analitos.
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Disclosures
Zietchick Research Institute (ZRI) es un instituto de investigación privado (con fines de lucro), y la Dra. Tammy Movsas (fundadora y directora de ZRI) tiene una solicitud de patente pendiente y patentes validadas para el uso de antagonistas de la gonadotropina en el tratamiento de enfermedades oculares y la diabetes. Aparte de ser un empleado (bioquímico) en ZRI, el Dr. A. Muthusamy no tiene otros conflictos financieros que reportar. A. Arivalagan (pasante de verano en ZRI, estudiante de pregrado en la Universidad de Michigan) no tiene otros conflictos financieros que reportar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al matadero de Scholl (Blissfield, MI) por proporcionar los riñones bovino y porcino. No se utilizó financiación de subvenciones para este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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