Summary

Разработка Ларвал Зебрафиш Инфекция Модель Clostridioides difficile

Published: February 14, 2020
doi:

Summary

Представленный здесь безопасный и эффективный метод заражения личинок зебры флуоресцентно помечены анаэробных C. difficile микроинъекции и неинвазивных микрогаважа.

Abstract

Clostridioides difficile инфекции (CDI) считается одним из наиболее распространенных медицинских связанных желудочно-кишечных инфекций в Соединенных Штатах. Врожденный иммунный ответ против C. difficile был описан, но точные роли нейтрофилов и макрофагов в CDI менее понятны. В текущем исследовании, Личинки Данио рерио (зебрафиш) используются для создания модели C. difficile инфекции для визуализации поведения и сотрудничества этих врожденных иммунных клеток in vivo. Для мониторинга C. difficileустановлен протокол маркировки с использованием флуоресцентного красителя. Локализованная инфекция достигается путем микроинъекций с пометкой C. difficile, которая активно растет в желудочно-кишечном тракте зебры и имитирует повреждение эпителиального кишечника в CDI. Однако, этот прямой протокол инфекции является инвазивным и вызывает микроскопические раны, которые могут повлиять на экспериментальные результаты. Таким образом, здесь описан более неинвазивный протокол микрогаважа. Метод включает в себя доставку C. difficile клеток непосредственно в кишечнике личинок зебры путем интубации через открытый рот. Этот метод инфекции тесно имитирует естественный путь инфекции C. difficile.

Introduction

C. difficile является грамположительный, спорообразующих, анаэробных и токсинопроизводящих бацилл, что является основной причиной тяжелых инфекций в желудочно-кишечном тракте1. Типичные симптомы CDI включают диарею, боли в животе, и смертельный псевдомембранный колит, и это иногда может привести к смерти1,2. Фактические данные показали, что иммунные реакции хозяина играют решающую роль как в прогрессировании, так и в исходе этого заболевания3. В дополнение к иммунному ответу, коренная микрофлора кишечника имеет решающее значение для начала и патогенеза CDI4. За последнее десятилетие, как число случаев заболевания, так и смертность от CDI значительно возросли из-за появления гипервирулентного штамма C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Более глубокое понимание основных иммунных механизмов и роли микробиоты во время CDI поможет привести к новым терапевтическим изменениям и достижениям, что позволит лучше контролировать эту эпидемию.

Несколько животных моделей, таких как хомяк и мышь, были разработаны, чтобы обеспечить понимание иммунной защиты от C. difficile7,8. Тем не менее, роль врожденных иммунных клеток все еще плохо понимается, тем более, что врожденное поведение иммунных клеток в основном происходит от гистологического анализа или культивированных клеток in vitro. Таким образом, создание прозрачной модели зебры, чтобы выявить врожденный иммунный ответ на C. difficile внутри живого позвоночного организма будет способствовать таким исследованиям. Личинки зебрафиш имеют функциональную врожденную иммунную систему, но им не хватает адаптивной иммунной системы до 4-6 недель после оплодотворения9. Эта уникальная особенность делает личинки зебры отличной моделью для изучения изолированной реакции и функции врожденных иммунных клеток в CDI.

В настоящем докладе описаны новые методы использования личинок зебры для изучения взаимодействий между C. difficile и врожденными иммунными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы. Во-первых, представлен локализованный протокол микроинъекций, который включает C. difficile inoculum и окрашивание. При использовании in vivo конфокальной визуализации покадровой прослеживание, реакция нейтрофилов и макрофагов на место заражения фиксируется, а также наблюдается фагоцитоз бактерий нейтрофилов и макрофагов. Тем не менее, было сообщено, что сама инъекция вызывает повреждение тканей и приводит к набору лейкоцитов независимо от бактерий10. Таким образом, неинвазивный протокол микрогаважа для доставки C. difficile в кишечнике личинок зебры впоследствии описывается. Предыдущие исследования показали, что коренная микрофлора желудочно-кишечного тракта защищает хозяина от колонизации C. difficile11. Таким образом, гнотобиотические личинки зебры также используются для предрасположенности зебры, которые инфицированы 12. После этого проводится вскрытие кишечника для восстановления жизнеспособного C. difficile и проверки продолжительности их присутствия в желудочно-кишечных трактах зебры.

Protocol

Все описанные здесь работы на животных выполнялись в соответствии с правовыми нормами (EU-Directive 2010/63, лицензия АЗ 325.1.53/56.1-TUBS и лицензия АЗ 33.9-42502-04-14/1418). 1. Подготовка низкорасплавляющихся агароуз, гель плиты, и микроинъекции / микрогаважских игл Растворите 0,08 г низкорас…

Representative Results

C. difficile строго анаэробный, но хромофор флуоресцентных белков обычно требует кислорода, чтобы созреть. Чтобы преодолеть эту проблему, флуоресцентный краситель был использован для окрашива тькоцита C. difficile клеток, которые активно росли (R20291, штамм риботипа 027; Рисунок…

Discussion

Представленные методы изменить и расширить существующий подход к заражению личинок зебры, выполняя как инъекции и микрогаваж10,14. Он также демонстрирует подход к изучению анаэробных патогенов с личинками зебры22. Кроме того, протокол облегча…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Тимо Фричу за отличный уход за животными. Мы благодарим сотрудников лабораторий Кёстер и Штайнерт за поддержку и полезные обсуждения. Мы благодарим доктора Дандана Хана за критическое чтение рукописи. Мы с благодарностью признательны за финансирование со стороны федеральной штата Нижняя Саксония, Nieders’chsisches Вораб (ВВЗН2889).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A2576 Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM) Pronadisa 8050 It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain Thermo Fisher Scientific B35001 Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth Carl Roth GmbH X916.1
Brass (wild-type) deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396
Capillary Glass Harvard Apparatus 30-0019 Injection needles
Clostridioides difficile R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO Carl Roth GmbH A994
FIJI open-source platform Image processing
HEPES Carl Roth GmbH 6763
Horizontal needle puller Sutter instrument Inc P-87
L-cysteine Sigma-Aldrich 168149
Leica Application Suite X (LAS X) Leica Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth GmbH P026
Micro injector eppendorf 5253000017
Microinjection molds Adaptive Science Tools TU1
Leica SP8 confocal microscope Leica
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH 5346
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth GmbH 9265
Taurocholate Carl Roth GmbH 8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Yeast extract BD Bacto 212750

References

  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Play Video

Cite This Article
Li, J., Ünal, C. M., Namikawa, K., Steinert, M., Köster, R. W. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (156), e60793, doi:10.3791/60793 (2020).

View Video