Представленный здесь безопасный и эффективный метод заражения личинок зебры флуоресцентно помечены анаэробных C. difficile микроинъекции и неинвазивных микрогаважа.
Clostridioides difficile инфекции (CDI) считается одним из наиболее распространенных медицинских связанных желудочно-кишечных инфекций в Соединенных Штатах. Врожденный иммунный ответ против C. difficile был описан, но точные роли нейтрофилов и макрофагов в CDI менее понятны. В текущем исследовании, Личинки Данио рерио (зебрафиш) используются для создания модели C. difficile инфекции для визуализации поведения и сотрудничества этих врожденных иммунных клеток in vivo. Для мониторинга C. difficileустановлен протокол маркировки с использованием флуоресцентного красителя. Локализованная инфекция достигается путем микроинъекций с пометкой C. difficile, которая активно растет в желудочно-кишечном тракте зебры и имитирует повреждение эпителиального кишечника в CDI. Однако, этот прямой протокол инфекции является инвазивным и вызывает микроскопические раны, которые могут повлиять на экспериментальные результаты. Таким образом, здесь описан более неинвазивный протокол микрогаважа. Метод включает в себя доставку C. difficile клеток непосредственно в кишечнике личинок зебры путем интубации через открытый рот. Этот метод инфекции тесно имитирует естественный путь инфекции C. difficile.
C. difficile является грамположительный, спорообразующих, анаэробных и токсинопроизводящих бацилл, что является основной причиной тяжелых инфекций в желудочно-кишечном тракте1. Типичные симптомы CDI включают диарею, боли в животе, и смертельный псевдомембранный колит, и это иногда может привести к смерти1,2. Фактические данные показали, что иммунные реакции хозяина играют решающую роль как в прогрессировании, так и в исходе этого заболевания3. В дополнение к иммунному ответу, коренная микрофлора кишечника имеет решающее значение для начала и патогенеза CDI4. За последнее десятилетие, как число случаев заболевания, так и смертность от CDI значительно возросли из-за появления гипервирулентного штамма C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Более глубокое понимание основных иммунных механизмов и роли микробиоты во время CDI поможет привести к новым терапевтическим изменениям и достижениям, что позволит лучше контролировать эту эпидемию.
Несколько животных моделей, таких как хомяк и мышь, были разработаны, чтобы обеспечить понимание иммунной защиты от C. difficile7,8. Тем не менее, роль врожденных иммунных клеток все еще плохо понимается, тем более, что врожденное поведение иммунных клеток в основном происходит от гистологического анализа или культивированных клеток in vitro. Таким образом, создание прозрачной модели зебры, чтобы выявить врожденный иммунный ответ на C. difficile внутри живого позвоночного организма будет способствовать таким исследованиям. Личинки зебрафиш имеют функциональную врожденную иммунную систему, но им не хватает адаптивной иммунной системы до 4-6 недель после оплодотворения9. Эта уникальная особенность делает личинки зебры отличной моделью для изучения изолированной реакции и функции врожденных иммунных клеток в CDI.
В настоящем докладе описаны новые методы использования личинок зебры для изучения взаимодействий между C. difficile и врожденными иммунными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы. Во-первых, представлен локализованный протокол микроинъекций, который включает C. difficile inoculum и окрашивание. При использовании in vivo конфокальной визуализации покадровой прослеживание, реакция нейтрофилов и макрофагов на место заражения фиксируется, а также наблюдается фагоцитоз бактерий нейтрофилов и макрофагов. Тем не менее, было сообщено, что сама инъекция вызывает повреждение тканей и приводит к набору лейкоцитов независимо от бактерий10. Таким образом, неинвазивный протокол микрогаважа для доставки C. difficile в кишечнике личинок зебры впоследствии описывается. Предыдущие исследования показали, что коренная микрофлора желудочно-кишечного тракта защищает хозяина от колонизации C. difficile11. Таким образом, гнотобиотические личинки зебры также используются для предрасположенности зебры, которые инфицированы 12. После этого проводится вскрытие кишечника для восстановления жизнеспособного C. difficile и проверки продолжительности их присутствия в желудочно-кишечных трактах зебры.
Представленные методы изменить и расширить существующий подход к заражению личинок зебры, выполняя как инъекции и микрогаваж10,14. Он также демонстрирует подход к изучению анаэробных патогенов с личинками зебры22. Кроме того, протокол облегча…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Тимо Фричу за отличный уход за животными. Мы благодарим сотрудников лабораторий Кёстер и Штайнерт за поддержку и полезные обсуждения. Мы благодарим доктора Дандана Хана за критическое чтение рукописи. Мы с благодарностью признательны за финансирование со стороны федеральной штата Нижняя Саксония, Nieders’chsisches Вораб (ВВЗН2889).
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
FIJI | open-source platform | Image processing | |
HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Yeast extract | BD Bacto | 212750 |