Summary
Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.
Abstract
Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın sağlık ilişkili gastrointestinal enfeksiyonlardan biri olarak kabul edilir. C. difficile karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanımlanmıştır, ancak CDI nötrofiller ve makrofajlar tam rolleri daha az anlaşılmaktadır. Mevcut çalışmada, Danio rerio (zebrabalığı) larvaları in vivo bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin davranış ve işbirliği görüntüleme için bir C. difficile enfeksiyon modeli oluşturmak için kullanılır. C. difficileizlemek için, floresan boya kullanılarak bir etiketleme protokolü kurulmuştur. Lokalize enfeksiyon, zebra balığı nın bağırsak sisteminde aktif olarak yetişen ve CDI'deki intestinal epitel hasarı taklit eden C. difficile etiketli mikroenjeksiyon ile elde edilir. Ancak, bu doğrudan enfeksiyon protokolü invaziv ve deneysel sonuçları etkileyebilir mikroskobik yaralar, neden olur. Bu nedenle, daha noninvaziv bir mikrogavage protokolü burada açıklanmıştır. Yöntem açık ağız yoluyla entübasyon yoluyla doğrudan zebrabalığı larvaları bağırsak içine C. difficile hücrelerinin teslim içerir. Bu enfeksiyon yöntemi yakından C. difficiledoğal enfeksiyon rotasını taklit eder.
Introduction
C. difficile bir gram-pozitif, spor oluşturan, anaerobik, ve gastrointestinal sistemde ciddi enfeksiyonların önde gelen nedeni dir toksin üreten bacillus1. CDI tipik belirtileri ishal dahil, karın ağrısı, ve ölümcül psödomembranöz kolit, ve bazen ölüme yol açabilir1,2. Kanıtlar, konak immün yanıtların bu hastalığın hem ilerlemesinde hem de sonuçlarında kritik bir rol oynadığını göstermiştir3. Bağışıklık yanıtına ek olarak, yerli bağırsak mikrobiyota başlangıcı ve CDI patogenezi için çok önemlidir4. Son on yılda, c. difficile (BI/NAP1/027)5,6hipervirulent suşu ortaya çıkması nedeniyle olgu ların sayısı ve CDI mortalite oranı önemli ölçüde artmıştır. Altta yatan bağışıklık mekanizmaları ve CDI sırasında mikrobiyota rolünün daha iyi anlaşılması yeni terapötik gelişmelere ve gelişmelere yol açacaktır, Bu salgının daha iyi kontrol sağlayan.
Hamster ve fare gibi çeşitli hayvan modelleri, C. difficilekarşıbağışıklık savunma içine fikir sağlamak için geliştirilmiştir7 ,8. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin rolü hala kötü anlaşılmaktadır, özellikle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışı ağırlıklı olarak histolojik analiz veya in vitro kültürlü hücrelerden türetilmiştir beri. Bu nedenle, canlı bir omurgalı organizmanın içinde C. difficile doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak için şeffaf bir zebrabalığı modeli kurulması bu tür çalışmaları kolaylaştıracaktır. Zebra balığı larvaları fonksiyonel doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahiptir, ancak döllenmeden 4-6 hafta sonraya kadar adaptif bağışıklık sistemiyoktur. Bu benzersiz özellik zebra balığı larvaları CDI izole yanıt ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model yapar.
Bu rapor, makrofajlar ve nötrofiller gibi C. difficile ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için zebra balığı larvaları kullanarak yeni yöntemler açıklamaktadır. İlk olarak, C. difficile inokül ve boyama içeren lokalize bir mikroenjeksiyon protokolü sunulmuştur. İn vivo konfokal zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak nötrofillerin ve makrofajların enfeksiyon bölgesine tepkisi kaydedilir ve nötrofiller ve makrofajlar tarafından bakterilerin fagositozisi gözlenir. Ancak, enjeksiyon kendisi doku hasarına neden olduğu bildirilmiştir ve bakteri bağımsız lökosit işe yol açar10. Bu nedenle, zebrabalığı larvalarının bağırsağı içine C. difficile teslim etmek için noninvaziv bir mikrogavaj protokolü daha sonra açıklanmıştır. Önceki çalışmalar yerli gastrointestinal mikrobiyota C. difficile11kolonizasyonuna karşı bir konak korumak göstermiştir. Bu nedenle, gnotobiyotik zebra balığı larvaları da enfekte zebra balığı yatkınlık için kullanılır 12. Daha sonra, bağırsak diseksiyonu uygun C. difficile kurtarmak ve zebrabalığı bağırsak larında varlığının süresini doğrulamak için yapılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan işleri yasal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (AB Direktifi 2010/63, lisans AZ 325.1.53/56.1-TUBS ve lisans AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Düşük Eritme Agarose, Jel Levha ve Mikroenjeksiyon/Mikrogavaj İğnelerinin Hazırlanması
- 0.08 g düşük eriyen agarose(Malzeme Tablosu, agarose A2576) 10 mL danieau'nun orta (0.12 mM MgSO4, 0.18 mM Ca [NO3]2), 0.21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) ve 17,4 mM NaCl, oda sıcaklığında (RT) %0,8 çözelti elde etmek için depolanır.
NOT: Agarose'un daha yüksek veya daha düşük konsantrasyonları kullanılabilir. Ancak, katılaşmak için gerekli zaman agarose farklı markalar için değişir, aynı konsantrasyonda bile. - Cam kılcal damarlardan mikroenjeksiyon ve mikrogavaj iğneleri hazırlayın(Malzeme Tablosu).
- Aşağıdaki ayarlara sahip bir mikropipet çekmecesi kullanın (birimlerin burada kullanılan çekmeceye özel olduğunu unutmayın; bkz. Malzeme Tablosu):mikroenjeksiyon iğneleri (hava basıncı = 500; ısı = 400; pull = 125; hız = 75; zaman = 150); ve mikrogavaj iğneleri (hava basıncı = 500; ısı = 400; çekme = 100; hız = 75; zaman = 150). Çekilen iğneye 3 μL nükleaz içermeyen H2O yüklemek için mikroyükleyici ucu kullanın.
- İğneyi enjektöre tanıtın ve düzgün bir şekilde bağlayın. İğneyi enjeksiyon için uygun bir açıya ayarlayın. Mikroenjeksiyon iğnesi için 600-900 hPa, gavaj iğnesi için 200-300 hPa arasında enjeksiyon basıncını ayarlayın.
- Kalibrasyon kaydırağının siyah halkasının üzerine bir damla mineral yağ yerleştirin. İğnenin ucunu kesmek için ince terpler kullanın. Damlacık boyutunu ölçmek için mineral yağ içine bir damla enjekte.
- Mikroenjeksiyon için enjeksiyon süresini 0,10-0,12 mm çapında, 0,5-1,0 nL hacmine eşit olan bir damlacık elde etmek için ayarlayın. Mikrogavaj için, çapı 0,18-0,20 mm olan ve 3-5 nL hacmine eşit olan bir damlacık elde edin.
- Mikrogavaj kalıp olarak plastik bir kalıp kullanarak% 30 Danieau's orta 10 cm Petri çanak agarose(Malzeme Tablosu, 8050) ile% 1.5 agarose plaka hazırlayın. İhtiyaç duyulana kadar kurumasını önlemek için 4 °C'de saklayın. Deneyden önce RT veya 28 °C'ye sıcak.
2. Floresan Boya ile C. difficile ve Sporların Hazırlanması ve Etiketlemesi
- Floresan boyanın 1 mM stok çözeltisi(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Boya 50 μg toz halinde satıldığı için, 1 mM stok konsantrasyonu elde etmek için şişeye 69 μL DMSO ekleyin.
- Floresan boyanın 100 μM çalışma çözeltisini, 18 μL DMSO'ya santrifüj tüpüne 2 μL'lik 1 mM stok çözeltisi ekleyerek hazırlayın ve iyice karıştırın.
- Kültür C. difficile (R20291, bir riboztip 027 zorlanma) bir gecede sallayarak olmadan bir anaerobik başlık bir plaka iki ila üç kolonileri ile BHIS sıvı orta 10 mL aşılayarak. BHIS BHI ile desteklenmektedir 0.5% (w / v) maya ekstresi ve 0.1% (w / v) L-sistein. 1 g L-sistein 10 mL ddH2O ve filtrasyon ile sterilize 1 g çözün, sonra otoklavlama önce orta 15 g / L agar-agar ekleyerek hazırlanan 1 g / L. Plakalar son konsantrasyon elde etmek için otoklavlı ortama ekleyin. C. difficile seçici culturing kromID C. difficile plakaları kullanılarak yapılır (Malzeme Tablosu).
- Floresan boya ile Boyama C. difficile
- Hasat C. difficile 1.0-1.2 bir OD600 ve 1 x 1x 1x PBS (5.000 x g RT 3 dakika için) ile yıkayın. 1 x PBS 1 mL resuspend.
- Floresan boyanın 3 μL'lik çalışma solüsyonu1 mL bakteri süspansiyonuna ekleyin. Karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca numuneyi kuluçkaya yatırın. Lekeli C. difficile'ı 1 mL PBS ile yıkayın ve 1x PBS'de 1.0'ın OD600'üne geri alın (1.0 OD600 yaklaşık 108 cfu/mL'ye eşdeğerdir).
3. Boyalı C. Enjeksiyon zebrabalığı Larvaları içine difficile
- Döllenme sonrası 5 gün 20-30 zebra balığı larvasını (burada 5 dpf olarak anılacaktır) %0,02-0,04 triain (trikotin tozu çift distile suda çözülür ve pH = 7'ye 1 M Tris-HCL çözeltisi ile ayarlanır) %30 Danieau'nun orta ~10 dk önce Enjeksiyon. Anestezili larvaları taze 10 cm Petri kabına aktarın ve danieau'nun orta sını %30'dan çıkarın.
- Kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları yanal konuma hafifçe ayarlayın. Petri kabını 30-60 s'lik buz üzerine yerleştirin ve düşük eriyen agarose'un katılaşmasını bekleyin. Agarose kapsayacak şekilde% 0.02-0.04% tricaine içeren% 30 Danieau's orta ekleyin.
- Enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Enjeksiyon işlemini görselleştirmek için PBS çözeltisine %0,5 fenol kırmızısı ilave edin.
- Bir microloader kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin ve stereomikroskop altında yerleştirin.
- Enjeksiyon basıncını 600-900 hPa arasında ayarlayın. 0.5-1.0 nL elde etmek için enjeksiyon süresini 0.1-0.3'e ayarlayın. İğneyi mikromanipülatöre gömülü larvaları gösteren ~45° açıyla ayarlayın.
- İğne ucunu ürogenital gözeneğe yakın gastrointestinal sistem üzerine yerleştirin. Pierce agarose ile sonra iğne ucu ile kas, sonra bağırsak lümen içine takın ve C. difficile0.5-1.0 nL enjekte . Enjekte edilen larvaları izlemek ve konfokal görüntüleme için düzgün enjekte edilen larvaları almak için floresan mikroskobu kullanın.
4. Gnotobiyotik Zebrabalığı Larvalarının Üretimi
- Gnotobiyotik zebra balığı embriyoları oluşturmak için köklü doğal üreme yöntemini kullanın, dahil: in vitro fertilizasyon, antibiyotik içeren orta ile yıkama (1 μg/mL amphotericin B, 10 μg/mL kanamisin, ve 20 μg/mL ampisilin), %0.1 wt/vol polivinil piroliyodone-iyot (PVP-I) çözeltisi ile yıkama ve hücre kaputkültüründe embriyoların kuluçka12.
- 5 dpf kadar veya gavaj hemen öncesine kadar gnotobiyotik koşullar altında tüm gnotobiyotik zebra balığı larvaları koruyun. Gavajdan sonra, zebra balığı larvaları standart bir kuluçka makinesine aktarılacak ama steril %30 Danieau'nun orta sı.
5. Zebrabalığı Larvalarının Gavajı
- Adım 1.2'de açıklandığı gibi mikrogavaj iğnesini kalibre edin.
- İğneyi bir damla mineral yağla kalibrasyon kaydırağının üzerine yerleştirerek iğnenin ucunun çapını ölçün. Ucun 30-40 μm çapında, künt ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Keskin veya pürüzlü iğneleri atın.
NOT: İğnelerin keskin kenarları hızlı alev alınarak köreltilebilir. - 3.3. adımda açıklandığı gibi gavaj çözeltisini hazırlayın.
- 3.4 adımda açıklandığı gibi iğneyi bir mikromanipülatöre yükleyin ve monte edin. İğneyi 45° açıyla konumlandıracak şekilde mikromanipülörü ayarlayın.
- Adım 3.1'de bahsedilen zebra balığı larvalarını anestezi edin. Larvalar hareket etmeyi bıraktığında, pasteur pipeti kullanarak onları bir mikrogavaj kalıbının oluğuna aktarın.
- Kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları, olukta 45° açılarda dik bakacak şekilde larvaları ve kuyrukları oluğun duvarına doğru yavaşça ayarlayın. Kafaların açılarının yaklaşık olarak aynı olduğundan emin olun, böylece gavaj iğnelerinin açısıyla hizalanırlar. Mikrogavaj kalıbını 30-60 s'lik buzüzerine yerleştirin ve larvaların pozisyonlarını dengelemek için düşük eriyen agarose'un katılamasını bekleyin.
- Enjeksiyon basıncını 200-300 hPa arasında ayarlayın. Enjeksiyon süresini 0.1-0.3 s olarak ayarlın ve 3-5 nL C. difficile enjeksiyon hacmi elde edin.
- İğneyi agarose'dan sonra da yemek borusundan zebra balığı larvalarının ağzına doğru yavaşça çalıştırın. İğneucu ön bağırsak ampul içinde bir kez, bakteri serbest bırakmak için enjeksiyon pedalına basın. Verilen hacim ile bağırsak lümendoldurun. Yemek borusundan veya cloaca'dan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından yavaşça çekin.
- Gavaj'ı takiben, enfekte zebra balığı larvalarını önce agarose'u keserek sonra larvaları kaldırarak esnek bir mikroloader ucu yla agarose'dan kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun orta sına aktarın. Larvaları steril ortamda iki kez durula. Larvaları 10 cm'lik taze petri kabına aktarın. Larvalar 11 dpf'ye kadar muhafaza edilecektir.
6. Enjekte Edilen Zebrabalığı Larvalarının Konfokal Mikroskopi Analizi
- Anestezi zebra balığı larvaları adım 3.1'e atıfta bulundu. Görüntüleme odası olarak adlandırılan deliğe bağlı bir cam slayt ile 35 mm Petri kabının altında bir delik yapın. Embriyoları görüntüleme odasının altına %30 Danieau'nun orta aracı ile aktarın.
- Anestezili larvaları kapsayacak şekilde %1 düşük erime agarose'un 200-300 μL'sini ekleyin. Ters konfokal mikroskop kullanıldığından, larvaların enfekte bölgesini mümkün olduğunca yakından cam kaydırağından yakınlaştırın.
- Agarose 30-60 s.% 30 Danieau's içeren% 0.02-0.04% tricaine ile agarose batırmak için buz üzerinde katılaşmak sağlar.
- Bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile larvagörüntü (Malzeme Tablosu).
7. Canlı C. difficile kurtarmak için Larva Zebrabalığı Bağırsak Diseksiyon
- Bakteriyel yükü analiz etmek için larvalardan gastrointestinal yolları izole edin. Zebra balığı larvalarını %0,4 tricaine ile ötenazi yaparak başlayın.
- Zebra balığını steril 1x PBS ile kısa bir süre durulayın ve taze bir agarose plakaya aktarın.
- Zebra balığının diseksiyonu
- Zebra balığı hareketsizleştirmek için kafaya yakın zebrabalık larvalarının sırt gövdesine bir iğne yerleştirin. Bir mızrak ile solungaçları arkasındaki baş çıkarın.
- İkinci iğneyi sırt gövdesinin ortasına takın. Zebra balığının karnına üçüncü iğneyi yerleştirin ve bağırsakları vücut boşluğundan çekin.
NOT: Bozulmamış bağırsağın izole edilmesi için aşırı özen gerekir. Bunu yapmak zor ise, kalan iç organlardan bağırsak geri kalanı ayırmak için ek çeker gerçekleştirin. - 10-15 bağırsağı 1x PBS'nin 200 μL steril içeren 1,5 mL'lik tüpüne aktarmak için mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.
- Dokuyu bozmak ve homojenleri hazırlamak için bağırsakları bir zararlı ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için haşere tüp altına ulaştığından emin olun.
- Anaerobik odada taurokolat (TCA, C. difficile sporların bir germinant) ile veya olmadan, D-sikloserin ve sefüsitin içeren C. difficile yetiştirme orta sındaki homojenatları kuluçkaya yatırın.
- Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca anaerobik olarak kuluçkaya yatırın.
- 16S rRNA-PCR için bakteri kültürünü kullanın.
- Bir koloniyi 50 μL H2O'da yeniden askıya alın ve 95 °C'de 15 dakika kaynatın. Pelet santrifüj tarafından lysed enkaz (14.000 rt RT için 2 dakika için) ve C. difficileözgü primerler kullanarak PCR-reaksiyon 25 l şablon olarak supernatant 2 μL kullanın (Cdiff16Sfw: 5'GTG AGG CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- Sıvı kültürden bakteriler kullanıldığında, 1 mL kültür hasat ve 1 mL PBS (RT 2 dakika için 14.000 rpm) ile bir kez yıkayın. Peleti 100 μL H2Odd'de yeniden askıya alın ve yukarıda olduğu gibi tedavi edin. Daha fazla bakteri kolonileri karakterize etmek için, bir BHIS üzerinde çizgi- veya kromid plakası(Malzeme Tablosu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. difficile kesinlikle anaerobik, ancak floresan proteinlerin kromofor genellikle olgun oksijen gerektirir. Bu sorunu aşmak için, bir floresan boya aktif olarak büyüyen canlı C. difficile hücreleri leke kullanılmıştır (R20291, bir ribotype 027 suş; Şekil 1A). Gal4/UAS sistemi kullanılarak, canlı görüntüleme için kararlı transgenik zebra balığı hatları oluşturuldu ve mpeg1.1 veya lyZ organizatörleri EGFP floresan proteininin makrofajlarda ve nötrofillerde (sırasıyla) Gal4'e bağımlı bir şekilde ekspresyonu sürdüler.
Lekeli C. difficile zebrabalığı bağırsak içine enjekte edildi 5 dpf, ve enfekte siteler kuluçka 1 saat sonra görüntülenmiştir. Zaman atlamalı görüntüleme, hem nötrofillerin hem de makrofajların enfeksiyon bölgelerine ulaştığını gösterdi (Şekil 1B), ve bu iki doğuştan gelen bağışıklık hücresinin sayısı C. difficile temizlenene kadar arttı. Açıklık fagositoz ve etiketli C. difficile sindirim tarafından meydana geldi. Şekil 1C aktif bir makrofaj fagositli iki C. difficile bakteri gösterir (Ek Film 1bakınız).
Şekil 1: Zebra balığında C. difficile boyama ve enfeksiyonu. (A) Floresan c. mikroenjeksiyon sonrası enfekte zebra balığı içinde difficile bakteri etiketli. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) Çift transgenik zebra balığı Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 2 saat post-enfeksiyon (hpi) de C. difficile enfeksiyon bölgesinde biriken yeşil floresan nötrofiller gösteren konfokal Z-yığın projeksiyon. Nötrofiller yeşil ve C. difficile kırmızı gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) GFP etiketli makrofajlar fagositoz kırmızı floresan lekeli C. difficilegösteren konfokal zaman atlamalı görüntüleme . Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mikroenjeksiyon patojenler ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için en yaygın yöntem olmasına rağmen, bu yöntem her zaman doku hasarına neden olur, hangi deneysel sonuçları etkileyebilir. Bu sorunu önlemek için mikrogavaj, 5 dpf'de makrofaj ve nötrofil muhabir hatlarının bağırsak lülesine floresan etiketli C. difficile sağlamak için kullanılmıştır ve bu da CDI'nin doğal yolunu taklit eder (Şekil 2A). Ancak nötrofiller ve makrofajlar mikrogavajdan sonra gastrointestinal sistemde 12 saate kadar belirgin bir göç göstermediler (Şekil 2B). Bu arada, etiketli C. difficile floresan yaklaşık sonra kayboldu 5 saat post-mikrogavage, büyük olasılıkla ya nedeniyle 1) enzimatik yıkım, 2) zebra balığı bağırsakuygunsuz pH düzeyleri, ya da 3) spor oluşumu başlangıcı ve bakteri eşlik eden membran değişiklikleri(Şekil 2B). Bu nedenle C. difficile'isaptamak için bağırsak diseksiyonu yöntemi oluşturulmuştur.
Şekil 2: C. difficileile zebra balığı larvalarının mikrogavajı. (A) 5 dpf floresan lekeli C. difficileile gavaged zebrabalığı larvalarının temsili görüntü . Görüntü yaklaşık 3 saat post-gavage kaydedildi, Bu C. difficile zebrabalığının arka bağırsak mevcut olduğunu gösteren. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Makrofaj hareketliliğini gösteren konfokal zaman atlamalı görüntüleme. Çift transgenik zebra balığı larvaları Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 5 dpf floresan etiketli C. difficileile gavaged edildi . 12 saate kadar konfokal zaman atlamalı görüntüleme yapıldı.
C. difficile'ın zebra balığında yaşayıp yaşayamadığını doğrulamak için, zebra balığı bağırsakları gavajdan sonra çeşitli zaman noktalarında ayrıldı. Daha sonra, izole bağırsaklar plastik pestisitler ile homojenize edildi ve homojenler TCA ile veya TCA olmadan, D-sikloserin ve sefetin içeren C. difficile ortamda inkübit edildi. Ancak, aktif olarak büyüyen C. difficile hücreleri sadece TCA ile ve TCA olmadan 24 saat sonrası enfeksiyon tespit edildi (veriler gösterilmedi). Konvansiyonel larvadaki yerli mikrobiyal toplulukların kolonileşme direnci nedeniyle C. difficile invazyonunu önlediği spekülasyonlara yol açmaktadır.
Gnotobiyotik zebra balığı larvaları da kullanıldı. Bağırsak örnekleri 24 hpi kesildi ve TCA ile orta veya TCA olmadan bakteri büyümesi gösterdi, kontrol grubunda bakteri büyümezken(Şekil 3A). Ancak, daha sonraki zaman noktalarında (yani, 48 hpi, 72 hpi, ve 120 hpi) inkübe örnekleri sadece TCA içeren ortamda büyüdü, hangi bağırsakta toplam C. difficile sporlar oluşmuştu önerdi (Şekil 3B). Bu floresan etiketleme kaybı için olası bir açıklama sağlar.
16S rDNA PCR sonra C. difficileolarak yetiştirilen bakterileri tanımlamak için kullanılmıştır , hangi öngörülebilir boyutta özel PCR amplicons üretilen (~ 800 bp; Şekil 3C). Bu sonuç, bu PCR ürünlerinin sıralanmasıyla daha da doğrulandı. Daha sonra, bakteri kültürleri bir BHIS plaka yayıldı. Birkaç tek koloni daha sonra sadece C. difficile büyümesini destekleyen bir kromid plakaüzerine transfer edildi. Bakteriler tipik siyah koloniler olarak ortaya çıktı, bu da zebra balığı bağırsaklarından gelen bakterilerin C. difficile olduğunu göstermiştir (Şekil 3D).
Şekil 3: Enfeksiyon sonrası zebra balığı bağırsağıC. Bağımsız deneylerin her biri için, 5 dpf'de 15-20 gnotobiyotik zebra balığı larvası mikrogavage tarafından negatif kontrol olarak 108 CPU/mL C. difficile veya PBS'nin 3-5 nL'si ile enfekte edildi. (A) Parçalanmış bağırsakların homojenates kültürlü edildi. Bakteriler gnotobiyotik zebra balığı larvalarının enfeksiyonundan sonra TCA 72 h içeren ortamda büyüdü (1, enfekte olmayan kontrol grubu; 2, R20291 enfekte zebra balığı; n = 3). (B) 24 saat, 48 h, 72 saat ve 120 h sonrası enfeksiyon sonrası c. difficile (n = 3)(C) Bakteri örnekleri 16S rDNA PCR tarafından 72 saat mikrogavaj sonrası (1, enfekte olmayan kontrol grubu; 2, R20291-enfekte zebra balığı; n = 3) test edildikten sonra genel deney sonuçlarının şematik illüstrasyonu yapıldı. (D) Krom-plaka üzerinde C. difficile büyüme; Bu plakaların bir özelliği olan C. difficile'ninsiyah rengini not edin (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Film 1. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan yöntemler değiştirmek ve hem enjeksiyon ve mikrogavage 10 ,14gerçekleştirerek zebra balığı larvaları enfekte mevcut bir yaklaşım genişletmek. Ayrıca zebrabalığı larvaları22ile anaerobik patojenleri incelemek için bir yaklaşım göstermektedir. Buna ek olarak, protokol CDI üzerine in vivo doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının analizini kolaylaştırır ve zebra balıklarında C. difficile kolonizasyonu üzerine. Yöntem tekrarlanabilir ve rutin bir laboratuvar veya klinik ortamda yürütülmesi kolaydır.
Lökositler tarafından C. difficile fagositoz izlemek için, makrofajları (KalTA4: zebrabalığı optimize edilmiş Gal4-varyantı) ve Tg(lyz:KalTA4)bz17'yi görselleştirmek ve Tg(4xUAS: EG)taşıyıcılarının transgenik arka planı ile geçildiğinde nötrofilleri görselleştirmek için iki kararlı transgenik zebra balığı hattı (örneğin, Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16) kullanılmıştır. C. difficilebüyümesi için gerekli olan anaerobik ortam nedeniyle, Genetik araçlar C. difficile izlemek için sınırlıdır. Bir kodon optimize mCherryOpt onları etiketlemek için bildirilmiştir rağmen, C. difficile bakterilercanlı görüntüleme ayarları13kullanılmadan önce floresan sergilemeden önce sabit olmalıdır. Bu nedenle, bir floresan boya kırmızı floresan ile canlı C. difficile leke burada kullanılmıştır, hangi çok sayıda mevcut yeşil floresan transgenik zebra balığı suşları ile kombine edilebilir. Bu yöntem kolayca diğer bağırsak anaerobik bakterilere uygulanabilir, Bacteroides fragilis ve Helicobacter hepaticus gibi. Temsili sonuçlar hem nötrofillerin hem de makrofajların enfekte zebra balıklarında fagositoz C. difficile'ı tanıyabileceğini ve fagositoz olduğunu göstermektedir.
Hem daldırma ve mikroenjeksiyon yöntemleri düzenli zebra balığı20,21,22enfekte etmek için kullanılmaktadır. Daldırma yöntemleri kullanarak basittir, ancak bu yaklaşım zor doğru bağırsak içine bakterilerin istila süresini kontrol etmek için yapar. Mikroenjeksiyon patojenler ile zebra balığı embriyoları enfekte etmek için en yaygın yöntemdir, ama her zaman doku hasarına neden olur. Bu nedenle, mikrogavage doğal enfeksiyon rotasını taklit etmek için kullanılmıştır.
Ancak, boya lekeli C. difficile 5 saat post-microgavage civarında tespit edilemez hale bulundu. Bunun nedenleri şu anda belirsizdir ama ya ilgili olabilir 1) bağırsak koşulları altında florofor intoleransı veya 2) C. difficile hücrelerinspor oluşumunun başlatılması. Ayrıca, bütün larva homojenlerinin kültüründe C. difficile'nin saptanamadığını saptandı. Bu nedenle, her enfekte zebra balığı bağırsak sonra C. difficile hala zebrabalığı bağırsak dokusu yaşadığı olup olmadığını belirlemek için kültürlü diseksiyon edildi.
Konvansiyonel farelerin yerli mikrobiyota nedeniyle, sadece fareler bir antibiyotik kokteyl veya gnotobiyotik fareler ile pretreated C. difficileduyarlıdır 16. Aynı şekilde, C. difficile sadece gnotobiyotik zebra balığı bağırsaklarında tespit edildi ama geleneksel yabani tip zebra balığı 24 saat sonrası tespit edildi. İlginçtir, bağırsak örnekleri 48 h, 72 h, ve 120 saat post-enfeksiyon zebra balığı sadece TCA içeren medya büyüdü. Yukarıda açıklandığı gibi, TCA c. difficile spor çimlenme in vitro uyarır. Bu sonuç, aktif C. difficile hücrelerinin zebra balığı bağırsadında vegetatif sporlar oluşturduğunu ve mikrogavaj yaklaşımı kullanılarak spordan elde edilen kolonilerin tespit edildiğini göstermektedir.
İlginçtir, mikrop içermeyen zebra balığı hala CDI herhangi bir belirti mevcut değildi, bağırsak nötrofil akını veya zebra balığı bile ölüm gibi. Bu enjeksiyon ile enfeksiyon yaralayarak doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini aktive edebilir ve sadece aktif makrofajlar ve nötrofiller hızlı C. difficiletespit edebiliyoruz gösterir. Buna ek olarak, zebra balığı belirgin CDI eksikliği için olası bir açıklama zebra balığı ve memeli bağırsakları arasındaki yapısal farklılıklara dayanmaktadır17. Zebra balığı bağırsak bağırsak, C. difficile sık sık18bulunan bağırsak mahzenleri yoksun. Zebra balığının düşük bakım sıcaklığıile birlikte memelilerde olduğu gibi, zebra balıklarında CDI başlangıcının memeli modellerdeki kadar hızlı olmadığı ortaya çıkar. Ancak, insan mikrobiyota iki anaerobik bakteri, Lactobacillus paracasei ve Eubacterium limosum, zebra balığı bağırsak içinde büyümeye kanıtlanmıştır19. Burada sunulan teknik gelişmeler, bu yöntemin uygulamalarını C. difficile ve diğer bakteri veya patojenlerin memeli bağırsanından elde edilen moleküler olarak çekilebilir zebra balığı larvalarını in vivo olarak incelemeye teşvik edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz mükemmel hayvan bakımı için Timo Fritsch için müteşekkiriz. Köster ve Steinert laboratuvarları üyelerine destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Dr. Dandan Han'a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Biz minnetle Aşağı Saksonya Federal Devlet, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) tarafından fon kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
