Summary
Présenté ici est une méthode sûre et efficace pour infecter les larves de poissons zèbres avec fluorescent étiqueté C. difficile anaérobie par microinjection et microgavage non invasif.
Abstract
L’infection à Clostridioides difficile (CDI) est considérée comme l’une des infections gastro-intestinales les plus courantes associées aux soins de santé aux États-Unis. La réponse immunitaire innée contre C. difficile a été décrite, mais les rôles exacts des neutrophiles et des macrophages dans CDI sont moins compris. Dans la présente étude, les larves de Danio rerio (poisson zèbre) sont utilisées pour établir un modèle d’infection À C. difficile pour l’imagerie du comportement et de la coopération de ces cellules immunitaires innées in vivo. Pour surveiller C. difficile, un protocole d’étiquetage à l’aide d’un colorant fluorescent a été établi. Une infection localisée est réalisée par micro-injection étiquetée C. difficile, qui se développe activement dans le tractus intestinal du poisson zèbre et imite les dommages épithéliales intestinaux dans cDI. Cependant, ce protocole d’infection directe est invasif et cause des blessures microscopiques, qui peuvent affecter des résultats expérimentaux. Par conséquent, un protocole de microgavage plus non invasif est décrit ici. La méthode consiste à aciver des cellules C. difficile directement dans l’intestin des larves de poissons zèbres par intubation par la bouche ouverte. Cette méthode d’infection imite étroitement la voie naturelle d’infection de C. difficile.
Introduction
C. difficile est un bacille gram-positif, spore-formant, anaérobie, et toxine-producteur qui est la principale cause des infections graves dans le tractus gastro-intestinal1. Les symptômes typiques de l’ICD comprennent la diarrhée, des douleurs abdominales et une colite pseudomembraneuse mortelle, et elle peut parfois entraîner la mort1,2. Les preuves ont montré que les réponses immunitaires de l’hôte jouent un rôle critique dans la progression et les résultats de cette maladie3. En plus de la réponse immunitaire, le microbiote intestinal indigène est crucial pour l’début et la pathogénie de CDI4. Au cours de la dernière décennie, le nombre de cas et le taux de mortalité de l’ICD ont considérablement augmenté en raison de l’émergence d’une souche hypervirulente de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires sous-jacents et du rôle du microbiote pendant l’ICD contribuera à la mise en place de nouveaux développements et progrès thérapeutiques, permettant ainsi un meilleur contrôle de cette épidémie.
Plusieurs modèles animaux, tels que le hamster et la souris, ont été développés pour donner un aperçu de la défense immunitaire contre C. difficile7,8. Cependant, le rôle des cellules immunitaires innées est encore mal compris, d’autant plus que le comportement inné des cellules immunitaires est principalement dérivé de l’analyse histologique ou des cellules cultivées in vitro. Par conséquent, l’établissement d’un modèle transparent de poisson zèbre pour révéler la réponse immunitaire innée à C. difficile à l’intérieur d’un organisme vertébré vivant facilitera de telles études. Les larves de poissons zèbres ont un système immunitaire inné fonctionnel, mais elles n’ont pas le système immunitaire adaptatif jusqu’à 4 à 6 semaines après la fécondation9. Cette caractéristique unique fait des larves de poissons zèbres un excellent modèle pour étudier la réponse et la fonction isolées des cellules immunitaires innées en CDI.
Ce rapport décrit de nouvelles méthodes utilisant des larves de poissons zèbres pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires C. difficile et innées, telles que les macrophages et les neutrophiles. Tout d’abord, un protocole de microinjection localisé qui comprend l’inoculum c. difficile et la coloration est présenté. À l’aide de la formation image in vivo confocaltime lapse, la réponse des neutrophiles et des macrophages vers le site d’infection est enregistrée, et la phagocytose des bactéries par les neutrophiles et les macrophages est observée. Cependant, il a été rapporté que l’injection elle-même cause des dommages de tissu et mène au recrutement des leucocytes indépendants de la bactérie10. Par conséquent, un protocole de microgavage non invasif pour livrer C. difficile dans l’intestin des larves de poissons zèbres est décrit plus tard. Des études antérieures ont démontré que le microbiote gastro-intestinal indigène protège un hôte contre la colonisation de C. difficile11. Par conséquent, les larves de poissons zèbres gnotobiotiques sont également utilisées pour prédisposer les poissons zèbres qui sont infectés 12. Par la suite, la dissection intestinale est effectuée pour récupérer le C. difficile viable et valider la durée de leur présence dans les voies intestinales de poisson zèbre.
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Protocol
Tous les travaux sur les animaux décrits ici ont été effectués conformément à la réglementation légale (EU-Directive 2010/63, licence AZ 325.1.53/56.1-TUBS et licence AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Préparation de l’Agarose à faible fusion, de la plaque de gel et des aiguilles de microinjection/microgavage
- Dissoudre 0,08 g d’agarose fondante faible(Tableau des Matériaux, agarose A2576) en 10 ml de 30% du milieu danieau (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH 7,2) et 17,4 mM NaCl, stockés à température ambiante (RT) pour obtenir une solution de 0,8 %.
REMARQUE : Des concentrations plus élevées ou plus faibles d’agarose peuvent être utilisées. Cependant, le temps nécessaire pour se solidifier varie selon les marques d’agarose, même à la même concentration. - Préparer les aiguilles de microinjection et de microgavage à partir de capillaires en verre (Tableau des matériaux).
- Utilisez un puller micropipette avec les paramètres suivants (à noter que les unités sont spécifiques à la traction utilisée ici; voir Tableau des matériaux):aiguilles microinjection (pression de l’air 500; chaleur 400; traction 125; vitesse ' 75; temps - 150); et les aiguilles de microgavage (pression d’air 500; chaleur 400; traction 100; vitesse de 75; temps 150). Utilisez une pointe de microchargeur pour charger 3 'L de H2O sans nucléane dans l’aiguille tirée.
- Introduisez l’aiguille dans l’injecteur et fixez-la correctement. Ajustez l’aiguille à un angle approprié pour l’injection. Fixez la pression d’injection entre 600 à 900 hPa pour l’aiguille microinjection et 200 à 300 hPa pour l’aiguille de gavage.
- Placez une goutte d’huile minérale sur le cercle noir de la glissière d’étalonnage. Utilisez des pinces fines pour couper le bout de l’aiguille. Injecter une goutte dans l’huile minérale pour mesurer la taille de la gouttelette.
- Pour la microinjection, ajuster le temps d’injection pour obtenir une gouttelette d’un diamètre de 0,10 à 0,12 mm, ce qui équivaut à un volume de 0,5 à 1,0 nL. Pour le microgavage, obtenir une gouttelette d’un diamètre de 0,18 à 0,20 mm, ce qui équivaut à un volume de 3 à 5 nL.
- Préparer une plaque d’agarose de 1,5 % avec agarose(Table of Materials, 8050) dans un plat Petri de 10 cm dans le milieu de 30 % de Danieau en utilisant un moule en plastique comme moule à microgavage. Conserver à 4 oC pour éviter la dessiccation jusqu’à ce que nécessaire. Chaud à RT ou 28 oC avant l’expérience.
2. Préparation et étiquetage de C. difficile et spores avec colorant fluorescent
- Préparer une solution de stock de 1 mM d’un colorant fluorescent (Table des Matériaux). Étant donné que le colorant est vendu en 50 aliquots de poudre, ajouter 69 l de DMSO au flacon pour obtenir une concentration de 1 mM de stock.
- Préparer une solution de travail de 100 MM du colorant fluorescent en ajoutant une solution de stock de 2 l l à 18 L de DMSO dans un tube de centrifugeuse, et bien mélanger.
- Culture C. difficile (R20291, une souche ribotype 027) en inoculé 10 ml de milieu liquide BHIS avec deux à trois colonies d’une plaque dans une hotte anaérobie sans trembler du jour au lendemain. BHIS est BHI complété avec 0.5% (w/v) extrait de levure et 0.1% (w/v) L-cysteine. Dissoudre 1 g de L-cystéine dans 10 ml de ddH2O et stériliser par filtration, puis ajouter au milieu autoclaved pour obtenir une concentration finale de 1 g/L. Les plaques sont préparées en ajoutant 15 g/L d’agar-agar au milieu avant l’autoclacation. La culture sélective du C. difficile se fait à l’aide de plaques chromID C. difficile (Table des Matériaux).
- Coloration C. difficile avec le colorant fluorescent
- Récolte C. difficile à un OD600 de 1,0 à 1,2 et laver 1x avec 1 ml de 1x PBS (5 000 x g pour 3 min à RT). Resuspendre dans 1 ml de 1 x PBS.
- Ajouter 3 ll de solution de travail du colorant fluorescent dans 1 ml de suspension bactérienne. Incuber l’échantillon pendant 15 min à RT dans l’obscurité. Laver le C. difficile taché une fois avec 1 mL de PBS pour enlever le colorant résiduel et le resuspendre en 1x PBS à un OD600 de 1,0 (1,0 OD600 équivaut approximativement à 108 cfu/mL).
3. Injection de C. difficile taché dans les larves de poisson zèbre
- Anesthésiez 20 à 30 larves de poissons zèbres à 5 jours après la fécondation (appelée ici 5 dpf) avec 0,02 % à 0,04 % de tricaine (la poudre de tricaïne est dissoute dans de l’eau à double distillation et ajustée au pH 7 avec une solution Tris-HCL de 1 M) dans le milieu de 30 % de Danieau de 10 min avant Injection. Transférer les larves anesthésiées dans un plat Petri frais de 10 cm et enlever l’excédent de 30 % du milieu de Danieau.
- Placer une goutte d’agarose fondante de 0,8 % sur les larves de poissons zèbres pour couvrir. Ajuster délicatement les larves à une position latérale. Placer le plat Petri sur la glace pendant 30 à 60 s pour permettre à l’agarose fondante de se solidifier. Ajouter 30% du milieu Danieau contenant 0,02% à 0,04% de tricaine pour couvrir l’agarose.
- Préparer la solution d’injection. Ajouter 1 ll de 0,5 % de phénol rouge dans la solution PBS dans 9 ll de l’inoculum C. difficile teinté de colorant pour visualiser le processus d’injection.
- Chargez une aiguille de microinjection calibrée avec la solution d’injection à l’aide d’un microchargeur. Montez l’aiguille chargée sur un micromanipulateur et placez-la sous un stéréomicroscope.
- Ajustez la pression d’injection entre 600 et 900 hPa. Définir le temps d’injection à 0,1 à 0,3 s pour obtenir 0,5 à 1,0 nL. Placez l’aiguille dans le micromanipulateur à un angle de 45 degrés pointant vers les larves encastrées.
- Placez l’extrémité de l’aiguille au-dessus du tractus gastro-intestinal près du pore urogénital. Percer à travers agarose puis le muscle avec la pointe de l’aiguille, puis l’insérer dans le lumen intestinal et injecter 0,5 à 1,0 nL de C. difficile. Utilisez un microscope à fluorescence pour surveiller les larves injectées et ramasser les larves correctement injectées pour l’imagerie confocale.
4. Génération de larves de poissons zèbres gnotobiotiques
- Utiliser la méthode de reproduction naturelle bien établie pour générer des embryons de poissons zèbres gnotobiotiques, y compris : la fécondation in vitro, le lavage à l’air d’un milieu contenant des antibiotiques (1 'g/mL amphotericin B, 10 'g/mL kanamycin, et 20 'g/mL ampicillin), le lavage avec 0.1% wt/vol polyvinyl pyrrolidone-iode (PVP-I) solution, et l’incubation des embryons dans une hotte de culture cellulaire12.
- Maintenir toutes les larves de poissons zèbres gnotobiotiques dans des conditions gnotobiotiques jusqu’à 5 dpf ou juste avant le gavage. Après le gavage, les larves de poissons zèbres seront transférées dans un incubateur standard mais avec le milieu stérile de 30% de Danieau.
5. Gavage de larves de poissons zèbres
- Calibrer l’aiguille microgavage telle que décrite à l’étape 1.2.
- Mesurer le diamètre de la pointe de l’aiguille en plaçant l’aiguille sur une glissière d’étalonnage avec une goutte d’huile minérale. Assurez-vous que la pointe est de 30 à 40 m de diamètre, émoussée et lisse. Jeter les aiguilles pointues ou rugueuses.
REMARQUE : Les bords pointus des aiguilles peuvent être émoussés par la flamme rapide. - Préparer la solution de gavage telle que décrite à l’étape 3.3.
- Chargez et montez l’aiguille sur un micromanipulateur tel que décrit à l’étape 3.4. Ajuster le micromanipulateur pour positionner l’aiguille à un angle de 45 degrés.
- Anesthésiez les larves de poissons zèbres mentionnées à l’étape 3.1. Lorsque les larves cessent de bouger, transférez-les dans la rainure d’un moule à microgavage à l’aide d’une pipette Pasteur.
- Placer une goutte d’agarose fondante de 0,8 % sur les larves de poissons zèbres pour couvrir. Ajustez délicatement les larves, les têtes orientées vers la verticale à des angles de 45 degrés dans la rainure et les queues contre le mur de la rainure. Assurez-vous que les angles des têtes sont à peu près les mêmes afin qu’ils soient alignés avec l’angle des aiguilles de gavage. Placer le moule microgavage sur la glace pendant 30 à 60 s, ce qui permet à l’agarose fondante de se solidifier afin de stabiliser la position des larves.
- Ajustez la pression d’injection entre 200 et 300 hPa. Fixer le temps d’injection à 0,1 à 0,3 s pour obtenir un volume d’injection de 3 à 5 nL de C. difficile.
- Actionnez doucement l’aiguille à travers l’agarose puis dans la bouche des larves de poissons zèbres, à travers l’œsophage. Une fois que la pointe de l’aiguille est à l’intérieur de l’ampoule intestinale antérieure, appuyez sur la pédale d’injection pour libérer les bactéries. Remplissez le lumen de l’intestin avec le volume livré. Ne le laissez pas déborder de l’œsophage ou du cloaque. Retirez délicatement l’aiguille de l’embouchure du poisson zèbre.
- Après le gavage, sauvez les larves infectées de poissons zèbres de l’agarose avec une pointe flexible de microchargeur en coupant d’abord l’agarose loin puis en soulevant les larves. Transférez ces larves dans le milieu stérile de Danieau à 30 %. Rincer les larves dans un milieu stérile deux fois. Transférer les larves dans un plat Petri frais de 10 cm. Les larves seront maintenues jusqu’à 11 dpf.
6. Analyse de microscopie confocale des larves injectées de poisson zèbre
- Anesthésie rhénaniser les larves de poissons zèbres mentionnées étape 3.1. Faire un trou dans le fond d’un plat Petri de 35 mm avec une glissière en verre attachée au trou, appelée chambre d’imagerie. Transférer les embryons au fond de la chambre d’imagerie avec une quantité suffisante de 30% du milieu de Danieau.
- Ajouter 200 à 300 l d’agarose fondante faible de 1 % pour couvrir les larves anesthésiées. Puisqu’un microscope confocal inversé est utilisé, placez la région infectée des larves contre la glissière de verre aussi étroitement que possible.
- Laissez l’agarose se solidifier sur la glace pendant 30 à 60 s. Submergez l’agarose avec 30 % de La tricaine de Danieau contenant 0,02 % à 0,04 %.
- Imagez les larves avec un microscope à balayage laser confocal(Tableau des matériaux).
7. Dissection de l’intestin de poisson zèbre larvaire pour récupérer le C. difficile viable
- Isoler les voies gastro-intestinales des larves pour analyser la charge bactérienne. Commencez par euthanasier les larves de poissons zèbres avec 0,4 % de tricaine.
- Rincer brièvement le poisson zèbre avec le 1x PBS stérile et les transférer dans une plaque d’agarose fraîche.
- Dissection du poisson zèbre
- Insérez une aiguille dans le tronc dorsal des larves de poissons zèbres près de la tête pour immobiliser le poisson zèbre. Retirez la tête derrière les branchies à l’œil d’une lancette.
- Insérer la deuxième aiguille au milieu du tronc dorsal. Insérez la troisième aiguille dans l’abdomen du poisson zèbre et tirez l’intestin hors de la cavité du corps.
REMARQUE : Des soins extrêmes sont nécessaires pour isoler l’intestin intact. S’il est difficile de le faire, effectuer des tractions supplémentaires pour séparer le reste de l’intestin des organes internes restants. - Utilisez une aiguille à microinjection pour transférer de 10 à 15 intestins dans un tube de 1,5 ml contenant 200 l stériles de 1 x PBS.
- Homogénéiser les intestins avec un pilon pour perturber le tissu et préparer les homogénéates. Assurez-vous que le pilon atteint le fond du tube pour perturber complètement tous les intestins.
- Incuber les homogénéités dans le milieu d’élevage C. difficile contenant de la D-cycloserine et de la cefoxitin, avec ou sans taurocholate (TCA, un germinant de spores de C. difficile) dans une chambre anaérobie.
- Incuber la plaque anaérobie pendant 48 h à 37 oC.
- Utilisez la culture bactérienne pour 16S rRNA-PCR.
- Resuspendre une colonie dans 50 oL de H2O et la faire bouillir à 95 oC pendant 15 min. Pelleter les débris lysés par centrifugation (14 000 tr/min pour 2 min à RT) et utiliser 2 ll du supernatant comme modèle dans 25 L de RÉACTION PCR à l’aide d’amorces spécifiques C. difficile(Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- Lorsque des bactéries issues de la culture liquide sont utilisées, récoltez 1 ml de culture et lavez une fois avec 1 ml de PBS (14 000 tr/min pendant 2 min à RT). Resuspendre la pastille dans 100 oL de H2Odd et traiter comme fait ci-dessus. Pour caractériser davantage les colonies bactériennes, stries sur une plaque BHIS- ou chromID(Tableau des matériaux).
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Representative Results
C. difficile est strictement anaérobie, mais le chromophore des protéines fluorescentes nécessite généralement de l’oxygène pour mûrir. Pour surmonter ce problème, un colorant fluorescent a été utilisé pour tacher les cellules vivantes de C. difficile qui se développaient activement (R20291, une souche de ribotype 027; Figure 1A). À l’aide du système Gal4/UAS, des lignées transgéniques stables de poissons-zèbres ont été générées pour l’imagerie en direct, dans laquelle les promoteurs de mpeg1.1 ou de lyZ ont conduit l’expression de la protéine fluorescente EGFP dans les macrophages et les neutrophiles (respectivement) d’une manière Dépendante de Gal4.
Le C. difficile taché a été injecté dans le tractus intestinal du poisson zèbre à 5 dpf, et les sites infectés ont été photographiés après 1 h d’incubation. La formation image en accéléré a montré que les neutrophiles et les macrophages ont atteint les sites d’infection (figure 1B), et le nombre de ces deux cellules immunitaires innées a augmenté jusqu’à ce que le C. difficile ait été dégagé. Le dégagement s’est produit par phagocytose et la digestion du C. difficile étiqueté. Figure 1C montre qu’un macrophage activé a phagocytisé deux bactéries C. difficile (voir film supplémentaire 1).
Figure 1 : Coloration et infection du C. difficile chez le poisson zèbre. (A) Bactéries C. difficile étiquetées fluorescentes dans le poisson zèbre infecté après microinjection. Barre d’échelle de 5 m. (B) Projection Confocal Z-pile montrant des neutrophiles fluorescents verts dans le poisson zèbre transgénique double Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 accumulés au site d’infection de C. difficile à 2 h post-infection (hpi). Les neutrophiles sont représentés en vert et C. difficile en rouge. Barre d’échelle de 50 m. (C) Imagerie confocale en time-lapse montrant des macrophages étiquetés GFP phagocytosing rouge fluorescent teinté C. difficile. Barre d’échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Bien que la microinjection soit la méthode la plus courante pour infecter les larves de poissons zèbres avec des agents pathogènes, cette méthode cause invariablement des lésions tissulaires, ce qui peut influencer les résultats expérimentaux. Pour éviter ce problème, le microgavage a été utilisé pour délivrer le C. difficile étiqueté fluorescence dans le lumen intestinal des lignes de reporter de macrophage et de neutrophile à 5 dpf, qui imite le chemin normal de CDI (figure 2A). Cependant, les neutrophiles et les macrophages n’ont pas montré de migration évidente vers le tractus gastro-intestinal pendant 12 h après le microgavage (figure 2B). Entre-temps, la fluorescence du C. difficile étiqueté a disparu après environ 5 h après le microgavage, probablement en raison de la destruction enzymatique 1, 2) des niveaux de pH inappropriés dans l’intestin du poisson zèbre, ou 3) début de la formation de spores et des changements membranaires qui l’accompagnent dans les bactéries (Figure 2B). Par conséquent, une méthode de dissection intestinale a été établie pour détecter C. difficile.
Figure 2 : Microgavage de larves de poissons zèbres avec C. difficile. (A) Image représentative des larves de poissons zèbres à 5 dpfgavaged avec de la fluorescence teintée C. difficile. L’image a été enregistrée autour de 3 h post-gavage, montrant que C. difficile étaient présents dans l’intestin postérieur du poisson zèbre. Barre d’échelle de 100 m. (B) Imagerie confocale en time-lapse démontrant la motilité macrophage. Les larves de poisson zèbre transgénique double Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 à 5 dpf ont été gavaged avec la fluorescence étiquetéE C. difficile. L’imagerie en accéléré confocal a été réalisée jusqu’à 12 h. Barre d’échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Pour confirmer si C. difficile était capable d’habiter le poisson zèbre, les intestins de poisson zèbre ont été séparés à divers moments après le gavage. Ensuite, les intestins isolés ont été homogénéisés avec des pilons en plastique, et les homogénéités ont été incubées dans le milieu de C. difficile contenant D-cycloserine et cefoxitin, avec ou sans TCA. Cependant, les cellules de C. difficile en croissance active n’ont été détectées que jusqu’à 24 h après l’infection avec et sans TCA (données non montrées). On suppose que les communautés microbiennes indigènes dans les larves conventionnelles ont empêché l’invasion de C. difficile en raison de leur résistance à la colonisation.
Des larves de poissons zèbres gnotobiotiques ont également été utilisées. Les échantillons intestinaux 24 hpi ont été disséqués et ont montré une croissance bactérienne dans le milieu avec TCA ou sans TCA, alors qu’aucune bactérie n’a grandi dans le groupe témoin (Figure 3A). Cependant, à des moments plus tard (c.-à-d. 48 hpi, 72 hpi et 120 hpi) les échantillons incubés n’ont poussé que dans le milieu contenant du TCA, ce qui suggère que le total du C. difficile dans l’intestin avait formé des spores (figure 3B). Ceci fournit une explication possible pour la perte de l’étiquetage de fluorescence.
16S rDNA PCR a ensuite été utilisé pour identifier les bactéries cultivées comme C. difficile, qui a produit des amplicônes SPÉCIFIQUES DE PCR de taille prévisible (800 pb; Figure 3C). Ce résultat a été encore vérifié par le séquençage de ces produits PCR. Par la suite, des cultures bactériennes ont été répandues sur une plaque BHIS. Plusieurs colonies simples ont ensuite été transférées sur une plaque de chromiD, qui ne soutenait que la croissance de C. difficile. Les bactéries sont apparues comme des colonies noires typiques, ce qui indique en outre que les bactéries des intestins du poisson zèbre étaient C. difficile (figure 3D).
Figure 3 : Détection du C. difficile dans l’intestin du poisson zèbre après une infection. Pour chacune des expériences indépendantes, 15 à 20 larves de poissons zèbres gnotobiotiques à 5 dpf ont été infectées par 3 à 5 nL sur 108 UFC/mL C. difficile ou PBS comme un contrôle négatif par microgavage. (A) Les homogénéates des intestins disséqués ont été cultivés. Les bactéries se sont développées dans le milieu contenant 72 h tCA après l’infection des larves de poissons zèbres gnotobiotiques (1, groupe témoin non infecté; 2, poisson zèbre infecté par R20291; n - 3). (B) Illustration schématique des résultats globaux de l’expérience après 24 h, 48 h, 72 h et 120 h post-infection avec C. difficile (n ' 3) (C) Des échantillons bactériens ont été testés par 16S rDNA PCR à 72 h post-microgavage (1, groupe témoin non infecté; 2, poisson zèbre infecté par R20291; n - 3). (D) La croissance de C. difficile sur le chromiD-plaque; notez la couleur noire de C. difficile, qui est une caractéristique de ces plaques (n ' 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film supplémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
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Discussion
Les méthodes présentées modifient et étendent une approche existante pour infecter les larves de poissons zèbres en effectuant à la fois l’injection et le microgavage10,14. Il démontre également une approche pour étudier les agents pathogènes anaérobies avec les larves de poissons zèbres22. En outre, le protocole facilite l’analyse des réponses innées de cellules immunitaires in vivo sur CDI et sur la colonisation de C. difficile dans le poisson zèbre. La méthode est reproductible et facile à conduire dans un laboratoire ou un environnement clinique de routine.
Pour surveiller la phagocytose de C. difficile par les leucocytes, deux lignées transgéniques stables de poissons zèbres ont été utilisées (p. ex., Tg[mpeg1.1 : KalTA4]bz16) pour visualiser les macrophages (KalTA4 : gal4-variant optimisé par le poisson zèbre) et Tg(lyz : KalTA4 )bz17 et visualiser les neutrophiles lorsqu’ils sont croisés avec le fond transgénique de Tg(4xUAS: EGFP)hzm3. En raison de l’environnement anaérobie qui est nécessaire à la croissance de C. difficile,les outils génétiques pour retracer C. difficile sont limités. Bien qu’un mCherryOpt optimisé pour le codon ait été signalé pour les étiqueter, les bactéries C. difficile doivent être fixées avant d’exposer la fluorescence avant son utilisation dans les milieux d’imagerie en direct13. Par conséquent, un colorant fluorescent a été utilisé ici pour tacher le C. difficile vivant avec la fluorescence rouge, qui peut être combinée avec les nombreuses souches vertes fluorescentes disponibles de poisson zèbre. Cette méthode peut facilement être appliquée à d’autres bactéries anaérobies intestinales, telles que Bacteroides fragilis et Helicobacter hepaticus. Les résultats représentatifs démontrent que les neutrophiles et les macrophages peuvent reconnaître et phagocytose C. difficile chez le poisson zèbre infecté.
Les méthodes d’immersion et de microinjection ont été régulièrement utilisées pour infecter le poisson zèbre20,21,22. L’utilisation de méthodes d’immersion est simple, mais cette approche rend difficile de contrôler avec précision le temps d’invasion des bactéries dans l’intestin. La microinjection est la méthode la plus courante pour infecter les embryons de poissons zèbres avec des agents pathogènes, mais elle cause invariablement des lésions tissulaires. Par conséquent, le microgavage a été employé pour imiter la voie normale d’infection.
Cependant, il a été constaté que le C. difficile teinté de colorant est devenu indétectable autour de 5 h post-microgavage. Les raisons de cela ne sont pas claires à l’heure actuelle, mais peuvent être liées soit à l’intolérance 1) du fluorophore dans des conditions intestinales ou 2) l’initiation de la formation de spores de cellules C. difficile. On a en outre constaté que le C. difficile n’était pas détectable dans la culture des homogénéités de larves entières. Par conséquent, l’intestin de chaque poisson zèbre infecté a été disséqué puis cultivé pour déterminer si C. difficile habitait encore le tissu intestinal du poisson zèbre.
En raison du microbiote indigène des souris conventionnelles, seules les souris prétraitées avec un cocktail antibiotique ou des souris gnotobiotiques sont sensibles au C. difficile16. De même, il a été constaté que c. difficile n’a été détecté que dans les intestins du poisson zèbre gnotobiotique, mais pas chez les poissons zèbres de type sauvage conventionnel 24 h après l’infection. Fait intéressant, les échantillons intestinaux de 48 h, 72 h et 120 h de poisson zèbre post-infection n’ont augmenté que dans les médias contenant du TCA. Comme décrit ci-dessus, TCA stimule la germination des spores C. difficile in vitro. Ce résultat suggère que les cellules actives de C. difficile ont déjà formé des spores végétatives dans l’intestin de poisson zèbre, et des colonies spore-dérivées ont été détectées utilisant l’approche de microgavage.
Curieusement, le poisson zèbre sans germes ne présentait toujours aucun symptôme d’ICD, comme l’afflux de neutrophiles intestinaux ou même la mort du poisson zèbre. Cela montre que l’infection par injection peut activer les cellules immunitaires innées par la plaie et que seuls les macrophages activés et les neutrophiles sont capables de détecter rapidement C. difficile. En outre, une explication probable de l’absence d’IcD éminent chez le poisson zèbre est basée sur les différences structurelles entre le poisson zèbre et les intestins des mammifères17. L’intestin du poisson zèbre manque de cryptes intestinales, où C. difficile sont fréquemment situés18. Avec la température d’entretien plus faible du poisson zèbre par rapport à celle des mammifères, on a déduit que l’arrivée de l’ID chez le poisson zèbre ne se produit pas aussi vite que chez les mammifères. Cependant, deux bactéries anaérobies du microbiote humain, Lactobacillus paracasei et Eubacterium limosum, ont été prouvées pour se développer à l’intérieur de l’intestin de poisson zèbre19. Les progrès techniques présentés ici encourageront les applications de cette méthode à l’étude du C. difficile et d’autres bactéries ou agents pathogènes dérivés de l’intestin des mammifères chez les larves de poissons zèbres moléculairement traitables in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Timo Fritsch pour les excellents soins aux animaux. Nous remercions les membres des laboratoires de Kôster et Steinert pour leur soutien et leurs discussions utiles. Nous remercions le Dr Dandan Han d’avoir lu le manuscrit. Nous remercions le financement de l’Etat fédéral de Basse-Saxe, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
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