Summary
In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicate nell'iniziazione del tumore, nello sviluppo e nella recidiva dopo il trattamento e sono diventate al centro dell'attenzione di molti studi negli ultimi decenni. Pertanto, è importante sviluppare metodi per studiare il ruolo dei geni chiave coinvolti nella staminalità delle cellule tumorali. Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di cancro. Si ritiene che le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) siano la radice della ricaduta del cancro gastrico, della metastasi e della resistenza ai farmaci. Comprendere la biologia dei GCSCs è necessario per far progredire lo sviluppo di terapie mirate e, infine, per ridurre la mortalità tra i pazienti. In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
Introduction
Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di tumori1. Nonostante i progressi nella chirurgia combinata, chemioterapia e radioterapia nella terapia GC, la prognosi rimane scarsa e il tasso di sopravvivenza a cinque anni è ancora molto basso2. La ricorrenza e la metastasi sono le ragioni principali che causano i decessi post-trattamento.
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono un sottoinsieme di cellule tumorali che possiedono la capacità di auto-rinnovarsi e generare le diverse linee cellulari che ricostituire il tumore3. Si ritiene che i CSC siano responsabili della ricaduta e della metastasi del cancro a causa delle loro capacità di auto-rinnovamento e semina di nuovi tumori, così come la loro resistenza alle tradizionali chemio e radioterapie4. Pertanto, il targeting per i CSC e l'eliminazione delle CSC offrono un potenziale entusiasmante per migliorare il trattamento e ridurre la mortalità dei pazienti oncologici.
I CSC sono stati isolati da molti tipi di tumori solidi5. Nel 2009, le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) isolate dalle linee cellulari del cancro gastrico umano sono state originariamente descritte da Takaishi et al.6. Chen e colleghi hanno in primo luogo identificato e purificato i GCSC dai tessuti tumorali dell'adenocarcinoma gastrico umano (GAC)7. Questi risultati non solo forniscono l'opportunità di studiare la biologia dei GCSCs, ma forniscono anche grande importanza clinica.
Una caratteristica particolare dei CSC è la loro capacità di formare una sfera8. Le singole cellule sono placcate in condizioni non aderenti a bassa densità, e solo le cellule possedute dall'auto-rinnovamento possono crescere in un solido ammasso sferico chiamato sfera. Pertanto, il saggio sulla formazione della sfera è stato considerato come il saggio gold standard e ampiamente utilizzato per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali in vitro.
L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un potente strumento di ricerca per studiare la funzione genica mediante l'abbattimento di un genespecifico 9. Tuttavia, le tecnologie di abbattimento genico stabili a lungo termine hanno alcune limitazioni, come la sfida di esplorare la funzione di un gene che è essenziale per la sopravvivenza cellulare. I sistemi RNAi condizionali possono essere utili per la downregolazione dei geni desiderati in modo temporale e/o controllato speciale dalla somministrazione di un agente induttivo. I sistemi indutbili di tetraciclina (Tet) sono uno dei sistemi RNAi condizionali più utilizzati10. I sistemi indutbili di Tet possono indurre il silenziamento genico bersaglio controllando l'espressione dello shRNA su aggiunta di un induttore esogeno (preferibilmente doxycycline, Dox). I sistemi Tet-inducible possono essere suddivisi in due tipi: sistemi Tet-On o Tet-Off. L'espressione di shRNA può essere attivata (Tet-On) o spenta (Tet-Off) in presenza dell'indottore. Nel sistema Tet-ON senza un induttore, il reprimere Tet (TetR) espresso in modo costitutivo si lega alla sequenza di elementi Tet-responsive (TRE) contenente un promotore dipendente da Pol III per l'espressione shRNA, reprimendo così l'espressione dello shRNA. Mentre su aggiunta di Dox, il TetR è sequestrato lontano dal promotore Tet-responsive Pol III-dipendente. Questo facilita l'espressione dello shRNA e porta al knockdown genico.
Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di shRNA inducibile in tetraciclino funzionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare la funzione della clusterina nei GCSC derivati dalpaziente. Usiamo il protocollo descritto per studiare gli effetti della clusterina nell'auto-rinnovo dei GCSC. Questa metodologia è applicabile anche ad altri tipi di cellule staminali tumorali.
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Protocol
Tutte le sperimentazioni con cellule staminali gastriche derivate dal paziente sono state approvate nel documento del comitato eticolocale 7.
1. Coltura delle cellule staminali del cancro gastrico
- Preparazione dei GCSC completa coltura media
- Preparare il mezzo di coltura completa GCSC aggiungendo un mezzo DME/F12 fresco con i seguenti ingredienti essenziali: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% insulina/Transferrin/Sodium selenite, 0,2% glucosio, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoacido non essenziale, 10 M 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 tioglicerolo da 100 M, 100 penicillina IU/mL e 100 g/mL streptomicina. Filtrare e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
NOTA: si consiglia di memorizzare il supporto di coltura completo GCSC preferibilmente non più di due settimane a 4 gradi centigradi.
- Preparare il mezzo di coltura completa GCSC aggiungendo un mezzo DME/F12 fresco con i seguenti ingredienti essenziali: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% insulina/Transferrin/Sodium selenite, 0,2% glucosio, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoacido non essenziale, 10 M 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 tioglicerolo da 100 M, 100 penicillina IU/mL e 100 g/mL streptomicina. Filtrare e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
- Recupero di GCSC e cultura
NOTA: I GCSC sono stati ottenuti come segue: I campioni di tumore sono stati sottoposti a dissociazione meccanica ed ezimatica. Le sospensioni a singola cella sono state ottenute filtrando con rete di nylon da sospensioni ben disperse. Le cellule tumorali risultanti sono state coltivate in GCSCs Complete Culture Medium, e alcune cellule sono cresciute fino a formare sfere. Queste sfere sono state poi sottoposte a dissociazione ezimatica, e i GCSC possono essere ottenuti mediante smistamento citofluorometrico della popolazione cellulare macchiata con marcatori CD44/CD54. Il protocollo dettagliato e gli analisi funzionali dei GCSC sono stati riportati7.- I GCSC pre-caldi completano il mezzo di coltura a 37 gradi centigradi per non più di 30 minuti.
- Scongelare i GCSC dallo stoccaggio dell'azoto liquido e dal rapido scongelamento dei criovials in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. Continua a vorticoso le fiale fino a quando l'intero contenuto si scioglie totalmente.
NOTA: Scongelare rapidamente le cellule congelate (<1 min) in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. - Trasferire l'intero contenuto dei criovials in un tubo di centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di coltura completa GCSC. Centrifuga a 800 x g per 5 min a RT.
- Aspirare il supernatant con attenzione e sospendere il pellet cellulare in 10 mL di gcSCs mezzo completo fresco. Piastra la sospensione cellulare in una piastra Petri da 100 mm. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice 5% CO2 e aggiungere 5 mL di mezzo fresco completo il terzo giorno.
- Sottocultura delle gcSCs
NOTA: I GCSC del centro delle cellule hanno solo nutrienti sufficienti prima che le sfere abbiano una dimensione fino a 80-100 m di diametro. Una volta che appaiono sfere di refattività scure e basse (circa 6 giorni di coltura), è necessario sottoculturare le sfere tumorali.- Agitare delicatamente il piatto e trasferire il mezzo di coltura della coltura della coltura della coltura della cisfera tumorale GCSCs (il mezzo e le tasse tumorali non aderenti) in un tubo sterile di centrifuga da 15 mL. Per volumi medi più grandi, potrebbero essere necessari tubi di centrifuga più grandi.
- Centrifuga a 600 x g per 5 min e smaltire con cura il supernante. Dopo la centrifugazione, sarà visibile un pellet bianco e calato.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare per riesmirne il pellet per la dissociazione meccanica ed ezimatica a 37 gradi centigradi. Pipetta delicatamente su e giù 10 volte ogni 2-3 minuti nella procedura di digestione per rompere le sfere fino a quando le cellule tumorali sono disperse in sospensione a singola cellula. Questo processo di dissociazione totale è raccomandato per essere inferiore a 15 min.
NOTA: Eseguire un controllo visivo al microscopio per verificare che non rimangano grandi sfere o aggregati di cellule. - Aggiungere 10 mL di GCSCs freschi pre-riscaldati mezzo di coltura completa (5 volte il volume della soluzione di distacco cellulare) per terminare la procedura di digestione e centrifugare a 800 x g a RT per 5 min.
- Scartare il supernatant e risundere le cellule con 1 mL di fresco mezzo di coltura completa pre-riscaldata. Semina un numero adeguato di cellule in un nuovo piatto Petri da 100 mm con 10 mL di GCSC freschi pre-riscaldati completano il mezzo di coltura e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Rifinanziato le colture di tumori dopo 3 giorni con l'aggiunta di 5 mL di mezzo fresco pre-riscaldato completo. Dopo 6 giorni, le cellule di passaggio quando le cellule tumorali crescono fino a 80-100 m di diametro.
- Crioconservazione dei GCSC
NOTA: Non crioconservare le cellule GCSC aggiungendo direttamente le cellule medie alle cellule tumorali. Le cellule tumorali GCSCs devono essere digerite in singole cellule in modo che l'agente protettivo cellulare possa entrare in ogni cellula per garantire l'immagazzinamento stabile a lungo termine delle cellule. Assicurarsi che le cellule siano in una situazione sana e senza contaminazione.- Raccogliere le cellule gcSCs. Centrifuga a 600 x g per 5 min.
- Scartare il supernatant e aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare per dissociare le cellule tumorali GCSCs a 37 gradi centigradi. Terminare la procedura di digestione aggiungendo 10 mL di gcSC completo supporto di coltura.
- Centrifuga a 800 x g per 5 min e raccogliere singoli GCSC.
- Sospendere delicatamente i GCSC con mezzo crioconservatorio privo di siero. La concentrazione finale raccomandata è 5 x 105 - 5 x 106 celle/mL.
- Erogare la sospensione cellulare in aliquots da 1 mL in fiale criogeniche marcate.
- Posizionare immediatamente i criovials contenenti le cellule in una camera isopropanolo e conservarli a -80 gradi centigradi. Trasferire le fiale in azoto liquido il giorno successivo per lo stoccaggio a lungo termine.
2. Generazione di linee GCSCs knockdown inducibili
CAUTION: Le lentivirus ricombinanti sono state designate come organismi di livello 2 dal National Institute of Health and Center for Disease Control. Il lavoro che coinvolge il lentivirus richiede il mantenimento di una struttura di Biosafety Level 2, considerando che i supernatanti virali prodotti da questi sistemi lentivirali potrebbero contenere virus ricombinanti potenzialmente pericolosi.
- Generazione di particelle di lentivirus
- Sintetizzare 2 vettori lentivirali che trasportano shRNA inducibili mirati a clusterina umana e un vettore lentivirale di controllo non bersaglio (GV307) di GeneChem basato sulla progettazione della tabella 1 (il vettore GV307 contiene: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Seme 4 x 106 293T cellule di confezionamento lenti-virali in un piatto Petri da 100 mm con 10 mL di DMEM integrato con siero bovino fetale al 10%.
- Incubare le cellule 293T durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Assicurarsi che la densità delle cellule 293T sia circa il 50-80% confluente il giorno della trasfezione.
- Portare il siero ridotto a temperatura ambiente e preparare il tubo A e il tubo B come descritto nella tabella 2.
- Trasferire il tubo A nel tubo B, mescolare bene e incubare i complessi per 20 minuti a temperatura ambiente per preparare complessi lipidico-DNA.
- Rimuovere 5 mL di media, prima di aggiungere il complesso lipidico-DNA, lasciando un totale di 5 mL.
- Aggiungere 5 mL di complesso lipidico-DNA nel piatto di coltura dropwise e girare delicatamente il piatto per distribuire il complesso.
NOTA: Erogare con cura il liquido contro la parete del piatto per evitare di disturbare le cellule 293T. - Piatto di coltura incubato per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Dopo 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere con cura il mezzo di trasfezione e sostituire delicatamente con 10 mL di DMEM pre-riscaldato integrato con 10% FBS. Incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
NOTA: Tutti i supernatant e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento. - Circa dopo 48 ore dopo la trasfusione, raccogliere 10 mL di supernatanti contenenti lentivirus.
NOTA: Tutti i vasi e le punte di coltura cellulare devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento. - Filtrare il supernatant lentivirale utilizzando un filtro poro da 0,45 m per rimuovere i detriti cellulari.
NOTA: Tutti i filtri e le siringhe devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento. - Trasferire il supernatant chiarito in un contenitore sterile, aggiungere Lenti-X Concentrator (1/3 volume di supernatant chiarito) da mescolare per inversione delicata.
- Miscela di incubazione a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Campioni di centrifuga a 1.500 x g per 45 min a 4 gradi centigradi. Dopo la centrifugazione, e pellet bianco sarà visibile. Rimuovere con attenzione supernatant, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
NOTA: Tutti i supernatant e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento. - Rispendere delicatamente il pellet in 1 mL di DMEM integrato con 10% FBS come stock di virus, negozio a -80 gradi centigradi.
- Generazione di linee cellulari trasfettate stabili
- Seme 6 x 106 GCSC in un piatto Petri da 100 mm con DMEM da 10 mL integrato con 10% FBS per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2 (70-80% di confluenza prima dell'infezione).
- Aspirare il mezzo nel piatto, aggiungere le particelle lentivirali concentrate diluite con 4 mL di mezzo DMEM completo contenente reagente di polibrene (5 g/mL) nel piatto. Incubare per 18 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
NOTA: La concentrazione ottimale di polibrene dipende dal tipo di cellula e potrebbe essere necessario testare in diverse concentrazioni per decidere le concentrazioni effettive. In caso contrario, può essere determinato empiricamente, di solito nell'intervallo di 2-10 g/mL. Tutti i tubi e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento. - Cambiare il mezzo, sostituire con 10 mL di DMEM con 10% FBS medio e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
NOTA: Tutto il mezzo e le punte devono essere trattati con 10% di candeggina prima dello smaltimento. - Aspirare il supernante con detriti cellulari, sostituire con DMEM fresco integrato con 10% di supporto FBS contenente puramicina (2,5 g/mL) e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Sostituire quindi il DMEM fresco integrato con un supporto FBS al 10% contenente puromicina (5 g/mL) e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per ulteriori 24 h.
- Sciacquare due volte i GCSC aderenti con 5 mL di DPBS senza calcio e magnesio.
- Dissociare i GCSC con 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare pre-riscaldata e incubare 2-3 min a 37 gradi centigradi.
- Aggiungere 5 mL di gcSCs freschi pre-riscaldati media di coltura completa alla sospensione cellulare.
- Erogare 3 mL in un tubo centrifugo da 15 mL (tubo A) per crioconservare le cellule, mentre gli altri 3 mL in un tubo centrifugo da 15 mL (tubo B) per indurre la doxycycline.
- Tubo centrifugare A e tubo B a 800 x g per 5 min.
- Rispendere il pellet del tubo A con 1 mL di mezzo criopreservativo privo di siero, trasferire la fiala a -80 gradi centigradi durante la notte e rimuoverla in un deposito di azoto liquido.
- Aspirare il supernante e risundere le cellule del tubo B in 1 mL di nuovi gcSC pre-riscaldati completa media di coltura. Seme un numero appropriato di cellule in un nuovo piatto Petri da 100 mmL di 10 mL GCSC freschi pre-riscaldati completano il mezzo di coltura con doxycycline (Dox) (2,5 g/mL) e incubato per 48 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
NOTA: La concentrazione ottimale di Dox può variare tra le linee cellulari. Ogni linea cellulare deve essere testata in diverse concentrazioni di Dox per decidere le concentrazioni effettive per KD e per la tossicità sulle cellule. - Confermare la repressione stabile della clusterina in GCSC da parte del blotting occidentale.
3. Analisi della formazione della sfera
- Scongelare le linee GCSCs induttivi di knockdown congelate (vedere il punto 1.2).
- Determinare la densità delle cellule praticabili di un campione di 10 L utilizzando un contatore automatico delle cellule.
- Regolare il volume con il supporto di coltura completo pre-riscaldato GCSC per ottenere una concentrazione di 2 x 104 celle vitali/mL.
- Erogare in 3 nuovi pozzi di coltura ultra-basso-attaccamento (0,1 mL/pozzo) ogni gruppo.
- Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% CO2. La formazione della sfera dovrebbe avvenire entro 3-10 giorni. Monitorare e registrare la visualizzazione della formazione delle cellule ogni 2 giorni.
NOTA: Il mezzo non è raccomandato per essere cambiato in caso di qualsiasi disturbo della formazione delle cellule tumorali. Queste cellule tumorali devono essere facilmente distinte dalle cellule singole e aggregate. - Determinare i risultati della formazione della tumoros facendo valutazione delle dimensioni delle cellule formate utilizzando un software di imaging.
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Representative Results
Le cellule staminali del cancro gastrico dell'adenocarcinoma gastrico umano primario sono state covate in un mezzo di coltura privo di siero. Dopo 6 giorni, le cellule si sono espanse dal fenotipo a cella singola (Figura 1A) per formare sfere di grandi dimensioni (Figura 1B).
Per valutare la funzione della clusterina nei GCSC, le sequenze shRNA contro clusterin e scrambled sono state clonate nel vettore Tet-GV307-RFP-Puro seguendo il protocollo descritto in precedenza. I GCSC sono stati generati in modo stabile con un vettore di espressione shRNA-clusterin regolato dalla tetraciclina e quindi trattati con doxycycline per 48 h (Figura 2) (e shRNA strapazzato come controllo). Il livello di espressione di clusterin è stato verificato da western blot e successivamente quantificato da densitometry (Figura 3).
Il saggio sulla formazione della sfera è stato utilizzato per testare il potenziale di auto-rinnovamento dei GCSC. Abbiamo ipotizzato che la clusterina promuova il potenziale di auto-rinnovamento dei GCSC, e quindi meno sfere dovrebbero essere osservate quando la clusterina è downregulated dall'aggiunta di doxycycline. Abbiamo dimostrato che la presenza di doxycycline e knockdown della clusterina in GCSC inibito la formazione della tumora(Figura 4). Le dimensioni delle cellule/sfere dei GCSC non aumentavano quando la clusterina è stata ridotta nei GCSC (Figura 5). Nessuna inibizione della formazione della tumoros è stata osservata con i GCSC trasdotti con i controlli di shRNA strapazzate, indicando che la doxycycline non aveva alcun effetto inibitorio sulla formazione della tumoros (Figura 5). Questi risultati hanno suggerito che dopo il silenziamento della clusterina, i GCSC crescono lentamente e non possono formare le cellule tumorali. Sulla base dei dati in vitro, la clusterina svolge un ruolo fondamentale nel promuovere l'attività di auto-rinnovamento dei GCSC, indicando che la clusterina potrebbe essere un obiettivo promettente per i farmaci nella soppressione dei CSC nei pazienti affetti da GC.
Figura 1: colture cellulari di cellule staminali tumorali gastrici. Le colture a singola cellula di cellule staminali gastriche sono state colture per 6 giorni. Le immagini microscopiche a contrasto di fase di queste cellule/sfere sono state scattate al giorno 0 (A) e al giorno 6 (B). Ingrandimento originale: 10x. Dimensione della barra: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: KD condizionale dell'espressione della clusterina nelle cellule staminali del cancro gastrico. Le linee GCSC sono state stabilite infettando il controllo dello shRNA inducibile lentivirale (shCtrl) o lo shRNA inducibile che puntano la clusterina (shClu1, shClu2). Queste linee cellulari sono state trattate con (Dox) o senza Dox (2,5 g/mL) (Dox-) per 48 h come indicato. L'osservazione del contrasto di fase di queste cellule è stata mostrata nel pannello superiore. L'osservazione immunofluorescente (rosso) di queste cellule è stata mostrata nel pannello inferiore. Ingrandimento originale: 10x. Dimensione della barra: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione di Clusterin nelle linee GCSCs knockdown inducibili con o senza trattamento Dox. Analisi del gonfiore occidentale dell'espressione della clusterina in linee cellulari stabilmente trafettate con shRNA-clusterina regolata dalla tetraciclina (shClu1, shClu2) e vettore di espressione strapazzata (shCtrl) dopo 2 giorni di trattamento della doxycycline. Il livello di espressione relativa della clusterina è stato quantificato dalla densitometria e normalizzato contro β-actin, poi è stato indicato sotto le corsie delle macchie occidentali. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini microscopiche a contrasto di fase di cellule/sfere GCSCs knockdown inducibili. Una singola cellula di linee GCSC knockdown inducibili sono state incubate e trattate senza Dox (pannello superiore) o con Dox (pannello inferiore) per 6 giorni. Le immagini microscopiche a contrasto di fase di queste cellule/sfere sono state scattate al giorno 6 come indicato. Ingrandimento originale: 10x. Barra della scala, 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'abbattimento inducibile di Clusterin inibisce la capacità di auto-rinnovo gcSC. I test di formazione della sfera sono stati eseguiti nelle linee inducibili dei GCSC knockdown. Le immagini microscopiche a contrasto di fase di queste cellule/sfere sono state scattate al giorno indicato e sono state misurate le dimensioni delle cellule/sfere dei GCSC. n>30, ± errore standard della media (SEM). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome di Gene | Specie | Gene ID | Sequenza di targeting |
| CLU-1 | Umano | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | Umano | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Tabella 1: Due sequenze di puntatura shRNA contro la clusterina.
| Componente | Volume |
| Tubo A | |
| Ridotto Siero Medio | 1,5 mL |
| Reagente di trasfezione | 41 L |
| Tubo B | |
| Ridotto Siero Medio | 1,5 mL |
| Reagente potenziatore P3000 | 35 L |
| pHelper 1.0 (componente gag/pol) | 9 g |
| pHelper 2.0 (componente VSVG) | 6 g |
| shCLU 1/2 o plasmide di controllo | 12 g |
Tabella 2: Scala della produzione virale mediante la trasfezione.
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Discussion
La GC è la terza causa di morte legata al cancro in tutto il mondo. I GCSC sono fondamentali nella ricaduta del cancro gastrico, nella metastasi e nella resistenza ai farmaci. L'utilizzo di GCSC da pazienti affetti da cancro gastrico ci permetterà di esplorare il loro punto debole e sviluppare i farmaci di targeting per il trattamento dei pazienti affetti da GC.
Il saggio sulla formazione della sfera è un metodo utile per esaminare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali tumorali in vitro. I risultati possono essere presentati come la percentuale di sfere formate divisa per il numero originale di singole celle testate. Abbiamo adattato il metodo originale per calcolare le dimensioni media di tutte le cellule / sfere in diversi punti di tempo per migliorare i risultati di questo saggio e per facilitare la sua riproducibilità per altri tipi di cellule staminali tumorali. Abbiamo certificato che il risultato in questo saggio dipende fortemente dal numero delle cellule di semi iniziali. Questo è un punto critico di questo saggio per mantenere l'isolamento iniziale delle cellule ed effettuare una misurazione accurata del numero di colonie sferiche (escluse le aggregazioni cellulari). Inoltre, è importante ottimizzare il tempo di conteggio per distinguere chiaramente le sfere dalle aggregazioni cellulari e dalle singole celle.
I sistemi induttori di Tet sono utili per studiare la funzione dei geni che sono cruciali per la sopravvivenza cellulare in vitro, proprio come la clusterina in questo protocollo. Sono utili anche per l'esplorazione funzionale dei geni in vivo; questo può essere fatto aggiungendo doxycycline nell'acqua potabile degli animali. Tuttavia, la perdita nello stato non indotto è un problema spesso segnalato dei sistemi Tet-inducibili12. Nell'esperimento presentato, un basso livello di perdita viene osservato anche con shClu2, come illustrato nella Figura 3. In questo caso, possiamo confrontare attentamente i cambiamenti della proteina bersaglio in KD o il controllo strapazzato rilevato in presenza e assenza di doxycycline per valutare questo effetto. Un altro punto importante è la quantità di doxycycline applicata nella cultura. Come la quantità di Dox può variare tra le linee cellulari, ogni linea cellulare deve essere testato con diversi dosaggi Dox per decidere le concentrazioni effettive per KD e per la tossicità sulle cellule.
Il protocollo qui presentato fornisce una tecnica efficiente per decifrare i geni correlati allo stelo dei CSC e studiare la biologia dei CSC. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare le funzioni di altri geni critici nelle cellule staminali tumorali, come l'staminalità e la sopravvivenza. Inoltre, l'abbattimento condizionale dell'espressione genica nei CSC è possibile studiare le funzioni biologiche dei geni bersaglio non solo in vitro ma anche in vivo. Tuttavia, solo alcuni CSC potrebbero non formare tumori solidi e tipici, questo protocollo dovrebbe essere adattato utilizzando altri metodi per esaminare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali tumorali in vitro, ad esempio esaminando l'espressione dei marcatori correlati alla derivazione.
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Disclosures
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nature Science Foundation della provincia del Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Medical Scientific Research Foundation della Provincia del Guangdong (A2019405), la National Natural Science Foundation of China (81772957), la Science and Programma tecnologico della provincia del Guangdong in Cina (2017B030301016) e la Industry and Information Technology Foundation di Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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