Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.
Abstract
תאי גזע סרטניים (CSCs) מעורבים חניכה גידול, התפתחות והישנות לאחר הטיפול, והפכו למרכז תשומת הלב של מחקרים רבים בעשורים האחרונים. לכן, חשוב לפתח שיטות לחקור את התפקיד של גנים מרכזיים המעורבים גזע תאים סרטניים. סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר של סרטן. תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) נחשבים השורש של נסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. הבנת ביולוגיה GCSCs נדרש כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים ממוקדים ובסופו של דבר כדי להפחית את התמותה בקרב חולים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.
Introduction
סרטן קיבה (GC) הוא אחד הסוגים הנפוצים ביותר ומוות של סרטן1. למרות ההתקדמות בניתוח משולב, כימותרפיה והקרנות בטיפול GC, הפרוגנוזה נשארת עניה שיעור ההישרדות של חמש שנים הוא עדיין נמוך מאוד2. הישנות וגרורות הן הסיבות העיקריות לגרום למוות שלאחר הטיפול.
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת קבוצה של תאים סרטניים בעלי היכולת לחדש את עצמו וליצור את תריסות התא השונות לשחזר את הגידול3. CSCs הם האמינו להיות אחראי על נסיגה סרטן גרורות בשל היכולות שלהם של התחדשות עצמית ותזיטת גידולים חדשים, כמו גם ההתנגדות שלהם כימותרפיה מסורתית- ורדיותרפיות4. לכן, מיקוד CSCs וחיסול של CSCs לספק פוטנציאל מרגש כדי לשפר את הטיפול ולהפחית את התמותה של חולי סרטן.
CSCs כבר מבודדים מסוגים רבים של גידולים מוצקים5. בשנת 2009, תאי גזע סרטן הקיבה (GCSCs) מבודדים קווי תאים סרטניים קיבה אנושיים תוארו במקור על ידי Takaishi ואח'6. חן ועמיתיו זיהו לראשונה ומטוהרים GCSCs מ אדנוקרצינומה קיבה אנושית (GAC) רקמות גידול7. ממצאים אלה לא רק מספקים הזדמנות ללמוד ביולוגיה GCSCs, אלא גם לספק חשיבות קלינית רבה.
מאפיין מסוים של CSCs הוא היכולת שלהם ליצור כדור8. תאים בודדים מצופה בתנאים לא דביקים בצפיפות נמוכה, ורק התאים בעלי התחדשות עצמית יכולים לגדול לתוך אשכול מוצק וכורי הנקרא כדור. לכן, ההתווייה של היווצרות הכדור נחשבה ל-assay תקן הזהב ונעשה בה שימוש נרחב להערכת פוטנציאל החידוש העצמי של תאי גזע במבחנה.
הפרעות RNA (RNAi) הוא כלי מחקר רב עוצמה כדי ללמוד את תפקוד הגנים על ידי נוק-דאון של גן מסוים9. עם זאת, טכנולוגיות נוק-דאון גנים יציבים לטווח ארוך יש מגבלות מסוימות, כגון האתגר של חקר הפונקציה של גן חיוני להישרדות תאים. מערכות RNAi מותנות יכולות להיות שימושיות לרישום של הגנים הרצויים באופן זמני ו/או מבוקר מיוחד על ידי ניהול של סוכן גורם. מערכות טטרציקלין (Tet)-inducible הן אחת ממערכות RNAi המותנות הנפוצות ביותר10. מערכות Tet-inducible יכול לגרום השתקת גנים היעד על ידי שליטה הביטוי של shRNA בתוספת של גורם אקסוגני (דוקסיציקלין עדיף, דוקס). ניתן לחלק את מערכות Tet-inducible לשני סוגים: מערכות Tet-On או Tet-Off. ניתן להדליק את הביטוי shRNA (Tet-On) או לכבות (Tet-Off) בנוכחות ה-inducer. במערכת Tet-ON ללא גורם, המדכא Tet (TetR) התבטא באופן קבוע כקושר לרצף הרכיב המגיב של Tet (TRE) המכיל יחצ"ן התלוי ב-Tet Pol III לביטוי shRNA, ובכך מדחיק את הביטוי של shRNA. בעוד עם תוספת של Dox, TetR מבודד מן היזם המגיב Tet Pol III תלוי. זה מקל על הביטוי של shRNA ומוביל לחיסול גנים.
הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מערכת shRNA טטרציקלין-בלתי ניתן להושר ומערכת היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את הפונקציה של clusterin ב GCSCs נגזר המטופל. Clusterin זוהה כמוקולת מפתח רומן לשמירה על הגזע והישרדות של GCSCsבמחקר קודם 11. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי ללמוד את ההשפעות של clusterin ב-GCSCs התחדשות עצמית. מתודולוגיה זו ישימה גם על סוגים אחרים של תאי גזע סרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים באמצעות תאי גזע סרטן קיבה נגזר המטופל המתוארים בכאן אושרו על ידי הוועדה האתית המקומית7.
1. סרטן הקיבה תרבות תאי גזע
- הכנת GCSCs תרבות מלאה בינונית
- להכין GCSCs תרבות מלאה בינוני על ידי הוספת טרי DME / F12 בינוני עם המרכיבים החיוניים הבאים: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% אינסולין / Transferrin / נתרן סלניט, 0.2% גלוקוז, 0.5% B27, 1% גלוטמקס, 1% חומצת אמינו לא חיונית, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0.75 מ"ג/מ"ל NaHCO3,10 μM thioglycerol, 100 IU/mL פניצילין ו 100 μg/mL סטרפטומיצין. סינון ועיקור באמצעות מסנן 0.22 μm.
הערה: GCSCs להשלים תרבות בינוני מומלץ לאחסן רצוי לא יותר משבועיים ב 4 °C.
- להכין GCSCs תרבות מלאה בינוני על ידי הוספת טרי DME / F12 בינוני עם המרכיבים החיוניים הבאים: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% אינסולין / Transferrin / נתרן סלניט, 0.2% גלוקוז, 0.5% B27, 1% גלוטמקס, 1% חומצת אמינו לא חיונית, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0.75 מ"ג/מ"ל NaHCO3,10 μM thioglycerol, 100 IU/mL פניצילין ו 100 μg/mL סטרפטומיצין. סינון ועיקור באמצעות מסנן 0.22 μm.
- שחזור של GCSCs ותרבות
הערה: GCSCs הושגו כדלקמן: דגימות גידול היו נתונים לדיסוציאציה מכנית ואנזימטית. מתלים תא יחיד הושגו על ידי סינון עם רשת ניילון מתלים מפוזרים היטב. התאים הסרטניים וכתוצאה מכך היו תרבותיים GCSCs תרבות מלאה בינוני, וכמה תאים גדלו כדי ליצור ספירות. ספירות אלה היו נתון לאחר מכן דיסוציאציה אנזימטית, GCSCs ניתן להשיג על ידי מיון cytofluorometric של אוכלוסיית התא מוכתם סמני CD44/CD54. הפרוטוקול המפורט ומחשבים פונקציונליים של GCSCs דווחו7.- GCSCs חם מראש להשלים את החברה תרבות ב 37 ° C עבור לא יותר מ 30 דקות.
- להפשיר GCSCs מאחסון חנקן נוזלי ולהפשיר במהירות cryovials באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ממשיכים לערבב את הבקבוקונים עד שכל התוכן נמס לחלוטין.
הערה: הפשיר תאים קפואים במהירות (<1 דקות) באמבט מים של 37°C. - העבר את כל התוכן של cryovials לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של GCSCs תרבות מלאה מדיום. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב RT.
- לשאוף את supernatant בזהירות להשעות את גלולת התא ב 10 מ"ל של GCSCs טרי להשלים בינוני. לוח מתלה התא בצלחת פטרי 100 מ"מ. דגירה את הצלחת ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום שלם טרי ביום השלישי.
- תת-תרבות של גידולים GCSCs
הערה: GCSCs של מרכז גידולים יש רק מספיק חומרים מזינים לפני גודל הספירות גדל עד 80-100 μm קוטר. לאחר חשוך ונמוך שפירות שבירה מופיעים (על 6 ימים של תרבות), יש צורך תת תרבות הגידולים.- לנער את המנה בעדינות ולהעביר את GCSCs גידולים תרבית מדיום (המדיום ואת הגידולים שאינם דבקים) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל. עבור נפחים בינוניים גדולים יותר, ייתכן שיהיה צורך בצינורות צנטריפוגה גדולים יותר.
- צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ולהיפטר בזהירות של supernatant. לאחר צנטריפוגה, כדור לא לבן יהיה גלוי.
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה תא כדי לתבל מחדש את הכדור עבור דיסוציאציה מכנית ואנזימטית ב 37 °C. בעדינות צינור למעלה ומטה 10 פעמים כל 2-3 דקות בהליך העיכול כדי לשבור את הספירות לגזרים עד הגידולים מפוזרים לתוך מתלה תא יחיד. תהליך דיסוציאציה כולל זה מומלץ להיות פחות מ- 15 דקות.
הערה: בצע בדיקה חזותית מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שלא נותרו ספירות גדולות או אגרגטים של תאים. - הוסף 10 מ"ל של GCSCs מחממים מראש טריים מלאים תרבות בינונית (5 x את הנפח של פתרון הניתוק של התא) כדי לסיים את תהליך העיכול צנטריפוגה ב 800 x g ב RT במשך 5 דקות.
- בטל את supernatant ולתחות מחדש את התאים עם 1 מ"ל של GCSCs חם מראש טרי תרבות מלאה מדיום. זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת פטרי חדשה 100 מ"מ עם 10 מ"ל של GCSCs חם מראש טרי תרבות מלאה מדיום ותחבולות ב 37 °C, 5% CO2.
- להתרבות גידולים refeed לאחר 3 ימים על ידי הוספת 5 מ"ל של טרי מראש חם מדיום שלם. לאחר 6 ימים, מעבר תאים כאשר גידולים לגדול עד 80-100 μm קוטר.
- הקפאה של GCSCs
הערה: אין לחסוך בהקפאה תאי GCSCs על-ידי הוספת ספירות בינוניות לגידולים ישירות. גידולים GCSCs צריך להיות מעוכל לתאים בודדים, כך סוכן מגן תא יכול להיכנס לכל תא כדי להבטיח אחסון יציב לטווח ארוך של תאים. ודאו שהתאים במצב בריא וללא זיהום.- גידולים במבחני הבגרות של הקציר. צנטריפוגה ב-600 x גרם ל-5 דקות.
- בטל את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של פתרון דיסוציאציה תא לנתק גידולים GCSCs ב 37 °C. לסיים את תהליך העיכול על ידי הוספת 10 מ"ל של GCSCs להשלים את התרבות בינונית.
- צנטריפוגה ב- 800 x g למשך 5 דקות ולאסוף GCSCs יחיד.
- השעו בעדינות GCSCs עם מדיום הקפאה ללא סרום. הריכוז הסופי המומלץ הוא 5 x 105 - 5 x 106 תאים / מ"ל.
- לחלק את מתלה התא ב 1 מ"ל aliquots לתוך בקבוקונים קריוגניים מסומנים.
- מיד מניחים את ההקפאה המכילה את התאים בתא isopropanol ולאחסן אותם ב -80 °C. מעבירים את הבקבוקונים לחנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך.
2. הדור של קווי GCSCs נוק-דאון בלתי ניתן לכך
התראה: לנטיוירוסים רקומביננטיים הוגדרו כאורגניזמים ברמה 2 על ידי המכון הלאומי לבריאות והמרכז לבקרת מחלות. עבודה הכוללת lentivirus דורשת תחזוקה של מתקן Biosafety רמה 2, בהתחשב בכך supernatants ויראלי המיוצר על ידי מערכות עדנוויראליות אלה יכול להכיל וירוס רקומביננטי שעלול להיות מסוכן.
- דור חלקיקי לונטיוירוס
- סינתזה 2 וקטורים lentiviral נושאת shRNA בלתי ניתן להוכחה מיקוד אשכולות אנושיים וקטור לנטי ויראלי שליטה ללא מיקוד (GV307) מ GeneChem מבוסס על העיצוב של טבלה 1 (וקטור GV307 מכיל: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- זרע 4 x 106 293T עדנטי-ויראלי תאי אריזה לתוך 100 מ"מ פטרי צלחת עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום שורי עובר.
- דגירה 293T תאים לילה ב 37 °C, 5% CO2. ודא כי צפיפות תא 293T הוא על 50-80% confluent יום הטרנס-פקציה.
- הביאו את הנסיוב המופחת לטמפרטורת החדר והכנו את צינור A וצינור B כמתואר בטבלה 2.
- העברת צינור A לתוך צינור B, לערבב היטב, דגירה את המתחם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין תסביכי ה-DNA שומנים.
- הסר 5 מ"ל של מדיום, לפני הוספת קומפלקס שומנים-DNA, משאיר סך של 5 מ"ל.
- מוסיפים 5 מ"ל של תסביך שומנים-דנ"א לצלחת התרבות בעדינות ומערבבים בעדינות את המנה כדי להפיץ את המתחם.
הערה: לחלק בזהירות נוזל על קיר הצלחת כדי למנוע הפרעה 293T תאים. - דגירה צלחת תרבות עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO2.
- לאחר 24 שעות לאחר הטרנס-קדם-פעולה, הסר בזהירות את אמצעי הטרנס-פנדיטורי והחלף בעדינות ב-10 מ"ל של DMEM חם מראש בתוספת 10% FBS. דגירה ל-24 ש' ב-37°C, 5% CO2.
הערה: יש לטפל בכל הסופרנטנטים והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה. - כ-48 שעות לאחר הטרנס-תעבורה, קציר 10 מ"ל של נטי-וירוס המכילים על.על.
הערה: יש לטפל בכל כלי תרבות התאים וטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה. - לסנן את supernatant lentiviral באמצעות מסנן נקבוביות 0.45 μm כדי להסיר פסולת תאית.
הערה: יש לטפל בכל המסננים והמזרקים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה. - מעבירים את הסופרנט המובהר למכל סטרילי, מוסיפים את Lenti-X Concentrator (נפח של 1/3 של סופרנט מובהר) לערבב על ידי היפוך עדין.
- דגירה תערובת ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
- דגימות צנטריפוגות ב-1,500 x גרם למשך 45 דקות ב-4°C. לאחר צנטריפוגה, וכדור מחוץ ללבן יהיה גלוי. בזהירות להסיר supernatant, לדאוג לא להפריע את הכדור.
הערה: יש לטפל בכל הסופרנטנטים והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה. - בעדינות respenpened את הכדור ב 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS כמו מניות וירוס, לאחסן ב -80 ° C.
- יצירת קווי תאים יציבים הנגועים
- זרע 6 x 106 GCSCs לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ עם 10 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO2 (70-80% confluence לפני הזיהום).
- שאיפה המדיום בצלחת, להוסיף את חלקיקי lentiviral מרוכז מדולל עם 4 מ"ל של DMEM שלם בינוני המכיל ריאגנט פוליברן (5 μg / מ"ל) לתוך המנה. דגירה ל-18 ש' ב-37°C, 5% CO2.
הערה: הריכוז האופטימלי של פוליברן תלוי בסוג התא, ייתכן שיהיה צורך לבדוק בריכוזים שונים כדי להחליט על הריכוזים היעילים. אחרת, זה יכול להיות נקבע אמפירי, בדרך כלל בטווח של 2-10 μg / מ"ל. יש לטפל בכל הצינורות והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה. - שנה את המדיום, החלף ב- 10 מ"ל DMEM ב- 10% FBS בינוני ותדגירה למשך 24 שעות ב- 37°C, 5% CO2.
הערה: יש לטפל בכל המדיום והטיפים ב-10% אקונומיקה לפני ההשלכה. - לשאוף את supernatant עם פסולת תא, להחליף עם DMEM טרי בתוספת 10% FBS בינוני המכיל puromycin (2.5 μg / מ"ל) דגירה עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO2. לאחר מכן להחליף DMEM טרי בתוספת 10% FBS בינוני המכיל puromycin (5 μg / מ"ל) דגירה ב 37 ° C, 5% CO2 עבור 24 שעות נוספות.
- לשטוף את GCSCs דבק פעמיים עם 5 מ"ל של DPBS ללא סידן ומגנזיום.
- נתק GCSCs עם 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה תאים חם מראש דגירה 2-3 דקות ב 37 ° C.
- הוסף 5 מ"ל של GCSCs מחממים מראש טריים תרבות מלאה בינונית מתלה התא.
- לחלק 3 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל (צינור A) עבור cryopreserving התאים, ואת השני 3 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל (צינור B) עבור גורם על ידי דוקסיציקלין.
- צנטריפוגה צינור A וצינור B ב 800 x g עבור 5 דקות.
- תוסתה מחדש את הגלולה של צינור A עם 1 מ"ל של מדיום הקפאה ללא סרום, להעביר את הבקבוקון ל -80 מעלות צלזיוס בן לילה, ולהסיר אותו לאחסון חנקן נוזלי.
- לשאוף את supernatant ולזעוס מחדש את התאים של צינור B ב 1 מ"ל של GCSCs חם מראש טרי להשלים תרבות בינונית. זרע מספר מתאים של תאים לתוך צלחת פטרי חדשה 100 מ"מ של 10 מ"ל טרי GCSCs מחממים מראש תרבות מלאה בינוני עם דוקסיציקלין (דוקס) (2.5 μg / מ"ל) דגירה עבור 48 שעות ב 37 ° C, 5% CO2.
הערה: הריכוז האופטימלי של Dox עשוי להשתנות בין קווי התא. כל קו תא צריך להיבדק בריכוזי Dox שונים כדי להחליט את הריכוזים היעילים עבור KD ועל רעילות על התאים. - אשר דיכוי יציב של clusterin בGCSCs על ידי כתמים מערביים.
3. היווצרות כדור
- הפשיר את קווי GCSCs נוק-אאוט קפואים (ראה שלב 1.2).
- לקבוע צפיפות תא בת קיימא של מדגם 10 μL באמצעות מונה תא אוטומטי.
- כוונן את עוצמת הקול עם GCSCs חימום מראש תרבות מלאה בינוני כדי להשיג ריכוז של 2 x 104 תאים קיימא / מ"ל.
- לחלק לתוך 3 חדש 96-באר אולטרה-גם-קובץ-נמוך-קובץ תרבות צלחת בארות (0.1 מ"ל / גם) כל קבוצה.
- דגירה התאים ב אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2. היווצרות כדור צריכה להתרחש בתוך 3-10 ימים. לפקח ולתקליט את ההדמיה של היווצרות גידולים כל 2 ימים.
הערה: המדיום אינו מומלץ להשתנות במקרה של הפרעה כלשהי של היווצרות גידולים. גידולים אלה צריכים להיות נבדלים בקלות מתאים בודדים ומצטברים. - לקבוע תוצאות היווצרות גידולים על ידי הערכת הגדלים של גידולים שנוצרו באמצעות תוכנת הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי גזע סרטן הקיבה אדנוקרצינומה קיבה אנושית העיקרית היו תרבותיים במדיום תרבות ללא סרום. לאחר 6 ימים, התאים התרחבו מהפנוטיפ היחיד הדומה לתא (איור 1א') כדי ליצור ספירות גדולות (איור 1ב').
כדי להעריך את הפונקציה של clusterin ב GCSCs, רצפי shRNA נגד clusterin ו מקושקשות שוכפלו לתוך וקטור Tet-GV307-RFP-Puro בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. GCSCs באופן יציב transfected עם וקטור ביטוי shRNA-clusterin בוויסות טטרציקלין נוצרו ולאחר מכן טופלו עם דוקסיציקלין במשך 48 שעות(איור 2)(ו shRNA מקושקשות כפקד). רמת הביטוי של clusterin אומתה על ידי כתם מערבי ולאחר מכן כמתה על ידי densitometry (איור 3).
ההתווייה של הספירה שימשה לבחין פוטנציאל החידוש העצמי של GCSCs. שיערנו כי clusterin מקדם את פוטנציאל החידוש העצמי של GCSCs, ולכן יש לצפות פחות ספירות כאשר clusterin הוא downregulated על ידי תוספת של דוקסיציקלין. הוכחנו כי הנוכחות של דוקסיציקלין ונוק-דאון של clusterin ב GCSCs מעכב היווצרות גידולים(איור 4). גדלי התא/כדור של GCSCs לא גדלו כאשר clusterin צומצם בGCSCs (איור 5). אין עיכוב של היווצרות גידול נצפתה עם GCSCs המושרה עם בקרות shRNA מקושקשות, המציין כי דוקסיציקלין לא הייתה השפעה מעכבת על היווצרות הגידול(איור 5). תוצאות אלה הראו כי לאחר clusterin השתקה, GCSCs לגדול לאט ולא יכול ליצור גידולים. בהתבסס על הנתונים במבחנה, clusterin ממלא תפקיד קריטי בקידום פעילות החידוש העצמי של GCSCs, המציין כי clusterin יכול להיות יעד תרופה מבטיח בדיכוי CSCs בחולים GC.
איור 1: תרביות תאים של תאי גזע סרטניים קיבה. תרביות תאים בודדים של תאי גזע סרטן הקיבה היו תרבותיים במשך 6 ימים. תמונות מיקרוסקופיות של תאים/ספירות אלה צולמו ביום 0 (A) וביום 6 (ב). הגדלה מקורית: פי 10. גודל סרגל: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: KD מותנה של ביטוי clusterin בתאי גזע סרטן הקיבה. קווי GCSCs הוקמו על ידי הדבקת בקרת shRNA בלתי ניתן להוכחה lentiviral (shCtrl) או shRNA בלתי ניתן להוכחה מיקוד clusterin (shClu1, shClu2). קווי תא אלה טופלו עם (Dox+) או ללא Dox (2.5 μg/mL) (Dox-) במשך 48 שעות כפי שנו נ ציין. תצפית ניגודיות שלב של תאים אלה הוצגה בלוח העליון. תצפית חיסונית (אדום) של תאים אלה הוצגו בלוח התחתון. הגדלה מקורית: פי 10. גודל סרגל: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ביטוי של Clusterin בשורות GCSCs נוק-דאון בלתי ניתן לניכוי עם או בלי טיפול Dox. ניתוח הכתמים המערבי של ביטוי clusterin בקווי תאים באופן יציב transfected עם tetracycline מוסדר shRNA-clusterin (shClu1, shClu2) וקטור ביטוי מקושקשות (shCtrl) לאחר 2 ימים של טיפול דוקסיציקלין. רמת הביטוי היחסית של clusterin היה לכמת על ידי densitometry ומנורמל נגד β-actin, אז צוין מתחת לנתיבים של הכתמים המערביים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תמונות מיקרוסקופיות עם ניגודיות פאזה של תאי GCSCs/ספירות ללא תקנה. תא יחיד של קווי GCSCs נוק-דאון בלתי חדים היו דגירה וטופלו ללא Dox (הלוח העליון) או עם דוקס (הלוח התחתון) במשך 6 ימים. תמונות מיקרוסקופיות של תאים/ספירות אלה צולמו ביום 6 כפי שצוין. הגדלה מקורית: פי 10. סרגל קנה מידה, 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: נוק-דאון בלתי ניתן להוות של Clusterin מעכב את יכולת החידוש העצמי של GCSC. התצורות של כדור בוצעו בקווי GCSCs נוק-דאון בלתי ניתן לכך. תמונות מיקרוסקופיות של תאים/ספירות אלה צולמו ביום שצוין, וגדלי התא/כדור של GCSCs נמדדו. n>30, ± שגיאה סטנדרטית של משמעות (SEM). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| שם ג'ין | מינים | מזהה ג'ין | רצף פילוח |
| CLU-1 | אנושי | 1191 | מלונות ב- ב-1000 |
| CLU-2 | אנושי | 1191 | ג'יאגאגטגטגאט |
טבלה 1: שני רצפי מיקוד shRNA נגד clusterin.
| רכיב | אמצעי אחסון |
| שפופרת A | |
| סרום מופחת בינוני | 1.5 מיליון ל'. |
| ראגנט טרנסאפציה | 41 μL |
| שפופרת B | |
| סרום מופחת בינוני | 1.5 מיליון ל'. |
| P3000 משפר רייגנט | 35 μL |
| pHelper 1.0 (רכיב איסור פרסום/פול) | 9 μg |
| pHelper 2.0 (רכיב VSVG) | 6 μg |
| shCLU 1/2 או שליטה פלסמיד | 12 μg |
טבלה 2: היקף הייצור הויראלי באמצעות טרנסאפציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GC הוא הגורם המוביל השלישי למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם. GCSCs הם קריטיים בנסיגה סרטן הקיבה, גרורות והתנגדות לתרופות. באמצעות GCSCs מחולים בסרטן הקיבה יאפשר לנו לחקור את נקודת התורפה שלהם ולפתח את תרופות מיקוד לטיפול של חולי GC.
היווצרות כדור assay היא שיטה שימושית כדי לבחון את פוטנציאל התחדשות עצמית של תאי גזע סרטניים במבחנה. ניתן להציג את התוצאות כאחוז הספירות שנוצרו המחולקות לפי המספר המקורי של תאים בודדים שנזרעו. התאמנו את השיטה המקורית כדי לחשב את הגדלים הממוצעים של כל התאים / ספירות במספר נקודות זמן כדי לשפר את התוצאות של הודעה זו כדי להקל על הרבייה שלה עבור סוגים אחרים של תאי גזע סרטניים. אישרנו כי התוצאה בהסכם זה תלויה מאוד במספר התאים הראשונים שנזרעו. זוהי נקודה קריטית של תוואי זה כדי לשמור על בידוד תאי ראשוני ים לבצע מדידה מדויקת של מספר המושבות כדוריות (לא כולל צבירות סלולריות). בנוסף, חשוב לייעל את זמן הספירה כדי להבחין בבירור בין הספירות לבין צבירות תאיות ותאים בודדים.
מערכות Tet-inducible מועילות ללמוד את הפונקציה של גנים החיוניים להישרדות תאים במבחנה, בדיוק כמו clusterin בפרוטוקול זה. הם שימושיים גם למחקר פונקציונלי של גנים ב vivo; זה יכול להיעשות על ידי הוספת דוקסיציקלין לתוך מי השתייה של בעלי חיים. עם זאת, דליפה במצב לא מושרה היא בעיה שדווחה לעתים קרובות של מערכות Tet-inducible12. בניסוי שהוצג, רמה נמוכה של דליפה נצפתה גם עם shClu2, כפי שמוצג איור 3. במקרה זה, אנו יכולים להשוות בזהירות את השינויים של חלבון היעד ב KD או בקרה מקושקשת שזוהתה בנוכחות והיעדר דוקסיציקלין כדי להעריך את האפקט הזה. נקודה חשובה נוספת היא כמות דוקסיציקלין המיושם בתרבות. כמו כמות Dox עשוי להשתנות בין קווי תא, כל קו תא צריך להיבדק עם מינונים שונים Dox להחליט את הריכוזים היעילים עבור KD ועל רעילות על התאים.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק טכניקה יעילה לפענוח הגנים הקשורים לגזע של CSCs ולחקר הביולוגיה של CSCs. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד את הפונקציות של גנים קריטיים אחרים בתאי גזע סרטניים, כגון גזע והישרדות. בנוסף, הנוק-דאון המותנה של ביטוי גנים בCSCs הם אפשריים ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של גנים היעד לא רק במבחנה אלא גם בvivio. עם זאת, רק CSCs מסוימים לא יכול ליצור מוצק, גידולים טיפוסיים, פרוטוקול זה צריך להיות מותאם באמצעות שיטות אחרות כדי לבחון את פוטנציאל החידוש העצמי של תאי גזע סרטניים במבחנה, למשל, בחינת הביטוי של סמנים הקשורים לגזע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2018A030310586, 2020A1515010989), הקרן למחקר מדעי רפואי של מחוז גואנגדונג (A2019405), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81772957), המדע והתוכנית הטכנולוגית של מחוז גואנגדונג בסין (2017B030301016), והקרן לתעשייה וטכנולוגיה מידע של שנג'ן (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
