Summary
В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.
Abstract
Раковые стволовые клетки (ККС) вовлечены в инициирование опухоли, развитие и рецидив после лечения, и стали центром внимания многих исследований в последние десятилетия. Поэтому важно разработать методы исследования роли ключевых генов, участвующих в стволе раковых клеток. Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных и смертных видов рака. Стволовые клетки рака желудка (GCSCs), как полагают, корень рецидива рака желудка, метастазы и лекарственной устойчивости. Понимание биологии GCSCs необходимо для продвижения разработки целевых методов лечения и, в конечном итоге, для снижения смертности среди пациентов. В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.
Introduction
Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных и смертных видов рака1. Несмотря на достижения в комбинированной хирургии, химиотерапии и лучевой терапии в терапии GC, прогноз остается плохим и пятилетнюю выживаемость по-прежнему очень низка2. Рецидив и метастазы являются основными причинами смерти после лечения.
Раковые стволовые клетки (CSCs) являются подмножеством раковых клеток, которые обладают способностью к самообновлению и генерации различных клеточных линий, которые воссоздаютопухоль 3. CSCs, как полагают, несет ответственность за рецидив рака и метастазы из-за их возможности самооб обновления и посева новых опухолей, а также их устойчивость к традиционной химиотерапии ирадиотерапевтии 4. Таким образом, ориентация на CSCs и устранение CSCs обеспечивают захватывающий потенциал для улучшения лечения и снижения смертности онкологических больных.
CSCs были изолированы от многих типов твердых опухолей5. В 2009 году стволовые клетки рака желудка (GCSCs), изолированные от линий раковых клеток человека, были первоначально описаны Takaishi et al.6. Чэнь и его коллеги впервые определили и очищали GCSCs от аденокарциномы желудка человека (GAC) опухолевых тканей7. Эти выводы не только дают возможность изучать биологию GCSCs, но и обеспечивают большое клиническое значение.
Особенностью ККС является их способность формировать сферу8. Одиночные клетки поцаряются в неадхерентных условиях при низкой плотности, и только клетки, одержимые самообъемом, могут вырасти в твердое сферическое скопление, называемое сферой. Таким образом, анализ формирования сферы был расценен как анализ золотого стандарта и широко используется для оценки потенциала самообжиления стволовых клеток in vitro.
РНК-интерференция (РНК) является мощным инструментом исследования для изучения функции генов путем нокдауна конкретного гена9. Тем не менее, долгосрочные стабильные технологии нокдауна генов имеют определенные ограничения, такие как проблема изучения функции гена, который имеет важное значение для выживания клеток. Условные системы РНК могут быть полезны для downregulation желаемых генов в височной и / или специально контролируемой образом администрации индуцирующего агента. Тетрациклин (Tet)-неуявимые системы являются одной из наиболее широко используемых условных систем РНК10. Системы Tet-inducible могут навести глушитель гена цели путем контролировать выражение shRNA на добавлении exogenous индуктора (преимущественно doxycycline, Dox). Системы Tet-inducible можно разделить на два типа: Tet-On или Tet-Off. Выражение shRNA может быть включено (Tet-On) или выключено (Tet-Off) в присутствии индуктора. В системе Tet-ON без индуктора, constitutively выраженный репрессор Tet (TetR) связывает к последовательности Tet-responsive элемента (TRE) содержа Tet-отзывчивый Pol III-зависимый промоутер для выражения shRNA, таким образом подавляя выражение shRNA. В то время как после добавления Dox, TetR улавливлен от Tet-реакции Pol III-зависимого промоутера. Это облегчает экспрессию шРНК и приводит к гену нокдаун.
Протокол, описанный здесь использует функциональную тетрациклин-индуцированную shRNA систему и адаптированный анализ формирования сферы для изучения функции кластерина в пациент-производных GCSCs. Clusterin был определен как новая ключевая молекула для поддержания стволовости и выживания GCSCs в предыдущемисследовании 11. Мы используем описанный протокол для изучения влияния кластерина в самообувечении GCSCs. Эта методология также применима к другим типам раковых стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с использованием пациентов полученных стволовых клеток рака желудка, описанных в этом был одобрен местным комитетом по этике7.
1. Культура стволовых клеток рака желудка
- Подготовка GCSCs полной среды культуры
- Подготовка GCSCs полной среды культуры, добавив свежие DME / F12 среды со следующими основными ингредиентами: 20 нг / мл EGF, 10 нг / мл bFGF, 1% Инсулин / Трансферрин / натрий селенит, 0,2% глюкозы, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% несущественных аминокислот, 10 МК 2-меркаптоэтанол, 0,75 мг/мл NaHCO3, 10 МК тиоглицерол, 100 МЕ/ МЛ пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. Фильтр и стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: GCSCs полная среда культуры рекомендуется хранить предпочтительно не более двух недель при 4 градусов по Цельсию.
- Подготовка GCSCs полной среды культуры, добавив свежие DME / F12 среды со следующими основными ингредиентами: 20 нг / мл EGF, 10 нг / мл bFGF, 1% Инсулин / Трансферрин / натрий селенит, 0,2% глюкозы, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% несущественных аминокислот, 10 МК 2-меркаптоэтанол, 0,75 мг/мл NaHCO3, 10 МК тиоглицерол, 100 МЕ/ МЛ пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. Фильтр и стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Восстановление ГККС и культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: GCSCs были получены следующим образом: Образцы опухоли были подвергнуты механической и энзиматической диссоциации. Одноклеточные суспензии были получены путем фильтрации с нейлоновой сеткой из хорошо разбросанной подвески. Полученные раковые клетки были выучты в GCSCs Complete Culture Medium, а некоторые клетки выросли до сфер. Затем эти сферы подверглись энзиматической диссоциации, и GCSC можно получить с помощью цитофторометрической сортировки популяции клеток, окрашенных маркерами CD44/CD54. Подробный протокол и функциональные анализы GCSCs были зарегистрированы7.- Предварительно теплые GCSCs завершить культуру среды при 37 градусов по Цельсию, не более 30 мин.
- Разморозить GCSCs от жидкого хранения азота и быстро оттаивать криовиалы в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Держите закрученного флаконы, пока все содержимое тает полностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель замороженных клеток быстро (Lt;1 мин) в 37 градусов по Цельсию водяной бане. - Перенесите все содержимое криовилов в 15 мл центрифуги трубки, содержащей 10 мл GCSCs полной культуры среды. Центрифуга при 800 x g в течение 5 мин на RT.
- Аспирировать супернатант тщательно и приостановить ячейки гранулы в 10 мл свежих GCSCs полной среде. Плита клеточной суспензии в 100 мм чашки Петри. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора и добавить 5 мл свежей полной среде на третий день.
- Субкультура опухолевыхсфер GCSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: GCSCs центра tumorspheres только имеют достаточные питательные вещества перед размером сфер расти до 80-100 мкм в диаметре. После того, как темные и низкие сферы рефракционности появляются (около 6 дней культуры), необходимо субкультуры опухолевыхсфер.- Встряхните блюдо осторожно и передать GCSCs опухолевой культуры среды (средних и непритяжки опухолевыхсфер) в стерильные 15 мл центрифуги трубки. Для больших средних объемов могут потребоваться более крупные центрифуги.
- Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин и тщательно распоряжаться супернатантом. После центрифугации будет видна небелая гранула.
- Добавьте 2 мл раствора диссоциации клеток, чтобы повторно использовать гранулы для механической и энзиматической диссоциации при 37 градусах Цельсия. Аккуратно трубят вверх и вниз 10 раз каждые 2-3 минуты в процедуре пищеварения, чтобы разбить сферы друг от друга, пока опухолевые сферы не будут рассеяны в одноклеточную подвеску. Этот общий процесс диссоциации рекомендуется менее 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните визуальную проверку под микроскопом, чтобы подтвердить, что больших сфер или клеточных агрегатов не остается. - Добавьте 10 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной культуры среды (5x объем клеточного раствора отряда), чтобы прекратить процедуру пищеварения и центрифуги на 800 х г на RT в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и повторно посовела клетки с помощью 1 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной среды культуры. Семя соответствующее количество клеток в новую 100 мм Петри блюдо с 10 мл свежих предварительно разогретых GCSCs полной культуры среды и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
- Refeed tumorspheres культур после 3 дней, добавив 5 мл свежей предварительно разогретой полной среде. Через 6 дней проходные клетки, когда опухолевыесферы вырастают до 80-100 мкм в диаметре.
- Криоконсервация ГККС
ПРИМЕЧАНИЕ: Не криопресервные клетки GCSCs, добавляя средние к опухолевыхсфер напрямую. GCSCs tumorspheres должны быть переварены в одиночные клетки, так что клеточный защитный агент может войти в каждую клетку, чтобы обеспечить долгосрочное стабильное хранение клеток. Убедитесь, что клетки находятся в здоровой ситуации и без загрязнения.- Урожай GCSCs опухолевыхсфер. Центрифуга по 600 х г в течение 5 мин.
- Отбросьте супернатант и добавьте 2 мл раствора диссоциации клеток, чтобы разъедать опухолевые области GCSCs при 37 градусах Цельсия. Прекратите процедуру пищеварения, добавив 10 мл GCSCs полной среды культуры.
- Центрифуга на 800 х г в течение 5 минут и собирать одиночные GCSCs.
- Аккуратно приостанавливайте GCSCs с криоконсервативной средой без сыворотки. Рекомендуемая окончательная концентрация составляет 5 х 105 - 5 х 106 клеток/мл.
- Выпределите подвесную клетку в 1 мл aliquots в отмеченные криогенные флаконы.
- Немедленно поместите криовиалы, содержащие клетки, в изопропаноловую камеру и храните их при -80 градусов по Цельсию. Перенесите флаконы в жидкий азот на следующий день для длительного хранения.
2. Поколение неудобоваемых нокдаун GCSCs линий
ВНИМАНИЕ: Рекомбинантные лентивирусы были назначены в качестве организмов уровня 2 Национальным институтом здравоохранения и Центром по контролю заболеваний. Работа с лентивирусом требует обслуживания объекта уровня биобезопасности 2, учитывая, что вирусные супернатанты, производимые этими лентивирусными системами, могут содержать потенциально опасный рекомбинантный вирус.
- Поколение частиц лентивируса
- Синтезировать 2 лентивирусных вектора, несущих неизгладимую шРНК, нацеленную на человеческий кластерин, и нецелевый контрольный лентивирусный вектор (GV307) от GeneChem на основе конструкции таблицы 1 (вектор GV307 содержит: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Семя 4 х 106 293T ленти-вирусных упаковочных клеток в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DMEM дополняется 10% плода бычьей сыворотки.
- Инкубировать 293T клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Убедитесь, что плотность клеток 293T составляет около 50-80% стечения в день трансфекции.
- Довнесите пониженную среду сыворотки до комнатной температуры и приготовьте трубку А и трубку B, как описано в таблице 2.
- Перенесите трубку А в трубку B, хорошо перемешайте и инкубировать комплексы в течение 20 минут при комнатной температуре для подготовки липидо-ДНК комплексов.
- Удалите 5 мл среды, прежде чем добавлять липидо-ДНК комплекс, оставляя в общей сложности 5 мл.
- Добавить 5 мл липидо-ДНК комплекса в культуру блюдо dropwise и осторожно вихрем блюдо распространять комплекс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно обойтись жидкостью против стенки блюда, чтобы избежать тревожных 293T клеток. - Инкубационое блюдо культуры для 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
- Через 24 часа после трансфекции аккуратно удалите трансфекцию среды и аккуратно замените 10 мл предварительно разогретого DMEM, дополненного 10% FBS. Инкубационный в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все supernatant и советы должны рассматриваться с 10% отбеливатель до удаления. - Примерно через 48 часов после трансфекции, урожай 10 мл лентивируссодержащих супернатантов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все сосуды и кончики клеточной культуры должны быть обработаны 10% отбеливателем до удаления. - Фильтр лентивирусный супернатант с помощью фильтра поры 0,45 мкм для удаления клеточного мусора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все фильтры и шприцы должны быть обработаны 10% отбеливателя до удаления. - Перенесите уточненный супернатант в стерильный контейнер, добавьте концентратор Lenti-X (1/3 тома очищенного супернатанта) для смешивания нежной инверсией.
- Инкубировать смесь при 4 градусах по Цельсию на ночь.
- Образцы центрифуги при 1500 х г в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия. После центрифугации, и небелые гранулы будут видны. Аккуратно удалите супернатант, заботясь о том, чтобы не беспокоить гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все supernatant и советы должны рассматриваться с 10% отбеливатель до удаления. - Аккуратно перерасходовать гранулы в 1 мл DMEM дополняется 10% FBS в качестве вирусного запаса, хранить при -80 градусов по Цельсию.
- Поколение стабильных трансфицированных клеточных линий
- Семя 6 х 106 GCSCs в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DMEM дополнен 10% FBS для 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 (70-80% слияния до инфекции).
- Аспирировать среду в блюде, добавить концентрированные лентивирусные частицы, разбавленные 4 мл полной среды DMEM, содержащей полибренский реагент (5 мкг/мл) в блюдо. Инкубационный на 18 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация полибрена зависит от типа клеток и, возможно, потребуется проверить в различных концентрациях, чтобы решить эффективные концентрации. В противном случае, это может быть эмпирически определено, как правило, в диапазоне 2-10 мкг/мл. Все трубки и кончики должны быть обработаны 10% отбеливателя до удаления. - Изменение среды, заменить 10 мл DMEM с 10% FBS среднего и инкубировать на 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все средние и советы должны быть обработаны 10% отбеливатель до удаления. - Аспирировать супернатант с клеточным мусором, заменить свежим DMEM дополнен 10% FBS среды, содержащей пуромицин (2,5 мкг/мл) и инкубировать в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Затем замените свежий DMEM, дополненный 10% FBS среды, содержащей пуромицин (5 мкг/мл) и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 для дополнительных 24 ч.
- Промыть адепт GCSCs дважды с 5 мл DPBS без кальция и магния.
- Разобщить GCSCs с 1 мл предварительно разогретого раствора диссоциации клеток и инкубировать 2-3 мин при 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте 5 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной культуры среды к подвеске клетки.
- Раздай 3 мл в центробеченную трубку 15 мл (трубку А) для криоконсервирования клеток, а остальные 3 мл в центробежную трубку 15 мл (трубку В) для индуцирования доксициклином.
- Центрифугная трубка А и трубка В по 800 х г в течение 5 мин.
- Повторно посовещая гранулы трубки А с 1 мл криоконсервативной среды без сыворотки, перенесите флакон на -80 градусов по Цельсию на ночь и удалите его в жидкое хранилище азота.
- Аспирировать супернатант и повторно израсходовать клетки трубки B в 1 мл свежей предварительно разогретой GCSCs полной среды культуры. Семя соответствующее количество клеток в новый 100 мм Петри блюдо 10 мл свежих предварительно разогретых GCSCs полной культуры среды с доксициклиного (Dox) (2,5 мкг / мл) и инкубации для 48 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация Dox может варьироваться между линиями клеток. Каждая линия клеток должна быть протестирована в различных концентрациях Докса, чтобы определить эффективные концентрации для KD и токсичности на клетках. - Подтвердите стабильные репрессии clusterin в GCSCs западным blotting.
3. Анализ формирования сферы
- Оттепель замороженных неудобовательно нокдаун GCSCs линий (см. шаг 1.2).
- Определите жизнеспособную плотность клеток образца 10 йл с помощью автоматизированного счетчика клеток.
- Отрегулируйте громкость с предварительно разогретой GCSCs полной среды культуры, чтобы получить концентрацию 2 х10 4 жизнеспособных клеток / мл.
- Обойтись в 3 новых 96-ну ультра-низкой крепления культуры пластины скважин (0,1 мл / хорошо) каждой группы.
- Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. Формирование сферы должно происходить в течение 3-10 дней. Мониторинг и запись визуализации образования опухолевыхсфер каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда не рекомендуется менять в случае какого-либо нарушения образования опухолевыхсфер. Эти опухолевыесферы следует легко отличить от одиночных и агрегированных клеток. - Определите результаты формирования опухолевой системы, оценив размеры сформированных опухолевыхсфер с помощью программного обеспечения для визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стволовые клетки рака желудка из первичной аденокарциномы желудка человека были выучинены в среде культуры, свободной от сыворотки. Через 6 дней клетки расширились от одноклеточного фенотипа(рисунок 1А)до больших сфер(рисунок 1В).
Для оценки функции кластерина в ГКСК последовательности шРНК против кластерина и скремблирования были клонированы в вектор Tet-GV307-RFP-Puro в соответствии с описанным выше протоколом. GCSCs stably transfected с тетрациклином-регулируемым вектором выражения shRNA-clusterin были генерированы и после этого обработаны с доксициклином для 48 h (Рисунок 2) (и shRNA scrambled как управление). Уровень экспрессии кластерина был проверен западной помаркой и впоследствии количественно определен денситометрией(рисунок 3).
Анализ формирования сферы был использован для проверки потенциала самообувечления ГКСК. Мы предположили, что кластерин способствует потенциалу самооб обновления GCSCs, и поэтому меньше сфер следует наблюдать, когда кластерин вниз регулируется добавлением доксициклина. Мы показали, что наличие доксициклина и нокдауна кластерина в ГККС ингибирует образование опухолевой сферы(рисунок 4). Размеры ячеек/сфер GCSC не увеличиваются, когда кластерин уменьшается в GCSCs(рисунок 5). Никакого торможения образования опухолевойсферы не наблюдалось с ГКСК, трансфуцированными с помощью скремблированных шРНК-контроля, что указывает на то, что доксициклин не имеет ингибирующего влияния на образование опухолевойсферы (рисунок 5). Эти результаты показали, что после замалчивания кластерина, GCSCs растут медленно и не могут образовывать опухолевыесферы. Основываясь на данных in vitro, кластерин играет решающую роль в содействии самообувечению деятельности GCSCs, указывая, что кластерин может быть перспективной целью наркотиков в подавлении CSCs у пациентов GC.
Рисунок 1: Клеточные культуры стволовых клеток рака желудка. Одноклеточные культуры стволовых клеток рака желудка были культурны в течение 6 дней. Фазо-контрастные микроскопические изображения этих клеток/сфер были сделаны в день 0(A)и день 6(B). Исходное увеличение: 10x. Размер бара: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Условный KD экспрессии кластерина в стволовых клетках рака желудка. Линии GCSC были созданы путем заражения лентивирусным неодобоваемым шРНК-контролем (shCtrl) или неудобоваемой шРНК, нацеленной на кластерин (shClu1, shClu2). Эти клеточные линии были обработаны с (Dox) или без Dox (2,5 мкг/мл) (Dox-) в течение 48 ч, как отмечалось. Фазовое контрастное наблюдение этих клеток было показано в верхней панели. Иммунофлуоресцентные наблюдения (красные) этих клеток были показаны в нижней панели. Исходное увеличение: 10x. Размер бара: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Выражение кластерина в неизгладимый нокдаун GCSCs линий с или без лечения Dox. Западный анализ экспрессии кластерина в клеточных линиях, стабилизированных тетрациклином-регулируемым шРНК-кластерином (shClu1, shClu2) и вектором экспрессии (shCtrl) после 2 дней доксициклиного лечения. Относительный уровень экспрессии кластерина был количественно определен по денситометрии и нормализовался β анти-актина, а затем был указан ниже полос западных пятен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Фазо-контрастные микроскопические изображения неудобоваемых нокдауна клеток/сфер GCSCs. Одноклеточные неодобненные нокдаунные линии GCSC инкубировались и обработались без Dox (верхняя панель) или с Dox (нижняя панель) в течение 6 дней. Фазо-контрастные микроскопические изображения этих клеток/сфер были сделаны на 6-й день, как указано. Исходное увеличение: 10x. Шкала бар, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Неодобоваемый нокдаун Кластерина препятствует способности GCSC к самообувещению. Анализы формирования сферы проводились в неудобоваемых нокдаунных линиях GCSC. В указанный день были сделаны фазо-контрастные микроскопические изображения этих клеток/сфер, измерены размеры клеток/сфер GCSCs. n'gt;30, ± стандартная погрешность среднего (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя Джина | Видов | Идентификатор гена | Последовательность таргетинга |
| CLU-1 | Человека | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | Человека | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Таблица 1: Две последовательности таргетинга shRNA против кластерина.
| Компонент | Объем |
| Труба А | |
| Снижение среднего уровня сыворотки | 1,5 мл |
| Трансфектонный реагент | 41 МКЛ |
| Труба B | |
| Снижение среднего уровня сыворотки | 1,5 мл |
| Реагент P3000 Enhancer | 35 мкл |
| pHelper 1.0 (компонент gag/pol) | 9 мкг |
| pHelper 2.0 (компонент VSVG) | 6 мкг |
| shCLU 1/2 или контроль плазмид | 12 мкг |
Таблица 2: Масштаб вирусного производства с использованием трансфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ГК является третьей по величине причиной смерти, связанной с раком, во всем мире. GCSCs имеют решающее значение в рецидив рака желудка, метастазы и лекарственной устойчивости. Использование GCSCs от больных раком желудка позволит нам исследовать их слабое место и разработать целевые препараты для лечения пациентов GC.
Анализ формирования сферы является полезным методом для изучения потенциала самообжиления раковых стволовых клеток in vitro. Результаты могут быть представлены как процент образованных сфер, разделенных на исходное количество одиночных клеток, посеянных. Мы адаптировали оригинальный метод для расчета средних размеров всех клеток/сфер в несколько точек времени, чтобы улучшить результаты этого анализа и облегчить его воспроизводимость для других типов раковых стволовых клеток. Мы подтвердили, что результат этого анализа сильно зависит от количества первоначальных сеяных клеток. Это критический момент этого анализа для поддержания первоначальной изоляции клеток и точного измерения количества сферических колоний (за исключением клеточных агрегаций). Кроме того, важно оптимизировать время подсчета, чтобы четко отличить сферы от клеточных агрегаций и одиночных клеток.
Системы Tet-inducible полезны для изучения функции генов, которые имеют решающее значение для выживания клеток в пробирке, так же, как кластерин в этом протоколе. Они также полезны для функционального исследования генов in vivo; это может быть сделано путем добавления доксициклина в питьевую воду животных. Тем не менее, утечка в неиндуцированных состоянии часто сообщается проблема Tet-неопродожимых систем12. В представленном эксперименте, низкий уровень протекаемости также наблюдается с shClu2, как показано на рисунке 3. В этом случае мы можем тщательно сравнить изменения целевого белка в КД или скремблированный контроль, обнаруженный при наличии и отсутствии доксициклина для оценки этого эффекта. Другим важным моментом является количество доксициклина, применяемого в культуре. Поскольку количество Dox может варьироваться между клеточными линиями, каждая линия клеток должна быть проверена с различными дозировками Dox, чтобы решить эффективные концентрации для KD и токсичности на клетках.
Представленный здесь протокол обеспечивает эффективный метод расшифровки генов, связанных со стволовой основой ЦСХ, и изучения биологии ККС. Протокол может быть легко адаптирован для изучения функций других критических генов в раковых стволовых клетках, таких как стебель и выживание. Кроме того, условный нокдаун экспрессии генов в ККС возможен для изучения биологических функций генов-мишеней не только в пробирке, но и in vivo. Однако, как раз некоторые CSCs не могут сформировать твердые, типичные tumorspheres, этот протокол должен быть приспособлен путем использование других методов для того чтобы рассмотреть потенциал самообувечения стволовой клетки рака in vitro, например, рассматривая выражение stemness-родственных маркеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликтов интересов не объявлено.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом науки о природе провинции Гуандун (2018A030310586, 2020A1515010989), Фонд медицинских научных исследований провинции Гуандун (A2019405), Национальный фонд естественных наук Китая (81772957), Наука и наука Технологическая программа провинции Гуандун в Китае (2017B030301016) и Фонд промышленности и информационных технологий Шэньчжэня (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
