Summary
We beschrijven de isolatie, dispersie en beplating van tandheelkundige pulp (DP) primaire cellen met trigeminale (TG) neuronen gekweekt bovenop bovenliggende transwell filters. Cellulaire reacties van DP-cellen kunnen worden geanalyseerd met immunofluorescentie of RNA/eiwitanalyse. Immunofluorescentie van neuronale markers met confocale microscopie maakt de analyse van neurite outgrowth reacties mogelijk.
Abstract
Tand innervation laat tanden om druk, temperatuur en ontsteking te voelen, die allemaal cruciaal zijn voor het gebruik en onderhoud van het tandorgaan. Zonder zintuiglijke innervatie zouden dagelijkse orale activiteiten onherstelbare schade veroorzaken. Ondanks het belang ervan, zijn de rollen van innervatie in tandontwikkeling en onderhoud grotendeels over het hoofd gezien. Verschillende studies hebben aangetoond dat DP cellen scheiden extracellulaire matrix eiwitten en paracrine signalen aan te trekken en te begeleiden TG axonen in en door de tand. Echter, weinig studies hebben gedetailleerd inzicht in de crosstalk tussen de DP mesenchyme en neuronale afferents. Om deze kloof in kennis aan te pakken, zijn onderzoekers begonnen met het gebruik van co-culturen en een verscheidenheid aan technieken om deze interacties te onderzoeken. Hier demonstreren we de vele stappen die betrokken zijn bij co-culturing primaire DP cellen met TG neuronen verspreid over een bovenliggende transwell filter met grote diameter poriën om axonale groei door de poriën mogelijk te maken. Primaire DP-cellen met het gen van belang geflankeerd door loxP-sites werden gebruikt om genverwijdering te vergemakkelijken met behulp van een Adenovirus-Cre-GFP recombinase systeem. Met behulp van TG neuronen van de Thy1-YFP muis toegestaan voor nauwkeurige afferente beeldvorming, met expressie ruim boven achtergrondniveaus door confocale microscopie. De DP-reacties kunnen worden onderzocht via eiwit- of RNA-verzameling en -analyse, of als alternatief door immunofluorescerende vlekken van DP-cellen die zijn verguld op verwijderbare glashoezen. Media kunnen worden geanalyseerd met behulp van technieken zoals proteomische analyses, hoewel dit zal vereisen albumine uitputting als gevolg van de aanwezigheid van foetale runderserum in de media. Dit protocol biedt een eenvoudige methode die kan worden gemanipuleerd om de morfologische, genetische en cytoskeletreacties van TG-neuronen en DP-cellen te bestuderen in reactie op de gecontroleerde omgeving van een co-cultuurtest.
Introduction
Tand innervation laat tanden om druk, temperatuur en ontsteking te voelen, die allemaal cruciaal zijn voor het gebruik en onderhoud van het tandorgaan. Niet te voelen tandpijn geassocieerd met tandheelkundige cariën en trauma leidt tot ziekte progressie. Zo is een goede innervatie een vereiste voor normale tandgroei, functie en zorg.
Terwijl de meeste organen zijn volledig functioneel en innervated door de tijd van geboorte, tand ontwikkeling strekt zich uit tot volwassen leven, met tand innervation en mineralisatie die zich in overleg tijdens postnatale stadia1,2. Interessant is dat de tandheelkundige pulp (DP) mesenchyme in eerste instantie afwerende signalen scheidt tijdens embryogenese om axon binnenkomst in het zich ontwikkelende tandorgaan te voorkomen, dat later verschuift naar de afscheiding van attractante factoren als de tand nadert uitbarsting3,4. Tijdens postnatale stadia dringen afferente axonen van de trigeminus (TG) zenuw in en door de tand rond de tijd dat dentin depositie begint (beoordeeld in Pagella, P. et al.5). Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat neuronale-mesenchymale interacties leiden tand innervation in muizen (beoordeeld in Luukko, K. et al.6), maar weinig details van de moleculaire mechanismen beschikbaar zijn.
Celcoculturen bieden gecontroleerde omgevingen waarin onderzoekers interacties tussen neuronale en mesenchymale populaties kunnen manipuleren. Co-cultuur experimenten maken het mogelijk om dieper te verdiepen in de signalering trajecten begeleiden tand innervation en ontwikkeling. Echter, een aantal van de conventionele methoden die worden gebruikt om cellen te bestuderen in co-cultuur presenteren technische uitdagingen. Bijvoorbeeld, kristal violet vlekken van neurite uitgroei kan niet-specifiek vlek Schwann cellen opgenomen in TG bundel dispersies, en er kunnen pieken in kleurintensiteit met relatief kleine reacties7. Microfluïde kamers bieden een aantrekkelijke optie, maar zijn aanzienlijk duurder dan transwell filters8,9 en alleen toestaan dat het onderzoek van neuronale reacties op DP afscheidingen. Om deze problemen aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld dat het mogelijk maakt: a) nauwkeurige kleuring en beeldvorming van TG neurite uitgroei in reactie op DP secreties, b) genetische modificatie van DP-cellen en /of TG-neuronen om specifieke signaleringstrajecten te onderzoeken, en c) onderzoek naar DP-celreacties op factoren die door TG-neuronen worden afgescheiden. Dit protocol biedt de mogelijkheid om nauwkeurig te onderzoeken verschillende kenmerken van tandinnervation in de gecontroleerde omgeving van een in vitro co-cultuur test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door het UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Plaatbereiding
OPMERKING: Coverslips kan worden gebruikt om DP-cellen aan het einde van de test in beeld te brengen. Zorg ervoor dat het deksel van de plaat is ingeschakeld tijdens alle incubatie- en spoeltreden buiten de steriele weefselkweekkap om besmetting tijdens de verwerking van monsters te voorkomen.
-
Coverslip voorbereiding
- Autoclave cirkelvormige coverslips.
- Filter ultrazuiver water onder de motorkap.
- Breng de coverslips over op een 24-putplaat en bedek ze met 400 μL van 0,1 mg/mL poly-D-lysine.
- Laat de coverslips weken, ondergedompeld voor 5 min, op een rocker bij 12 rpm of orbitale shaker bij 40-50 rpm. Zorg ervoor dat het deksel is ingeschakeld om besmetting te voorkomen.
- Spoel de coverslips af met gefilterd ultrazuiver water gedurende ongeveer 5 min op een tuimelschakelaar bij 12 tpm of shaker bij 50 tpm. Herhaal.
- Laat de afdekkingen minstens 2 uur onder de kap drogen met het deksel eraf om verdamping te vergemakkelijken. Deze coverslips moeten binnen 48 uur worden gebruikt.
- Zaad DP-cellen bovenop de dekking van lippen en processen aan het einde van de test voor immunofluorescentie (punt 3.3).
-
Coatingfilters
- Verdun laminin tot 10 μg/mL. Filtreer de verdunde lamine onder de kap.
- Pipetteer 450-500 μL van 10 μg/mL lamininine in elke put van een 24-put plaat.
- Plaats transwellfilter, 3 μm porositeit, in een put, zodat het contact opneemt met de laminineoplossing en laat het in een 37 °C incubator voor 2 uur of 's nachts. Filterporiën moeten een deel van de oplossing zowel de boven- als onderkant van het filter kunnen verspreiden en coaten. Deze filters moeten binnen 48 uur worden gebruikt of maximaal 1 week bij 4 °C worden gekoeld.
2. Celbeplating met optionele genetische manipulatie
- Muizen: Genetische verandering van DP-cellen kan worden uitgevoerd (maar is niet vereist) om mesenchymale-neuronale interacties te bestuderen. Zie de punten 2.3 en 2.4 voor voorgestelde genetische variaties.
- DP dissectie, dispersie en beplating (figuur 1)
OPMERKING: Gebruik voor DP-dissectie ultrafijne, rechte tangen. De ultrafijne randen stellen de gebruiker in staat om de krachtrand tussen de gemineraliseerde structuur en DP-weefsel in te wigen.- Oogst P5-P8 muizen. In dit stadium moeten de tanden mineraliseren en is de wortel open.
- Verdoven de neonaten via onderkoeling door ze in een schaal in de 4 °C koelkast te plaatsen totdat ze niet meer bewegen of reageren op aanraking. Neonaten euthanaseren door onthoofding en volgens de IACUC-procedures in de aangewezen faciliteit.
- Bereid een 3-5 mL aliquot van 0,25% trypsin-EDTA in een 50 mL conische buis om de DP te verzamelen van elke muis. Dit zal de vertering van tandheelkundige pulp van postnatale muizen vergemakkelijken. Gebruik meer dan 3 mL bij het verteren van weefsel van meer dan 10 postnatale muizen.
- Plaats het hoofd op een wegwerp onderpad, zodat de mond is in de richting van het plafond en de basis van de nek is plat op het werkoppervlak. Gebruik een scheermesje in een zaagbeweging om de onderkaak van de maxilla te scheiden.
- Verwijder de tong optioneel met een schaar of met tangen om gemakkelijker toegang tot de kiezen mogelijk te maken.
- Plaats de geopende kop in een schaal bovenop een steriel gaaspad en plaats het monster onder een ontledende microscoop(figuur 1D).
- Verwijder het alveolar botweefsel rond de eerste kiezen. Submanibulaire tanden zijn niet volledig uitgebarsten op dit punt. Steek tangen in alveolar opening en plagen het weefsel uit de buurt van de tand in de richting van de buccale (wang) of lingual (tong) kant van de mond. Maxillaire tanden vereisen volledige verwijdering van de gespleten rond de tand voor blootstelling en verwijdering.
- Breng voorzichtig de submanbulaire en maxillaire eerste kiezen (M1's) over naar een aparte celkweekschaal met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Herhaal 2.2.4-2.2.8 totdat alle M1's zijn verzameld. Houd de schotel met de M1's op ijs tijdens de oogst.
- Verwijder het Email-buitenorgaan (EOE) rond de buitenkant van elke M1. Dit kan ook na stap 2.2.11.
- Met een set van tangen, draai de M1, zodat de cusps naar beneden zijn en de open wortel wordt blootgesteld. Er zal een ovale opening op de bodem van de tand, en ondoorzichtig DP weefsel ingekapseld door een dunne laag van dentine en glazuur.
- Met behulp van de punt van de tangen, voorzichtig los de DP door het uitvoeren van een arm van de tangen rond de interne omtrek van het gemineraliseerde weefsel. Verwijder DP weefsel uit de gemineraliseerde structuur en breng het naar een derde schotel met 1x PBS. Verwijder de EOE als deze nog niet is gescheiden(figuur 1E).
- Breng al het DP-weefsel over naar 0,25% trypsin-EDTA in een conische buis van 50 mL. Draai het mengsel en plaats in een 37 °C warm waterbad gedurende 10 min. Dit kan worden gedaan met dezelfde tangen of met lange, flacons. Het weefsel zal moeilijk te verspreiden en zal vortexing elke 3-4 min vereisen. Niet meer dan 10 min trypsinisatie, omdat de trypsine celmembranen kan beschadigen.
- Voeg onder een steriele kap verwarmde co-cultuurmedia (tabel 1) toe aan een eindverhouding van ten minste 1:1 media om trypsine toe te voegen om het enzym te activeren. Grotere verhoudingen zijn aanvaardbaar als meer weefseldispersie gewenst is.
- Pipetteer de media op en neer meerdere keren met een 10 mL pipet om de DP verder te verspreiden in de media. Wees voorzichtig om grote bellen te vermijden. Volledige verspreiding is bijna onmogelijk vanwege de kleverige aard van het weefsel. Het is echter ook niet nodig omdat cellen naar buiten migreren van het weefsel eenmaal verguld.
- Breng 1 mL van de verspreide DP naar elke put van een 24-put weefsel kweekplaat (Figuur 1F).
- Plaats de plaat in een couveuse op 37 °C en laat cellen 48 uur hechten en migreren uit het onverspreide weefsel voordat u van media verandert. Primaire cellen moeten worden verguld bij relatief hoge concentraties om 85-90% samenvloeiing te bereiken binnen 1 week. Als dit na 1 week niet wordt bereikt, gooi de plaat dan weg.
- Optionele genetische manipulatie van DP-cellen
- Om celsignaleringstrajecten te veranderen, oogst dp cellen van genetische knock-out muizen of van muizen waarin een gen van belang wordt geflankeerd door loxP-sites. In het laatste geval kan het gen worden verwijderd met behulp van Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) recombinase om het geflankeerde gen te verwijderen, zoals hieronder beschreven. Gebruik Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) als een controlevirus om ervoor te zorgen dat de virale infectie geen cellulaire reactie veroorzaakt.
OPMERKING: Ad-eGFP wordt gecontroleerd door de CMV promotor versterker, die zeer sterk is. Ad-Cre-GFP wordt gereguleerd door een IRES, een interne regelgevingsregio tussen de Cre en GFP, die niet erg sterk is. Dit resulteert in helderderfluorescentie in Ad-eGFP-cellen dan Ad-Cre-GFP-cellen. Bevestig gelijkwaardige infectieniveaus op basis van het totale aantal cellen dat fluorescerend is, niet op basis van de niveaus van cellulaire fluorescentie. - Bereid 500 μL aan media die virus bevatten en 10 μg/mL polybreen per put. Polybreen helpt bij virale infectie in cellen in de buurt van samenvloeiing10. Dit protocol is gebaseerd op een veelheid van infectie (MOI) van 100 voor Ad-eGFP en 200 Ad-Cre-GFP voor efficiënte geninfectie met weinig of geen effect op de levensvatbaarheid van de cel. Het geschatte celgetal is 4 x 104 cellen/put van een 24-put plaat:
- Meng media met korte vortexing of pipetteren en voeg 500 μL toe aan elke put.
- Voeg na 24 uur nog eens 500 μL co-cultuurmedia toe die geen extra polybreen of virus bevatten.
- Na een totaal van 48 uur, aanzuigen virus-bevattende media en vervangen door verse co-cultuur media. Op dit punt kunnen TG-neuronen worden toegevoegd bovenop transwellfilters.
- Om celsignaleringstrajecten te veranderen, oogst dp cellen van genetische knock-out muizen of van muizen waarin een gen van belang wordt geflankeerd door loxP-sites. In het laatste geval kan het gen worden verwijderd met behulp van Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) recombinase om het geflankeerde gen te verwijderen, zoals hieronder beschreven. Gebruik Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) als een controlevirus om ervoor te zorgen dat de virale infectie geen cellulaire reactie veroorzaakt.
- Trigeminus neuron dissectie, dispersie en beplating
OPMERKING: In dit protocol werd de beeldvorming van neurite uitgroei in co-cultuur met DP-cellen geoptimaliseerd met behulp van adolescente (6 weken oude) B6.Cg-Tg.Thy1-YFP)16Jrs/J muizen. Centrale en perifere zenuwstelsels van Thy1-YFP muizen hebben een gele fluorescerende eiwit (YFP) tag waarvan de expressie begint rond P6-P10 in neuronen en neemt exponentieel in het hele zenuwstelsel tijdens postnatale en volwassen leven11,12. YFP en GFP hebben geconserveerde sequenties die het mogelijk maken deze zenuwen te worden gekleurd met anti-GFP antilichamen, wat resulteert in een pan-neuronale vlek. Uiteindelijk zorgen deze muizen voor een betere visualisatie en kwantificering van de neuronen die worden gebruikt en geteeld in de celcultuur.- Euthanaseren adolescente muizen met kooldioxide gevolgd door cervicale dislocatie.
- Onthoofd de muizen en verwijder de huid uit de schedel. Zorg ervoor dat u vergelijkbare aantallen mannen en vrouwen op neemt.
- Steek de punt van een micro-ontledende schaar in de basis van de schedel. Snijd langs de sagittale hechting van de schedel (figuur 1A).
- Maak vier kleine horizontale sneden: twee langs de coronale hechtingen door de oren, en twee langs de lambdoïde hechtingen aan de basis van de schedel. Dit moet leiden tot twee flappen van het bot.
- Gebruik de tangen om de twee flappen van het bot terug te pellen. Dit moet de hersenen onthullen.
- Verwijder de hersenen. Breng het hoofd naar een weefselkweekschotel met 1x PBS en onder de microscoop.
- Zoek de TG ganglia, die gemakkelijk zichtbaar is bij knaagdieren13, gehuisvest in de dura materie tussen de hersenen en het bot van het maxillaire proces(figuur 1B).
- Snijd de drie takken die reizen naar de ogen, maxillae en onderkaak en breng de ganglia naar koude 1x PBS met behulp van rechte rand fijne tangen. Houd het gerecht met de TG ganglia op ijs tijdens het oogsten.
- Zodra alle TG-bundels zijn geoogst, breng ganglia naar een 50 mL conische buis met 5 mg/mL steriele gefilterde collageen type II met behulp van flacon tangen.
- Draai de collageen met de TG-bundel en plaats de buis 25-30 min in een waterbad van 37 °C. Gedurende deze tijd, neem de kegelbuis uit het waterbad, vortex, en keer terug naar het bad om de 5-10 min.
- Centrifugeer de collageen-TG neuron oplossing voor 2 min bij 643 x g.
- Onder een weefselkweekkap, trek zachtjes de collageen aan met een micropipette.
- Voeg 5 mL van 1% steriele gefilterde trypsine type II en vortex toe. Plaats de conische buis in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min.
- Centrifugeer de trypsin-TG mix voor 5 min bij 643 x g. Verwijder het bovenste gedeelte van trypsine met een micropipette, zodat de TG neuronen niet worden verwijderd. Er zal nog steeds vloeistof in de buis zitten.
- Voeg voldoende media toe om de resterende trypsine te deactiveren (bij een 1:1 of lagere verhouding van trypsine naar media).
- Tel het aantal cellen en verdun de oplossing tot 200.000 cellen/mL (250 μL celhoudende 50.000 cellen).
- Plaats gecoate transwell filters uit sectie 1.2 in putten met DP.
- Verdun de celhoudende oplossing zodat er 200.000 cellen/mL zijn. Pipetteer 250 μL op het transwellfilter en kweek de cellen 's nachts op 37 °C (figuur 1F).
- Vervang de media de volgende dag door 1 mL cokweekmedia door 1 μM uridine en 15 μM 5'-fluor-2'deoxyuridine om de overproliferatie van mesenchymale cellen te stoppen die neurite uitgroei kunnen voorkomen. Optioneel: Voeg groeifactoren of remmers toe in deze media als u verder probeert te manipuleren.
- Cultuur de cellen voor extra gewenste tijdspunten. Dit protocol werd geoptimaliseerd voor 5 totale dagen van cultuur met de media veranderd alleen op dag 2 om mitotische remmers toe te voegen. Langere perioden vereisen extra mediawijzigingen.
3. Monsterverzameling en -verwerking
- Trigeminuskleuring
- Pipette 1 mL aliquots van steriele 1x PBS in een 24-put plaat onder een weefsel kweek kap voor elke transwell filter te verwerken.
- Verwijder de vloeistof bovenop het filter worden verwijderd met een 200-1.000 μL pipet, waarbij voorzichtig is om cellagen intact te laten. Aangesloten cellen moeten blijven bevestigd en ongebonden cellen zullen los komen tijdens deze zachte pipetters. Een vacuümfilter kan de cellaag beschadigen en wordt niet aanbevolen voor aspiratie.
- Breng het filter naar de 1x PBS-plaat, waarbij u zeker weet dat u de bovenste laag van de media verwijdert, zoals vermeld in de vorige stap.
- Plaats de plaat met alle transwell filters en deksels op een tuimelschakelaar bij 12 rpm of 40-50 rpm op een orbitale shaker voor 10 min.
- Aanzuigen van de PBS, met inbegrip van de bovenste laag zoals hierboven beschreven, voeg 500 μL van 1xPBS en plaats op de rocker of orbitale shaker voor een extra 5-10 min spoelen.
- Zuig de 1x PBS nogmaals aan en vervang door 4% paraformaldehyde (PFA). Gebruik ten minste 500 μL, zodat het gehele filteroppervlak onder water komt te staan. Plaats de plaat op een tuimelschakelaar bij 12 tpm of orbitale shaker bij 40-50 tpm bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verwijder de PFA en spoel de platen twee keer gedurende 5-10 min elk op een tuimelschakelaar met 500 μL van 1x PBS.
- Blok met 10% runderserumalbumine (BSA) + 5% geiten/ezelserum, afhankelijk van het secundaire antilichaamgastdier, in 0,05% Tween-1xPBS (PBST). Gebruik 450-500 μL oplossing, zodat het filter wordt ondergedompeld in de vloeistof.
OPMERKING: In dit stadium kunnen deze platen enkele maanden bij 4 °C worden bewaard om op een later tijdstip te verwerken. Gebruik parafilm om de plaat te verzegelen om ervoor te zorgen dat verdamping niet optreedt en controleer regelmatig op verdamping, zodat die filteroppervlakken onder water blijven. - Verwijder het blok en voeg 450-500 μL primaire antilichaam in 1% BSA-PBST zonder een extra spoeling. Incubeer bij 4 °C 's nachts, zachtjes schommelen.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en spoel met 500 μL 1xPBST op een tuimelschakelaar, 3 keer, bij kamertemperatuur
- Verwijder de PBST, voeg secundaire antilichaam en uitbroed op een rocker 's nachts op 4 °C verpakt in aluminiumfolie om fluorophores te beschermen tegen lichte afbraak. Spoel opnieuw, 3 keer, met 1x PBST op een rocker op kamertemperatuur. Vervangen door 1x PBS.
LET OP: Op dit punt kan de plaat enkele maanden bij 4 °C worden bewaard indien deze in aluminiumfolie is verpakt om fluorophoreafbraak te voorkomen. Gebruik parafilm om de plaat te verzegelen om ervoor te zorgen dat verdamping niet optreedt en controleer regelmatig op verdamping, zodat die filteroppervlakken onder water blijven. Het is het beste om beeld binnen een maand. - Voor optimale beeldvorming, gebruik Thy1-YFP muisneuronen met een anti-GFP antilichaam om specifiek vlekken op de neuronale afferents ruim boven achtergrondniveaus. Gebruik Anti-Neurofilament 200 om axonale structuren nauwkeurig te bevlekken als Thy1-YFP muizen niet beschikbaar zijn.
- Afbeelding zoals gewenst. Filters hoeven niet te worden verguld en kunnen in plaats daarvan bovenop een coverslip of dia worden geplaatst voor beeldvorming met een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Gebieden van het filter bevatten geen afferente structuren. Maak verschillende foto's met een z-stack diepte die alle afferente structuren vangt. Gebruik stiksoftware om de ontgroei van de neurite over grote gebieden te visualiseren, of (bij voorkeur) hele filtergebieden.
- RNA, eiwit en mediacollectie
- Terwijl de transwell filters worden verwerkt, verzamel de media in RNAse / DNAse-vrije buizen en bevriezen voor latere testen (ELISA, proteomics, enz.).
- Direct na het verzamelen van de media buffer of Radio Immuno Precipitation Assay (RIPA) buffer met proteinase en fosphatase remmers in de putten. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 100 μL/put in een 24-put plaat.
- Laat buffers om cellen te lyseren voor 5 min, schraap dan elk filter met een nieuwe pipet tip, en verzamel de cel monsters in RNAse / DNAse-vrije buizen. Bevries de lysis voor toekomstige tests (semi-kwantitatieve en/of kwantitatieve PCR, Westerse vlek, enz.).
- Optionele immunofluorescentie van tandheelkundige pulpcellen:
- Voorzichtig hef coverslippen uit sectie 1.1 met tangen en breng ze naar verschillende putten met 4% PFA voor 1 uur met schommelen.
- Aanzuigen PFA en spoel de coverslips twee maal af met 1x PBS. Volg dit met permeabilisatie, blokkering en immunofluorescentie voor markers van belang met standaard immunofluorescentietechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze resultaten tonen aan dat tg neurite uitgroei werd verhoogd in de aanwezigheid van primaire DP cellen in de onderliggende goed in vergelijking met de controle van TG neurite monocultuur (Figuur 2A,C). Er is een aantal test-to-test variabiliteit in neurite uitgroei. Zo moet een TG neuron monocultuur worden opgenomen in alle tests als een controle om de basale niveaus van neurite uitgroei te detecteren. Primaire cellen van de Tgfbr2f/f muis werden in dit protocol gebruikt nadat infectie van Ad-Cre-GFP en Ad-eGFP in equivalente aantallen cellen werden bevestigd (figuur 2D). De Ad-eGFP diende als een controle virale vector. De Ad-Cre-GFP heeft het geflankeerde gen Tgfbr2 geschrapt, zoals blijkt uit semi-kwantitatief PCR (figuur 2E). In de culturen met Transforming growth factor beta receptor 2 (Tgfbr2) deletie werd de neurite uitgroei verminderd (Figuur 2A-C).
We maakten gebruik van de Thy1-YFP muis TG neuronen en bevlektze met een anti-GFP antilichaam dat zeer specifieke en heldere beelden van axonale structuren ver boven deze achtergrond geproduceerd, zoals blijkt uit figuur 2. Dit maakte de specifieke kleuring van neuronale markers zonder niet-specifieke kleuring van niet-neuronale cellen door gebruik te maken van eerder gerapporteerde methoden zoals kristal violet7. De grote poriën in de filters kunnen automatisch fluoresceren en/of secundaire antilichamen ophopen en de precisie van axonalimaging verminderen(figuur 3). Terwijl de Thy1-YFP neuronen met immunofluorescentie drastisch verbetert de beeldvorming, verdere achtergrond kan worden verwijderd met auto-thresholding software en vervolgens gekwantificeerd. We raden ook aan immunofluorescentie uit te voeren voor Neurofilament 200 op basis van onze voorlopige bevindingen (niet getoond) en andere8,9 als Thy1-YFP muizen niet beschikbaar zijn.
Figuur 1: Een schema van de muisdissectie om cellen voor co-cultuur te verkrijgen. (A) Een diagram van waar te snijden om de muis schedel te openen en tg zenuwen te lokaliseren, weergegeven in het zwart in de laatste afbeelding. Schaar geven aan waar de schaar tips te snijden langs de stippellijnen in te voegen. (B) Een gecombineerd darkfield en GFP beeld met Thy1-YFP + TG zenuwen omcirkeld in het wit. (C) Ontleed TG ganglia kan dan worden verspreid en gekweekt, zoals blijkt uit F. (D) De onderkaak van een P7 muis, met tangen met de onderkaak aan de linkerkant en alveolar been ruggen met niet-gebarsten tanden aan elke kant van de tong. (E) DP-weefsel (omcirkeld) gewonnen uit de gemineraliseerde structuur (boven) en het geëmailleerde buitenste epitheel (onder) dat is verwijderd om zich te verspreiden en te plaaten in een met weefselkweek behandelde plaat, zoals aangegeven in F. Afbeeldingen worden niet geschaald. DP cellen werden verspreid en uitgegroeid tot samenvloeiing voor het toevoegen van TG neuronen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten uit de cocultuur. (A-C) Thy1-YFP TG neuronen werden gekweekt in transwell filters met 3 μm poriën bovenop primaire Tgfbr2f/f DP cellen. Immunofluorescente kleuring werd uitgevoerd voor de YFP eiwit met behulp van een anti-GFP antilichaam om zeer specifieke vlekken van neuronale structuren over het gehele filter te bieden. De maximale projecties van 100 μm z-stack confocale microscopiebeelden op 10x werden verzameld en gestikt met stiksoftware. TG neuronen aangetoond aanzienlijk meer uitgroei bij co-kweek met DP cellen(A)dan wanneer gekweekt alleen(C). Neurite uitgroei werd niet geïnduceerd toen neuronen werden mede-gekweekt met DP cellen besmet met Ad-Cre-GFP neer te halen Tgfbr2 (B). Schaalbalk = 1.000 μm. Gelijkwaardige aantallen cellen die besmet zijn met Ad-eGFP en Ad-Cre-GFP worden weergegeven in (D). Schaalbalk = 125 μm. Semi-kwantitatieve PCR bevestigde de Tgfbr2 KD (E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Technische problemen die zich in afferente beeldvorming voordoen. (A) Brightfield beeldvorming van transwell filters na kristal violet vlekken van celpopulaties. Grote poriën zijn overwegend. De grote pijl wijst op een cel die mesenchymale morfologie vertoont, terwijl de kleine pijl wijst naar een cel van neuronale morfologie. Kristal violet bevlektbeide cellen zonder vooroordeel. (B) Immunofluorescente kleuring van β3 tubulin met een Alexa-488 secundair antilichaam toonde niet-specifieke kleuring van meerdere cellen, waardoor beeldvorming van afferente structuren moeilijk. Beelden zijn representatief en werden herhaald over meerdere tests om de beeldvorming te optimaliseren die in figuur 2 wordtweergegeven. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Component | Volume | Concentratie | |
| MEM α | 440 mL | ||
| Hitte geïnactiveerd foetaal runderserum | 50 mL | 10% | |
| 100x L-glutamine | 5 mL | 1x | |
| Penicilline-streptomycine 100 x | 5 mL | 1x | |
| Verander media op dag 2 met mitotische remmers bij deze laatste concentraties | |||
| Uridine Uridine | 1 μM | ||
| 5'-Fluor-2'deoxyuridine | 15 μM | ||
Tabel 1: Co-cultuur media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dagelijkse activiteiten van de mondholte vereisen dat tanden externe stimuli en interne ontstekingen voelen om een goed gebruik en onderhoud mogelijk te maken. Er is echter slechts beperkte informatie beschikbaar over de signalen die de ontwikkelingsprocessen van tandinnervation stimuleren. Dit protocol biedt een methode om primaire DP-cellen en TG-neuronen te isoleren en co-cultuur te vormen om de onderlinge communicatie tussen de twee populaties te bestuderen. Verschillende variabelen werden geoptimaliseerd en laten verdere mogelijkheden van onderzoek open, zoals hieronder beschreven.
Controles zijn belangrijk bij elke stap in deze test. Een transwell filter met TG neuronen zonder onderliggende DP cellen moet worden opgenomen in elke test om een basislijn voor TG groei te bieden. Bij het verwijderen van een geflankeerd gen van belang met een Ad-Cre-GFP recombinase, moet een controlevirus dat alleen de fluorescerende marker uitdrukt, worden gebruikt om te bevestigen dat gelijkwaardige aantallen cellen zijn geïnfecteerd. Terwijl we hoge niveaus van infectie met minimale celdood bij respectievelijk 100 en 200 MOI voor Ad-eGFP en Ad-Cre-GFP demonstreerden, moet elk lab deze stap optimaliseren. Omdat fluorescerende eiwitten kunnen worden bevestigd aan verschillende promotors en dus leiden tot differentiële expressie equivalente aantallen geïnfecteerde, fluorescerende cellen moeten worden geteld. De algehele intensiteit van de fluorescentie is niet relevant omdat het niet nauwkeurig de infectiestatus weergeeft. Het is belangrijk om de verwijdering van het gen aan te tonen, zoals blijkt uit semi-kwantitatieve PCR in dit protocol (figuur 2). Hoewel dit protocol dit onderwerp niet aandeorde, toonde eerder onderzoek aan dat controletests met andere cellenlijnen konden worden opgenomen om aan te tonen dat de onbegroeide groei van neurite specifiek wordt veroorzaakt door cocultuur met DP-cellen8.
Omdat dit protocol primaire cellen gebruikt, zijn er meerdere stadia waarin besmetting kan worden geïntroduceerd. Om dit te voorkomen, moeten alle reagentia worden steriel gefilterd. Bovendien wordt aanbevolen dat experimenten voor elke variabele worden uitgevoerd in duplicaat of drievoud om het mogelijk te maken voor de verwijdering van een filter en sterilisatie van een verontreinigde put zonder volledige mislukking van de test.
Coverslips moeten zijn bekleed met poly-D-lysine en/of een extracellulair matrixeiwit om de hechting van de DP-cel te garanderen. Terwijl de cellen in eerste instantie hechten, virale infectie veroorzaakt cel tillen dood op ongecoate coverslips en voorkomt de genetische manipulatie van de co-cultuur test.
Het is algemeen vastgesteld dat niet-neuronale cellen, zoals Schwann cellen uit de TG ganglia, de overleving van neuronale cellen in cultuur14,15,16kunnen beïnvloeden. In dit protocol werd neuronale overleving geoptimaliseerd door toevoeging van 1 μM uridine en 15 μM 5-fluoro-2'deoxyuridine. Zonder de toevoeging van deze antimitotische middelen om schwann celproliferatie te remmen, zal neurite uitgroei niet voorkomen. Het is onbekend of de aanwezigheid van deze senescente Schwann cellen in co-cultuur de neuronale reactie verandert. Het isoleren van murineneuronen vereist verschillende extra stappen en er zijn protocollen beschikbaar voor onderzoekers die deze variabele willen verwijderen17. In beide gevallen bootst neurondispersie een axotomie enigszins na en kan worden beschouwd als letsel/reparatie18 meer dan ontwikkeling. Verdere studies nodig zou zijn om de verschillen tussen in vivo axonal groei van fascicles versus axonale groei van individuele neuronen in vitro te bepalen, en deze zijn niet aangepakt in dit protocol.
Dit protocol duurt 1-3 weken van begin tot eind. Hoewel het mogelijk is om DP-cellen te gebruiken die meer dan 1 week nodig hebben om 85-90% samenvloeiing te bereiken, wordt aanbevolen dat cellen worden gezaaid met een hoog genoeg dichtheid om samenvloeiing binnen een paar dagen te bereiken, omdat deze cellen heel langzaam voorbij dat punt verdelen. Dit vereist over het algemeen ongeveer 5-7 P5-8 muizen per rij van een 24-put plaat. Dit protocol werd geoptimaliseerd voor een totaal van 5 dagen co-cultuur, op welk punt de media met fenol rood begon te verschuiven kleur. De media moeten worden gewijzigd als langere testen gewenst zijn.
Verschillende co-cultuurtesten zijn uitgevoerd om neurite uitgroei aan te tonen in reactie op factoren die door de DP-geafscheideerde factoren met standaard ECM-gecoate weefselkweekplaten3,19,20,21 of microfluïdische kamers8,22,23. Dit protocol biedt verschillende voordelen ten opzichte van deze methoden. Bijvoorbeeld, TG ganglia en DP weefsel co-cultuur vereist een specifieke ruimtelijke relatie voor de neurites te voelen en te reageren op korte afstand paracrine signalen. Met orgaancultuur, alleen de neurites in de ganglia het dichtst bij het DP weefsel zijn in staat om te reageren3, terwijl de verspreide TG neuronen gebruikt in dit protocol worden gekweekt op een gelijke afstand van de DP cellen eronder. Ten tweede kunnen orgaanculturen weefselnecrose introduceren vanwege het gebrek aan zuurstof en voedingsstoffen die beschikbaar zijn in grote monsters24. De co-cultuur van verspreide cellen verwijdert deze mogelijkheid. Sommige co-culturen, waaronder neuronen vereisen neuronale media3,22 die een dominante rol kunnen spelen bij het bevorderen van neurite uitgroei. Dit protocol voegt geen neuron-specifieke groeifactoren toe, waardoor een evaluatie mogelijk wordt gemaakt van de directe relatie tussen paracrinesignalen van de onderliggende DP-cellen en neurite-uitgroeireacties. Het is vermeldenswaard dat de co-cultuur media mist ook componenten ter bevordering van mineralisatie, zoals beta-glycerofosfaat. Dit stelt onderzoekers in staat om te bepalen hoe neurites signalen kunnen afscheiden om mineralisatie aan te moedigen. Het beperkt de studie echter ook door alleen minder gedifferentieerde DP-cellen op te nemen zonder de mineraliserende odontoblasten die doorgaans in vivo aanwezig zouden zijn.
Colorimetrische reacties uit eerder onderzoek7,8 niet aftelijnen Schwann cel bijdragen, noch neuronale morfologie aan te tonen, omdat kristal violet niet-specifiek vlekken alle cellen. Immunofluorescerende kleuring van filters kan leiden tot hoge achtergrondniveaus die afferente beeldvorming moeilijk maken(figuur 2). Het huidige protocol zorgt voor de precieze kleuring van neuronale afferents door gebruik te maken van Thy1-YFP TG neuronen en een anti-GFP antilichaam en biedt een signaal helder genoeg om grote beelden van de groei te genereren in een heel cijfer(Figuur 3). Het is mogelijk om andere neuronale markers te gebruiken, zoals Anti-Neurofilament 200, als Thy1-YFP muizen niet beschikbaar zijn.
Ten slotte maakt het gebruik van primaire DP-cellen van muizen met genen van belang geflankeerd door loxP-sites het mogelijk om deze genen eenvoudig en efficiënt te verwijderen met een Ad-Cre-GFP-systeem. In toekomstige studies kan het Ad-Cre recombinase-systeem worden gebruikt op de TG-neuronen als ze een gen van belang hebben geflankeerd door loxP-sites. Dit zou studies vergemakkelijken over hoe paracrinesignalen van de neuronale populatie DP-cellen beïnvloeden, vooral als de DP-cellen bovenop de afdekkingen worden gezaaid (sectie 1.1). Toekomstige studies kunnen gebruik maken van andere manipulaties, zoals de toevoeging van farmacologische remmers en / of groeifactoren. Het is ook mogelijk om dit protocol te wijzigen om migratiestudies op te nemen met behulp van 8 μm porositeittranswellfilters.
Tot slot, deze transwell co-cultuur test gebruik te maken van neuronen en DP cellen zorgt voor het onderzoek van meerdere cellulaire parameters. Dit maakt het mogelijk om het lichaam van kennis over de mesenchymale-neuronale interacties die bevorderen en ondersteunen tandinnervation te verbreden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door a) de National Institutes of Health /NIAMS (subsidienummers R01 AR062507 en R01 AR053860 aan RS), b) de Universiteit van Alabama in Birmingham Dental Academic Research Training (DART) subsidie (nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) aan SBP van het National Institute of Dental and Craniofacial Research /National Institutes of Health, c) een UAB Global Center for Craniofaciale, orale en tandheelkundige aandoeningen (GC-CODED) Pilot en haalbaarheidssubsidie aan SBP en d) het National Institute of Dental and Craniofacial Onderzoek / National Institutes of Health K99 DE024406 subsidie aan SBP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
