Мы описываем изоляцию, дисперсию и покрытие зубной пульпы (DP) первичных клеток с тройничных (TG) нейронов культивируется на вершине над трансвелл фильтры. Клеточные реакции клеток ДП можно анализировать с помощью иммунофлюоресценции или АНАЛИЗА РНК/белка. Иммунофлуоресценция нейронных маркеров с конфокальной микроскопией позволяет анализировать реакции невритовых наростов.
Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Без сенсорной иннервации ежедневная пероральная деятельность нанесет непоправимый ущерб. Несмотря на свою важность, роль иннервации в развитии и обслуживании зубов в значительной степени упускается из виду. Несколько исследований показали, что DP-клетки выделяют внеклеточные матричные белки и паракриновые сигналы для привлечения и руководства Аксонами TG в и по всему зубу. Тем не менее, несколько исследований предоставили детальное представление о перекрестном разговоре между мезенхимом DP и нейрональными афферентами. Для устранения этого пробела в знаниях исследователи начали использовать сокультуры и различные методы для изучения этих взаимодействий. Здесь мы демонстрируем несколько шагов, участвующих в сокультивации первичных клеток ДП с TG нейронов рассеялись на надивной трансвелл фильтр с большим диаметром поры, чтобы аксональный рост через поры. Первичные клетки DP с геном интереса в окружении локс сайтов были использованы для облегчения удаления генов с помощью аденовирусной-Cre-GFP рекомбиназной системы. Использование TG нейронов из мыши Thy1-YFP позволило точное афферентное изображение, с выражением значительно выше фоновых уровней конфокальной микроскопии. Ответы DP могут быть исследованы с помощью сбора и анализа белков или РНК, или же, через иммунофлуоресцентное окрашивание клеток ДП, покрытых съемными стеклянными крышками. Средства массовой информации могут быть проанализированы с помощью таких методов, как протеомный анализ, хотя это потребует истощения альбумина из-за присутствия сыворотки крупного рогатого скота в средствах массовой информации. Этот протокол предоставляет простой метод, которым можно манипулировать для изучения морфологических, генетических и цитоскелетных реакций TG нейронов и клеток ДП в ответ на контролируемую среду совместного культурного исследования.
Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Неспособность почувствовать боль зубов, связанную с кариесом зубов и травмой, приводит к прогрессированию заболевания. Таким образом, надлежащая иннервация является требованием для нормального роста зубов, функции и ухода.
В то время как большинство органов полностью функциональны и invated к моменту рождения, развитие зубов распространяется на взрослую жизнь, с иннервации зубов и минерализации, происходящих в концерте во время послеродовой стадии1,2. Интересно, что зубная целлюлоза (DP) мезенхим первоначально выделяет репелленты сигналы во время эмбриогенеза, чтобы предотвратить проникновение аксона в развивающийся зубной орган, который позже переходит к секреции привлекательных факторов, как зуб приближается к извержению3,4. Во время послеродовых стадий афферентные аксоны из тройничного (TG) нерва проникают в и по всему зубу во время осаждения дентина начинается (обзор в Pagella, P. et al.5). Несколько исследований in vivo показали, что нейронно-мезенхимальные взаимодействия направляют иннервацию зубов у мышей (рассмотрено в Luukko, K. et al.6),но мало деталей молекулярных механизмов доступны.
Сокультуры клеток обеспечивают контролируемую среду, в которой исследователи могут манипулировать взаимодействиями между нейронными и мезенхимальными популяциями. Эксперименты по совместной культуре позволяют глубже углубиться в сигнальные пути, направляющие иннервацию и развитие зубов. Тем не менее, некоторые из обычных методов, используемых для изучения клеток в совместной культуре представляют технические проблемы. Например, кристально фиолетовое окрашивание невритовых наростов может неспецифически пятно Шванн клетки, включенные в TG рассеивания рассеивания расслоения расслоения, и могут быть пики интенсивности цвета с относительно небольшими ответами7. Микрофлюидные камеры предлагают привлекательный вариант, но значительно дороже, чем трансвелл фильтры8,9 и только позволяют исследования нейрональных реакций на DP выделения. Для решения этих вопросов, мы разработали протокол, который позволяет: а) точное окрашивание и изображение TG неврит рост в ответ на DP выделения, б) генетическая модификация DP клеток и / или TG нейронов для расследования конкретных сигнальных путей, и в) исследование DP клеток ответы на факторы, выделяемые TG нейронов. Этот протокол обеспечивает возможность точно исследовать несколько особенностей иннервации зубов в контролируемой среде анализа совместной культуры in vitro.
Ежедневная деятельность полости рта требует, чтобы зубы смысле внешних стимулов и внутреннего воспаления, с тем чтобы обеспечить надлежащее использование и техническое обслуживание. Однако, только ограниченная информация имеющаяся относительно сигналов которые управляют процессам?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана а) Национальные институты здравоохранения / NIAMS (грант номера R01 AR062507 и R01 AR053860 в RS), б) Университет Алабамы в Бирмингеме Стоматологическая академическая исследовательская подготовка (DART) грант (номер T90DE022736 (PI MacDougall)) в SBP от Национального института стоматологических и краниоциальных исследований / национального института в) UAB Глобальный центр краниофациальных, устных и стоматологических расстройств (GC-CODED) Пилот и доступность гранта SBP и d) Национальный институт стоматологии и craniofacial Научно-исследовательские/Национальные институты здравоохранения K99 DE024406 грант SBP.
5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |