Summary
Мы описываем изоляцию, дисперсию и покрытие зубной пульпы (DP) первичных клеток с тройничных (TG) нейронов культивируется на вершине над трансвелл фильтры. Клеточные реакции клеток ДП можно анализировать с помощью иммунофлюоресценции или АНАЛИЗА РНК/белка. Иммунофлуоресценция нейронных маркеров с конфокальной микроскопией позволяет анализировать реакции невритовых наростов.
Abstract
Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Без сенсорной иннервации ежедневная пероральная деятельность нанесет непоправимый ущерб. Несмотря на свою важность, роль иннервации в развитии и обслуживании зубов в значительной степени упускается из виду. Несколько исследований показали, что DP-клетки выделяют внеклеточные матричные белки и паракриновые сигналы для привлечения и руководства Аксонами TG в и по всему зубу. Тем не менее, несколько исследований предоставили детальное представление о перекрестном разговоре между мезенхимом DP и нейрональными афферентами. Для устранения этого пробела в знаниях исследователи начали использовать сокультуры и различные методы для изучения этих взаимодействий. Здесь мы демонстрируем несколько шагов, участвующих в сокультивации первичных клеток ДП с TG нейронов рассеялись на надивной трансвелл фильтр с большим диаметром поры, чтобы аксональный рост через поры. Первичные клетки DP с геном интереса в окружении локс сайтов были использованы для облегчения удаления генов с помощью аденовирусной-Cre-GFP рекомбиназной системы. Использование TG нейронов из мыши Thy1-YFP позволило точное афферентное изображение, с выражением значительно выше фоновых уровней конфокальной микроскопии. Ответы DP могут быть исследованы с помощью сбора и анализа белков или РНК, или же, через иммунофлуоресцентное окрашивание клеток ДП, покрытых съемными стеклянными крышками. Средства массовой информации могут быть проанализированы с помощью таких методов, как протеомный анализ, хотя это потребует истощения альбумина из-за присутствия сыворотки крупного рогатого скота в средствах массовой информации. Этот протокол предоставляет простой метод, которым можно манипулировать для изучения морфологических, генетических и цитоскелетных реакций TG нейронов и клеток ДП в ответ на контролируемую среду совместного культурного исследования.
Introduction
Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Неспособность почувствовать боль зубов, связанную с кариесом зубов и травмой, приводит к прогрессированию заболевания. Таким образом, надлежащая иннервация является требованием для нормального роста зубов, функции и ухода.
В то время как большинство органов полностью функциональны и invated к моменту рождения, развитие зубов распространяется на взрослую жизнь, с иннервации зубов и минерализации, происходящих в концерте во время послеродовой стадии1,2. Интересно, что зубная целлюлоза (DP) мезенхим первоначально выделяет репелленты сигналы во время эмбриогенеза, чтобы предотвратить проникновение аксона в развивающийся зубной орган, который позже переходит к секреции привлекательных факторов, как зуб приближается к извержению3,4. Во время послеродовых стадий афферентные аксоны из тройничного (TG) нерва проникают в и по всему зубу во время осаждения дентина начинается (обзор в Pagella, P. et al.5). Несколько исследований in vivo показали, что нейронно-мезенхимальные взаимодействия направляют иннервацию зубов у мышей (рассмотрено в Luukko, K. et al.6),но мало деталей молекулярных механизмов доступны.
Сокультуры клеток обеспечивают контролируемую среду, в которой исследователи могут манипулировать взаимодействиями между нейронными и мезенхимальными популяциями. Эксперименты по совместной культуре позволяют глубже углубиться в сигнальные пути, направляющие иннервацию и развитие зубов. Тем не менее, некоторые из обычных методов, используемых для изучения клеток в совместной культуре представляют технические проблемы. Например, кристально фиолетовое окрашивание невритовых наростов может неспецифически пятно Шванн клетки, включенные в TG рассеивания рассеивания расслоения расслоения, и могут быть пики интенсивности цвета с относительно небольшими ответами7. Микрофлюидные камеры предлагают привлекательный вариант, но значительно дороже, чем трансвелл фильтры8,9 и только позволяют исследования нейрональных реакций на DP выделения. Для решения этих вопросов, мы разработали протокол, который позволяет: а) точное окрашивание и изображение TG неврит рост в ответ на DP выделения, б) генетическая модификация DP клеток и / или TG нейронов для расследования конкретных сигнальных путей, и в) исследование DP клеток ответы на факторы, выделяемые TG нейронов. Этот протокол обеспечивает возможность точно исследовать несколько особенностей иннервации зубов в контролируемой среде анализа совместной культуры in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с мышами были одобрены Институциональным комитетом UAB по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Приготовление плиты
ПРИМЕЧАНИЕ: Обложки могут быть использованы для изображения dP-клеток в конце асссе. Убедитесь, что крышка пластины на все инкубации и промывки шаги за пределами стерильной ткани культуры капота для предотвращения загрязнения во время обработки образцов.
-
Подготовка coverslip
- Автоклав круговые крышки.
- Фильтр ультрачистая вода под капотом.
- Перенесите крышки на 24-колодную пластину и покройте каждый из них 400 мл/мл поли-Д-лизин.
- Разрешить coverslips, чтобы впитаться, погруженный в течение 5 минут, на рокер на 12 об /мин или орбитальный шейкер на 40-50 об/мин. Убедитесь, что крышка на предотвращение загрязнения.
- Промыть крышки с фильтрованием ультрачистой воды около 5 мин на рокер на 12 об/мин или шейкер на 50 об/мин. Повторите.
- Разрешить крышки высохнуть, по крайней мере 2 ч под капотом с пластиной крышкой, чтобы облегчить испарение. Эти крышки должны быть использованы в пределах 48 ч.
- Клетки семян DP на вершине охватывает и обрабатывают в конце анализа на иммунофлуоресценцию (раздел 3.3).
-
Фильтры покрытия
- Разбавить ламинин до 10 мкг/мл. Фильтр разбавленного ламинина под капотом.
- Пипетка 450-500 л из 10 мкг/мл ламинина в каждую скважину из 24-колодца пластины.
- Поместите трансвелл фильтр, 3 мкм пористость, в хорошо, так что он контактирует с раствором ламинина и оставить его в инкубаторе 37 градусов по Цельсию либо на 2 ч или на ночь. Фильтр поры должны позволить некоторые решения для рассеиваться и пальто как в верхней и нижней части фильтра. Эти фильтры должны использоваться в течение 48 ч или храниться в холодильнике при 4 градусах По Цельсию в течение 1 недели.
2. Клеточное покрытие с факультативным генетическим манипулированием
- Мыши: Генетическое изменение клеток DP может быть выполнено (но не требуется) для изучения мезенхимально-нейрональных взаимодействий. Смотрите разделы 2.3 и 2.4 для предлагаемых генетических вариаций.
- DP вскрытие, дисперсия и покрытие(рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для dP вскрытия, используйте ультра-тонкие, прямой край щипц. Ультратонкие края позволят пользователю вклинить край силы между минерализованной структурой и тканью DP.- Урожай P5-P8 мышей. На этом этапе зубы должны быть минерализуются, а корень открыт.
- Обезоживать новорожденных с помощью переохлаждения, помещая их в блюдо в холодильнике 4 ккс, пока они больше не двигаться или реагировать на ощупь. Эвтаназия новорожденных путем обезглавливания и в соответствии с процедурами IACUC на указанном объекте.
- Подготовьте 3-5 мл аликот 0,25% трипсин-EDTA в 50 мл конической трубки для сбора DP от каждой мыши. Это облегчит переваривание зубной пульпы у послеродовых мышей. Используйте более 3 мл при переваривании тканей более чем у 10 послеродовых мышей.
- Поместите голову на одноразовую подкладку так, чтобы рот к потолку и основание шеи плоским на рабочей поверхности. Используйте лезвие бритвы в распиловки движения, чтобы отделить челюсть от челюсти.
- Дополнительно удалить язык либо с ножницами или с щипками, чтобы облегчить доступ к молярам.
- Поместите открытую голову в блюдо на стерильной марлевой площадке и поместите образец под рассекающим микроскопом(рисунок 1D).
- Удалите альвеолярную костную ткань, окружающую первые моляры. Подчелюстные зубы не полностью прорезаются в этой точке. Вставьте щипцы в альвеолярное отверстие и дразнить ткани от зуба к buccal (щека) или лингвистической (язык) стороне рта. Челюстные зубы потребуют полного удаления расщелина вокруг зуба для воздействия и удаления.
- Аккуратно перенесите подчелюстные и челюстно-лицевые первые моляры (M1s) в отдельное блюдо клеточной культуры с 1x фосфат-буферным сольней (PBS).
- Повторите 2.2.4-2.2.8 до тех пор, пока все M1s не будут собраны. Держите блюдо, содержащее M1s на льду во время уборки урожая.
- Удалите внешний орган Enamel (EOE), окружающий внешнюю сторону каждого M1. Это может быть сделано после шага 2.2.11.
- С набором щипц, поверните M1 так cusps вниз и открытый корень подвергается. На дне зуба будет овальное отверстие, а непрозрачная ткань ДП инкапсулирована тонким слоем дентина и эмали.
- Используя кончик щипцы, мягко ослабить DP, запустив одну руку щипцы вокруг внутренней окружности минерализованной ткани. Удалить ткань DP из минерализованной структуры и передать его в третье блюдо, содержащее 1x PBS. Удалите EOE, если он еще не отделен(рисунок 1E).
- Перенесите всю ткань DP на 0,25% трипсин-ЭДТА в конической трубке 50 мл. Vortex смесь и место в 37 градусов по Цельсию теплой водяной бане в течение 10 минут. Это может быть сделано с теми же щипцы или с длинными, флакон щипцы. Ткань будет трудно разойтись и потребует вихря каждые 3-4 мин. Не превышать 10 мин трипсиизации, так как трипсин может повредить клеточные мембраны.
- Под стерильным капюшоном добавьте разогретые средства массовой информации совместной культуры(Таблица 1)к окончательному соотношению не менее 1:1 носителя, чтобы трипсин инактивировать фермент. Более большие соотношения приемлемы если больше дисперсии ткани желательно.
- Pipette средств массовой информации вверх и вниз несколько раз с 10 мл пипетка для дальнейшего разгона DP в средствах массовой информации. Будьте осторожны, чтобы избежать больших пузырьков. Полное дисперсия практически невозможна из-за липкой природы ткани. Тем не менее, это также не является необходимым, поскольку клетки будут мигрировать наружу из ткани после покрывало.
- Передача 1 мл рассеянного DP к каждой скважине из 24-хорошо ткани культуры пластины(рисунок 1F).
- Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и позвольте клеткам прикрепляться и мигрировать из неразоперсперых тканей в течение 48 ч перед изменением носителя. Первичные клетки должны быть покрыты в относительно высоких концентрациях, чтобы достичь 85-90% слияния в течение 1 недели. Если это не будет достигнуто через 1 неделю, отбросьте пластину.
- Факультативное генетическое манипулирование клетками ДП
- Чтобы изменить пути сигнализации клеток, урожай DP клеток из генетических мышей нокаут или от мышей, в которых ген интереса в окружении loxP сайтов. В последнем случае, ген может быть удален с помощью рекомбины Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) для удаления флангового гена, как описано ниже. Используйте Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) в качестве контрольного вируса, чтобы гарантировать, что вирусная инфекция не вызывает клеточной реакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ad-eGFP контролируется усилителем промоутера CMV, который очень силен. Ad-Cre-GFP регулируется IRES, внутренним регулятивным регионом между Cre и GFP, который не очень силен. Это приводит к более яркой флуоресценции в клетках Ad-eGFP, чем в ad-Cre-GFP. Подтверждать эквивалентные уровни инфекции на основе общего числа клеток флуоресценции, а не на уровнях клеточной флуоресценции. - Подготовьте 500 л носителей, содержащих вирус, и 10 мкг/мл полибрена на скважину. Polybrene помогает с вирусной инфекцией в клетках около слияния10. Этот протокол основан на множественности инфекции (MOI) 100 для Ad-eGFP и 200 Ad-Cre-GFP для эффективной генной инфекции с небольшим или вообще не влияет на жизнеспособность клеток. Расчетный номер ячейки 4 х 104 клетки / хорошо из 24-хорошо пластины:
- Смешайте носители с кратким вихрем или пипеткой и добавьте 500 кL к каждой скважине.
- После 24 ч добавьте еще 500 qL кокультурных носителей, которые не содержат дополнительных полибренов или вирусов.
- После в общей сложности 48 ч, аспирированные вирусосодержащие средства массовой информации и заменить на свежие совместно-культуры средств массовой информации. На данный момент, TG нейроны могут быть добавлены на вершине трансвелл фильтров.
- Чтобы изменить пути сигнализации клеток, урожай DP клеток из генетических мышей нокаут или от мышей, в которых ген интереса в окружении loxP сайтов. В последнем случае, ген может быть удален с помощью рекомбины Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) для удаления флангового гена, как описано ниже. Используйте Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) в качестве контрольного вируса, чтобы гарантировать, что вирусная инфекция не вызывает клеточной реакции.
- Рассечение нейронов тригеминала, рассечение и покрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, изображение неврита нарост в совместной культуре с DP клетки были оптимизированы с помощью подростков (6-недельный) B6.Cg-Tg (Thy1-YFP)16Jrs/J мышей. Центральная и периферическая нервная системы мышей Thy1-YFP имеют желтый флуоресцентный белок (YFP) тег, выражение которого начинается вокруг P6-P10 в нейронах и увеличивается экспоненциально по всей нервной системе в течение послеродовой и взрослой жизни11,12. YFP и GFP сохранили последовательности, которые позволяют этим нервам быть окрашены антителами против GFP, в результате чего пан-нейронального пятна. В конечном счете, эти мыши позволяют лучше визуализации и количественной оценки нейронов, используемых и выращенных в клеточной культуре.- Эвтаназия подростков мышей с углекислым газом с последующим вывихом шейки матки.
- Обезглавить мышей и удалить кожу из черепа. Не забудьте включить эквивалентное количество мужчин и женщин.
- Вставьте кончик пары микрорассекующих ножниц в основание черепа. Вырезать вдоль sagittal шов черепа(Рисунок 1A).
- Сделайте четыре небольших горизонтальных пореза: два вдоль корональных швов ушами и два вдоль швов лямбдоида у основания черепа. Это должно создать два закрылка кости.
- Используйте щипцы, чтобы очистить назад два закрылка кости. Это должно выявить мозг.
- Удалите мозг. Перенесите голову в блюдо культуры тканей с 1x PBS и положить под микроскопом.
- Найдите TG ганглии, которые легко видны у грызунов13, размещенных в дюре материи между мозгом и кости челюстно-лицевого процесса (Рисунок 1B).
- Вырезать три ветви, которые путешествуют в глаза, челюсти и челюсти и передачи ганглиев на холодный 1x PBS с помощью прямой край штрафа щипцы. Держите блюдо, содержащее Ганглии TG на льду во время уборки урожая.
- После того, как все TG пучки собирают, передача ганглиев в 50 мл конической трубки, содержащей 5 мг/мл стерильной фильтрованной коллагеназы типа II с помощью флаконщины.
- Vortex коллагенеза с tG расслоение и поместить трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25-30 мин. В течение этого времени, принять конические трубки из водяной ванны, вихрь, и вернуться в ванну каждые 5-10 минут.
- Centrifuge коллагеназа-TG нейрона решение в течение 2 мин на 643 х г.
- Под капюшоном культуры ткани, нежно аспирировать коллагенеза с micropipette.
- Добавьте 5 мл 1% стерильной фильтрованного трипсина II типа и вихря. Поместите коническую трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Centrifuge трипсин-TG смесь в течение 5 мин на 643 х г. Удалите верхнюю часть трипсина с помощью микропипетта, чтобы нейроны TG не удаляются. В трубке все равно будет жидкость.
- Добавьте достаточное количество носителей, чтобы отключить оставшийся трипсин (при 1:1 или более низком соотношении трипсина к сми).
- Подсчитайте количество клеток и разбавьте раствор до 200 000 клеток/мл (250 л клеток, содержащих 50 000 клеток).
- Поместите фильтры с покрытием трансвелл из раздела 1.2 в колодцы с DP.
- Разбавить клеток содержащий раствор так, что Есть 200000 клеток / мл. Пипетка 250 л на трансвелл фильтр, и культуры клеток на 37 градусов по Цельсию в одночасье(рисунок 1F).
- На следующий день, заменить средства массовой информации с 1 мл со-культуры средств массовой информации с 1 ММ уридина и 15 ММ 5 '-флюор-2'deoxyuridine, чтобы остановить чрезмерное распространение мезенхимальных клеток, которые могут предотвратить неврит овых. Дополнительно: Добавить факторы роста или ингибиторы в этом носителе при попытке дальнейших манипуляций.
- Культура клетки для дополнительных желаемых точек времени. Этот протокол был оптимизирован в течение 5 дней культуры со средствами массовой информации изменены только на второй день, чтобы добавить митотические ингибиторы. Более длительные периоды времени потребуют дополнительных изменений мультимедиа.
3. Сбор и обработка образцов
- Тройничное окрашивание
- Pipette 1 мл aliquots стерильных 1x PBS в 24-колодец пластины под тканью культуры капот для каждого трансвелл фильтр анимируется.
- Удалите жидкость на вершине фильтра, удаляйтесь с помощью пипетки на 200-1000 л, стараясь оставить слои клеток нетронутыми. Прикрепленные клетки должны оставаться прикрепленными и незакрепленные клетки будут свободно во время этого нежного pipetting. Вакуумный фильтр может повредить слой клетки и не рекомендуется для аспирации.
- Перенесите фильтр на пластину 1x PBS, будучи уверенным, чтобы удалить верхний слой носителя, как упоминалось в предыдущем шаге.
- Поместите пластину со всеми трансвелл фильтры и крышки на рокер на 12 об/мин или 40-50 об/мин на орбитальный шейкер в течение 10 минут.
- Аспирировать PBS, в том числе верхний слой, как описано выше, добавить 500 зл 1xPBS и место на рокер или орбитальный шейкер для дополнительного 5-10 мин промыть.
- Аспирируйте 1x PBS еще раз и заменить 4% параформальдегида (PFA). Используйте не менее 500 л, чтобы вся поверхность фильтра была погружена в воду. Поместите тарелку на рокер при 12 об/мин или орбитальный шейкер при 40-50 об/мин при комнатной температуре 1 ч.
- Удалите PFA и промыть пластины дважды в течение 5-10 минут каждый на рокер с 500 Зл л 1x PBS.
- Блок с 10% бычьей сыворотки альбумина (BSA) 5% козьей/ ослиной сыворотки, в зависимости от вторичного животного хозяина антитела, в 0.05% Tween-1xPBS (PBST). Используйте 450-500 л раствора, чтобы фильтр погружался в жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, эти пластины могут храниться при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких месяцев для обработки в более позднее время. Используйте parafilm для уплотнения пластины, чтобы обеспечить испарение не происходит и регулярно проверять на испарение, так что поверхность фильтра остаются погруженными. - Удалить блок и добавить 450-500 л первичных антител в 1% BSA-PBST без дополнительной промывки. Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь, нежно качаясь.
- Удалить первичный раствор антитела и промыть 500 л 1xPBST на рокер, 3 раза, при комнатной температуре
- Удалить PBST, добавить вторичные антитела и инкубировать на рокер ночь на 4 КС, завернутые в алюминиевую фольгу для защиты фторофоров от деградации света. Промыть снова, 3 раза, с 1x PBST на рокер при комнатной температуре. Заменить на 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, пластина может храниться в течение нескольких месяцев при 4 градусах Цельсия, если завернутый в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить деградацию фторофора. Используйте parafilm для уплотнения пластины, чтобы обеспечить испарение не происходит и регулярно проверять на испарение, так что поверхность фильтра остаются погруженными. Лучше всего изображение в течение одного месяца. - Для оптимальной визуализации, использовать Thy1-YFP мыши нейронов с анти-GFP антитела специально пятно нейрональных афферентов значительно выше фоновых уровней. Используйте Anti-Neurofilament 200, чтобы точно пятно аксональных структур, если Thy1-YFP мышей не доступны.
- Изображение по желанию. Фильтры не должны быть покрыты и вместо этого могут быть размещены на вершине coverslip или слайд для визуализации с перевернутым микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Области фильтра не будут содержать афферентные структуры. Возьмите несколько изображений с глубиной z-стек, который захватывает все афферентные структуры. Используйте программное обеспечение для сшивания для визуализации неврита на больших площадях или (желательно) целых областях фильтра.
- Коллекция РНК, белков и носителей
- В то время как трансвелл фильтры обработки, собирать средства массовой информации в RNAse / DNAse свободных труб и заморозить для более поздних анализов (ELISA, протеомика и т.д.).
- Сразу же после сбора средств массовой информации, аликвот лисис буфера или радио иммуно осадков Анализ (RIPA) буфер с протеиназы и фосфатазы ингибиторов в скважины. Этот протокол был оптимизирован для 100 л/колодца в 24-хорошей пластине.
- Разрешить буферов лиза клетки в течение 5 минут, а затем очистить каждый фильтр с новым кончиком пипетки, и собирать образцы клеток в RNAse / DNAse свободных труб. Заморозить лисис для будущих анализов (полуколичественные и/или количественные ПЦР, Западная поника и т.д.).
- Факультативная иммунофлуоресценция клеток зубной целлюлозы:
- Аккуратно поднимите крышки из раздела 1.1 с щипками и перенесите их в различные скважины с 4% PFA на 1 ч с раскачиванием.
- Аспир PFA и промыть крышки дважды с 1x PBS. Следуйте этому с пермяковизацией, блокированием и иммунофлуоресценцией для маркеров, представляющих интерес со стандартными методами иммунофлюоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эти результаты показывают, что TG neurite рост был увеличен в присутствии первичных клеток DP в основной хорошо по сравнению с контролем TG неврит монокультуры (Рисунок 2A,C). Существует некоторая изменчивость асссея в неврите. Таким образом, монокультура нейронов TG должна быть включена во все анализы в качестве контроля для обнаружения базальных уровней невритовых наростов. Первичные клетки из мыши Tgfbr2f/f были использованы в этом протоколе после заражения Ad-Cre-GFP и Ad-eGFP было подтверждено в эквивалентном количестве клеток (Рисунок 2D). Ad-eGFP служил в качестве контрольного вирусного вектора. Ad-Cre-GFP удалил и фланговый ген Tgfbr2, о чем свидетельствует полуколичественный ПЦР(рисунок 2E). В культурах с Преобразование фактор роста бета-рецептор 2 (Tgfbr2) удаление, неврит рост был уменьшен(Рисунок 2A-C).
Мы использовали Thy1-YFP мыши TG нейронов и окрашенных их анти-GFP антитела, которые производятся очень конкретные и яркие изображения аксональных структур значительно выше этого фона, как показано на рисунке 2. Это позволило специфическое окрашивание нейронных маркеров без неспецифического окрашивания ненейрональных клеток, используя ранее сообщалось методы, такие как кристалл фиолетовый7. Большие поры в фильтрах могут аутофлоресцировать и/или накапливать вторичные антитела и уменьшать точность аксональной визуализации(рисунок 3). В то время как нейроны Thy1-YFP с иммунофлуоресценцией значительно улучшает визуализацию, дальнейший фон может быть удален с помощью программного обеспечения с автоматической пороговой оценкой, а затем количественно. Мы также рекомендуем выполнять иммунофлуоресценции для нейрофиламента 200 на основе наших предварительных выводов (не показано), а также другие8,9, если Thy1-YFP мышей не доступны.
Рисунок 1: Схема вскрытия мыши для получения клеток для совместной культуры. (A) Диаграмма, где вырезать, чтобы открыть череп мыши и найти TG нервы, показанные черным цветом в последнем изображении. Ножницы указывают, где вставить ножницы советы, чтобы сократить вдоль пунктирных линий. (B) Комбинированное темное поле и GFP изображение, показывающее Thy1-YFP TG нервы кружили в белом. (C) Вскрытые TG ганглии могут быть рассеяны и культивированы, как показано в F. (D) Нижнее нижнее челюсть мыши P7, с щипками проведения нижней челюсти слева и альвеолярных костных хребтов, содержащих невырые зубы на каждой стороне языка. (E) DP ткани (обведенные) извлечены из минерализованной структуры (вверху), и эмали внешнего эпителия (внизу), который был удален для разгона и пластины в ткани культуры обработанной пластины, как показано на F. Изображения не отображаются для масштабирования. DP клетки были рассеяны и выросли до слияния, прежде чем добавить TG нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Результаты представительского от совместной культуры. (A-C) Thy1-YFP TG нейроны были культивированы в трансвелл фильтры с 3 мкм поры на вершине первичных tgfbr2f/f DP клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание было выполнено для белка YFP с использованием анти-GFP антитела для обеспечения весьма специфического окрашивания нейронных структур по всему фильтру. Максимальные проекции 100 мкм z-стек конфокальной микроскопии изображения в 10x были собраны и сшиты с помощью программного обеспечения для сшивания. TG нейронов продемонстрировали значительно больше роста, когда совместно с DP клеток(A), чем когда культивированный в одиночку (C). Нейритный рост не был вызван, когда нейроны были совместно культивированы с DP клеток, инфицированных Ad-Cre-GFP сбить Tgfbr2 (B). Шкала бар 1000 мкм. Эквивалентное количество клеток, инфицированных Ad-eGFP и Ad-Cre-GFP, отображается в (D). Шкала бар 125 мкм. Полуколичественный ПЦР подтвердил Tgfbr2 KD(E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Технические трудности, представленные в афферентной визуализации. (A) Брайтфилд изображения трансвелл фильтры после кристально фиолетового окрашивания клеточных популяций. Большие поры распространены. Большая стрелка указывает на клетку, которая проявляет мезенхимальную морфологию, в то время как маленькая стрелка указывает на клетку нейрональной морфологии. Кристально-фиолетовый окрашенных обеих клеток без предвзятости. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание тубулина No3 с вторичным антителом Alexa-488 показало неспецифическое окрашивание нескольких клеток, что затрудняет визуализацию афферентных структур. Изображения являются репрезентативными и были повторены в течение нескольких анализов для оптимизации изображения показано на рисунке 2. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Компонент | Объем | Концентрации | |
| МЕМ З. | 440 мл | ||
| Тепло инактивированных плода бычьей серфю | 50 мл | 10% | |
| 100x L-глутамин | 5 мл | 1x | |
| Пенициллин-стрептомицин 100 x | 5 мл | 1x | |
| Изменение носителя на второй день с митотические ингибиторы в этих конечных концентраций | |||
| Уридин | 1 км | ||
| 5'-Флуор-2'деоксюридин | 15 км | ||
Таблица 1: Средства массовой информации совместной культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ежедневная деятельность полости рта требует, чтобы зубы смысле внешних стимулов и внутреннего воспаления, с тем чтобы обеспечить надлежащее использование и техническое обслуживание. Однако, только ограниченная информация имеющаяся относительно сигналов которые управляют процессами развития иннервации зуба. Этот протокол предоставляет метод изоляции и совместной культуры первичных клеток ДП и TG нейронов для изучения перекрестного общения между двумя популяциями. Некоторые переменные были оптимизированы и оставляют открытыми дальнейшие возможности для исследований, как описано ниже.
Элементы управления важны на каждом шагу в этом ассе. Трансвелл фильтр с TG нейронов без основных dP-клеток должны быть включены в каждый ассс, чтобы обеспечить базовый для роста TG. При удалением флангового гена интереса с рекомбиназой Ad-Cre-GFP, контрольный вирус, выражающий только флуоресцентный маркер, должен быть использован для подтверждения того, что эквивалентное количество клеток было инфицировано. Хотя мы продемонстрировали высокий уровень инфекции с минимальной гибелью клеток на 100 и 200 МВД для Ad-eGFP и Ad-Cre-GFP, соответственно, каждая лаборатория должна оптимизировать этот шаг. Поскольку флуоресцентные белки могут быть прикреплены к различным промоутерам и, следовательно, вызывают дифференциальное выражение эквивалентного количества инфицированных, флуоресцентные клетки должны быть подсчитаны. Общая интенсивность флуоресценции не имеет значения, поскольку она не точно отражает состояние инфекции. Важно продемонстрировать удаление гена, как показано с полуколичественным ПЦР в этом протоколе(рисунок 2). Хотя этот протокол не рассматривал эту тему, предыдущие исследования показали, что контрольные анализы с другими линиями клеток могут быть включены, чтобы продемонстрировать, что неврит ный рост специально индуцированных совместной культуры с DP-клеток8.
Поскольку этот протокол использует первичные клетки, существует несколько стадий, на которых может быть введено загрязнение. Чтобы предотвратить это, все реагенты должны быть стерильные фильтруются. Кроме того, рекомендуется проводить эксперименты для каждой переменной в дубликате или тройном, с тем чтобы обеспечить удаление фильтра и стерилизацию загрязненного колодца без полного сбоя в проведении асссе.
Обложки должны быть покрыты поли-D-лизин омичи и / или внеклеточного матричного белка для обеспечения Сцепноения клеток DP. Пока клетки первоначально прикрепляют, вирусная инфекция причиняет смерть клетки поднимая на uncoated крышках и предотвращает генетические манипуляции сподобия-
Хорошо известно, что ненейронные клетки, такие как клетки Шванн из ТГ ганглия, может повлиять на выживание нейрональных клеток в культуре14,15,16. В этом протоколе, выживаемость нейронов была оптимизирована путем добавления 1 мкм урин и 15 ММ 5-фтор-2'deoxyuridine. Без добавления этих антимитотических агентов для ингибирования пролиферации клеток Шванна, нейрита не произойдет. Неизвестно, является ли присутствие этих старческих клеток Шванна в совместной культуре изменить реакцию нейронов. Изолировать нейроны мурин требует нескольких дополнительных шагов, и протоколы доступны для исследователей, которые хотят удалить эту переменную17. В любом случае, дисперсия нейронов несколько имитирует акотомию и может рассматриваться как представление травмы / ремонт18 больше, чем развитие. Дальнейшие исследования потребуются для определения различий между ин виво аксональным ростом от фасциклов против аксонального роста от отдельных нейронов in vitro, и они не рассматриваются в этом протоколе.
Этот протокол занимает 1-3 недели от начала до конца. Хотя можно использовать DP клетки, которые требуют более 1 недели, чтобы достичь 85-90% слияния, рекомендуется, чтобы клетки были посеяны при достаточно высокой плотности, чтобы достичь слияния в течение нескольких дней, так как эти клетки делятся очень медленно мимо этой точки. Это обычно требует около 5-7 P5-8 мышей на ряд 24-хорошо пластины. Этот протокол был оптимизирован в общей сложности на 5 дней совместной культуры, в этот момент средства массовой информации с фенол красный начал сдвиг цвета. Средства массовой информации должны быть изменены, если требуется более длительные анализы.
Несколько анализов сокультуры были выполнены, чтобы продемонстрировать невритовый рост в ответ на факторы, выделяемые DP выделяется факторов со стандартными ECM покрытием ткани культуры пластин3,19,20,21 или микрофлюидных камер8,22,23. Этот протокол предлагает ряд преимуществ по сравнению с этими методами. Например, TG ганглиев и DP ткани совместной культуры требует конкретных пространственных отношений для нейритов, чтобы чувствовать и реагировать на сигналы ближнего паракрина. С культурой органа, только невриты в ганглиях самых близких к ткани DP способны ответить3,тогда как рассеянные нейроны TG используемые в этом протоколе культивируются на равном расстоянии от клеток DP внизу. Во-вторых, культуры органов могут ввести некроз тканей из-за недостатка кислорода и питательных веществ, доступных в больших образцах24. Сокультура рассеянных клеток устраняет эту возможность. Некоторые со-культуры, включая нейроны требуют нейронных средств3,22, которые могут играть доминирующую роль в содействии неврит роста. Этот протокол не добавляет нейрон-специфических факторов роста, тем самым позволяя для оценки прямой связи между паракринными сигналами от основных клеток DP и невритовых реакций роста. Стоит отметить, что в средствах массовой информации совместной культуры также отсутствуют компоненты для содействия минерализации, такие как бета-глицерофосфат. Это позволяет следователям определить, как нейриты могут выделять сигналы для поощрения минерализации. Тем не менее, он также ограничивает исследование только в том числе менее дифференцированных клеток ДП без минерализации одонтобластов, которые, как правило, присутствуют в vivo.
Колористические ответы от предыдущих исследований7,8 не разграничивают вклады клеток Шванна и не демонстрируют нейрональной морфологии, так как кристально фиолетовый неспецифически пятна всех клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание фильтров может привести к высокому фоновым уровням, которые затрудняют афферентную визуализацию(рисунок 2). Настоящий протокол позволяет точное окрашивание нейронных афферентов, используя Thy1-YFP TG нейронов и антитела против GFP и обеспечивает сигнал достаточно ярким для создания больших изображений роста по всей фигуре (Рисунок 3). Можно использовать другие нейронные маркеры, такие как Анти-Нейрофиламент 200, если Thy1-YFP мышей не доступны.
Наконец, использование первичных клеток DP от мышей с генами интереса в окружении локс сайтов позволяет простои и эффективное удаление этих генов с системой Ad-Cre-GFP. В будущих исследованиях, Ad-Cre рекомбиназы система может быть использована на TG нейронов, если они имеют ген интереса в окружении локс сайтов. Это облегчило бы изучения на как paracrine сигналы от нейронной населенности влияют на клетки DP, определенно если клетки DP семя на крышках (раздел 1.1). В будущих исследованиях могут использоваться другие манипуляции, такие как добавление фармакологических ингибиторов и/или факторов роста. Кроме того, можно изменить этот протокол, чтобы включить миграционные исследования с помощью 8 мкм пористость трансвелл фильтры.
В заключение, это трансвелл совместно-культуры асссс с использованием нейронов и DP клеток позволяет для исследования нескольких клеточных параметров. Это позволяет расширить тело знаний о мезенхимально-нейрональных взаимодействий, которые способствуют и поддерживают иннервации зубов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана а) Национальные институты здравоохранения / NIAMS (грант номера R01 AR062507 и R01 AR053860 в RS), б) Университет Алабамы в Бирмингеме Стоматологическая академическая исследовательская подготовка (DART) грант (номер T90DE022736 (PI MacDougall)) в SBP от Национального института стоматологических и краниоциальных исследований / национального института в) UAB Глобальный центр краниофациальных, устных и стоматологических расстройств (GC-CODED) Пилот и доступность гранта SBP и d) Национальный институт стоматологии и craniofacial Научно-исследовательские/Национальные институты здравоохранения K99 DE024406 грант SBP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
