Summary
Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.
Abstract
A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. Sem inervação sensorial, atividades orais diárias causariam danos irreparáveis. Apesar de sua importância, os papéis de inervação no desenvolvimento e manutenção dos dentes têm sido largamente negligenciados. Vários estudos demonstraram que as células DP secretam proteínas de matriz extracelular e sinais de paracrina para atrair e guiar axônhons TG para dentro e por todo o dente. No entanto, poucos estudos forneceram uma visão detalhada do crosstalk entre o mesenchyme DP e os afíferos neuronais. Para abordar essa lacuna de conhecimento, os pesquisadores começaram a utilizar co-culturas e uma variedade de técnicas para investigar essas interações. Aqui, demonstramos os múltiplos passos envolvidos na co-culturing células DP primárias com neurônios TG dispersos em um filtro transwell sobreposto com poros de grande diâmetro para permitir o crescimento axonal através dos poros. Células DP primárias com o gene de interesse ladeado por sites loxP foram utilizadas para facilitar a exclusão genética usando um sistema de recombinase Adenovirus-Cre-GFP. O uso de neurônios TG do mouse Thy1-YFP permitiu imagens afáveis precisas, com expressão bem acima dos níveis de fundo por microscopia confocal. As respostas dp podem ser investigadas através de coleta e análise de proteínas ou RNA, ou alternativamente, através de coloração imunofluorescente de células DP banhadas em tampas de vidro removíveis. A mídia pode ser analisada usando técnicas como análises proteômicas, embora isso exija esgotamento de albumina devido à presença de soro bovino fetal na mídia. Este protocolo fornece um método simples que pode ser manipulado para estudar as respostas morfológicas, genéticas e citosesqueléticas de neurônios TG e células DP em resposta ao ambiente controlado de um ensaio de co-cultura.
Introduction
A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. A não sentir dor dentária associada a cárie dentária e trauma leva à progressão da doença. Assim, a interioração adequada é uma exigência para o crescimento normal dos dentes, função e cuidado.
Enquanto a maioria dos órgãos são totalmente funcionais e internados no momento do nascimento, o desenvolvimento dentário se estende à vida adulta, com a inervação dentária e mineralização ocorrendo em concerto durante os estágios pós-parto1,2. Curiosamente, o mesenchyme de polpa dentária (DP) inicialmente secreta sinais repelentes durante embriogênese para evitar a entrada de axônono no órgão dentário em desenvolvimento, que mais tarde muda para a secreção de fatores atrativos à medida que o dente se aproxima da erupção3,4. Durante os estágios pós-natal, axôndegas afízios do nervo trigeminal (TG) penetram dentro e em todo o dente em torno do momento em que começa o depoimento dentin (revisado em Pagella, P. et al.5). Vários estudos in vivo demonstraram que interações neuronal-mesenquimicas guiam a interioração dentária em camundongos (revisadas em Luukko, K. et al.6),mas poucos detalhes dos mecanismos moleculares estão disponíveis.
As coculturas celulares fornecem ambientes controlados nos quais os pesquisadores podem manipular interações entre populações neuronais e mesenquinais. Experimentos de cocultura tornam possível aprofundar-se nos caminhos de sinalização que orientam a interioração e o desenvolvimento dos dentes. No entanto, vários dos métodos convencionais utilizados para estudar células na cocultura apresentam desafios técnicos. Por exemplo, a coloração violeta cristalina do crescimento neurite pode não especificamente manchar as células schwann incluídas nas dispersões de feixe de TG, e pode haver picos de intensidade de cor com respostas relativamente pequenas7. As câmaras microfluidas oferecem uma opção atraente, mas são consideravelmente mais caras do que os filtros transwell8,9 e só permitem a investigação de respostas neuronais às secreções dp. Para abordar essas questões, desenvolvemos um protocolo que permite: a) a) a) manipulação precisa e imagem do crescimento neurite TG em resposta às secreções DP, b) modificação genética das células DP e/ou neurônios TG para investigar caminhos específicos de sinalização e c) investigação de respostas de células DP a fatores secretos pelos neurônios TG. Este protocolo fornece a capacidade de investigar com precisão várias características de innervation dentária no ambiente controlado de um ensaio de co-cultura in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAB (IACUC).
1. Preparação de placas
NOTA: Os deslizamentos de cobertura podem ser usados para visualizar células DP no final do ensaio. Certifique-se de que a tampa da placa está acesa durante toda a incubação e lavagem de passos fora da capa da cultura do tecido estéril para evitar contaminação durante o processamento da amostra.
-
Preparação do deslizamento de cobertura
- Coverslips circulares autoclave.
- Filtre água ultrapura o capô.
- Transfira os coverslips para uma placa de 24 poços e cubra cada um com 400 μL de 0,1 mg/mL poli-D-lysine.
- Deixe os deslizamentos de cobertura para absorver, imersos por 5 min, em um roqueiro a 12 rpm ou shaker orbital a 40-50 rpm. Certifique-se de que a tampa está ligada para evitar contaminação.
- Enxágüe os deslizamentos de cobertura com água ultrapura filtrada por cerca de 5 min em um roqueiro a 12 rpm ou shaker a 50 rpm. Repetir.
- Deixe os deslizamentos de cobertura secarem por pelo menos 2 h o capô com a tampa da placa desligada para facilitar a evaporação. Esses comprovantes de cobertura devem ser usados dentro de 48 h.
- As células DeP de sementes no topo dos deslizamentos de cobertura e processam no final do ensaio para imunofluorescência (seção 3.3).
-
Filtros de revestimento
- Diluir lamina para 10 μg/mL. Filtre o laminindilizado o capô.
- Pipette 450-500 μL de 10 μg/mL laminin em cada poço de uma placa de 24 poços.
- Coloque o filtro transwell, porosidade de 3 μm, em um poço para que ele entre em contato com a solução de laminin e deixe-o em uma incubadora de 37 °C por 2 h ou durante a noite. Os poros filtrados devem permitir que parte da solução difunda e recubra tanto a parte superior quanto a parte inferior do filtro. Estes filtros devem ser usados dentro de 48 h ou ser refrigerados a 4 °C por até 1 semana.
2. Revestimento celular com manipulação genética opcional
- Camundongos: Alterações genéticas das células DP podem ser realizadas (mas não é necessária) para estudar interações mesenquimal-neuronal. Veja as seções 2.3 e 2.4 para variações genéticas sugeridas.
- Dissecação dp, dispersão e chapeamento(Figura 1)
NOTA: Para dissecção dp, use fórceps ultra finos e de borda reta. As bordas ultrafinas permitirão ao usuário cunhar a borda do fórcepentre a estrutura mineralizada e o tecido DP.- Colher ratos P5-P8. Nesta fase, os dentes devem ser mineralizados, e a raiz está aberta.
- Anestesiar os recém-nascidos via hipotermia colocando-os em um prato na geladeira 4 °C até que eles não se movam mais ou respondam ao toque. Eutanize os recém-nascidos por decapitação e de acordo com os procedimentos da IACUC na instalação designada.
- Prepare uma alíquota de 3-5 mL de 0,25% de trypsin-EDTA em um tubo cônico de 50 mL para coletar o DP de cada mouse. Isso facilitará a digestão da polpa dentária dos camundongos pós-partos. Use mais de 3 mL se digerir tecido de mais de 10 camundongos pós-partos.
- Coloque a cabeça em um porca descartável para que a boca esteja em direção ao teto e a base do pescoço esteja plana na superfície do trabalho. Use uma lâmina de barbear em um movimento de serrapara separar a mandíbula da maxilosa.
- Remova opcionalmente a língua com tesouras ou com fórceps para permitir um acesso mais fácil aos molares.
- Coloque a cabeça aberta em um prato em cima de uma gaze estéril e coloque o espécime um microscópio dissecando(Figura 1D).
- Remova o tecido ósseo alveolar ao redor dos primeiros molares. Os dentes submandibulares não estão totalmente emeclosão neste momento. Insira fórceps na abertura alveolar e provoque o tecido longe do dente em direção ao lado buccal (bochecha) ou lingual (língua) da boca. Os dentes maxilos exigirão remoção total da fissura ao redor do dente para exposição e remoção.
- Transfira suavemente os primeiros molares submandibulares e maxilars (M1s) para um prato separado de cultura celular com salino 1x fosfato tampão (PBS).
- Repita 2.2.4-2.2.8 até que todos os M1 sejam coletados. Mantenha o prato contendo os M1s no gelo durante a colheita.
- Remova o Órgão Exterior esmalte (EOE) ao redor do lado de fora de cada M1. Isso pode ser feito após a etapa 2.2.11.
- Com um conjunto de fórceps, gire o M1 para que as cuspes caiam e a raiz aberta seja exposta. Haverá uma abertura oval na parte inferior do dente, e tecido DP opaco encapsulado por uma fina camada de dentina e esmalte.
- Usando a ponta dos fórceps, solte delicadamente o DP rodando um braço dos fórceps ao redor da circunferência interna do tecido mineralizado. Remova o tecido DP da estrutura mineralizada e transfira-o para um terceiro prato contendo 1x PBS. Remova o EOE se ainda não estiver separado(Figura 1E).
- Transfira todo o tecido DP para 0,25% de trypsin-EDTA em um tubo cônico de 50 mL. Vórtice a mistura e coloque em um banho de água morna de 37 °C por 10 min. Isso pode ser feito com os mesmos fórceps ou com fórceps longos e frascos. O tecido será difícil de dispersar e exigirá vórtice a cada 3-4 min. NÃO exceda 10 min de experimentação, já que a tentação pode danificar as membranas celulares.
- um capô estéril, adicione a mídia de cocultura aquecida(Tabela 1) a uma proporção final de pelo menos 1:1 mídia para tentar inativar a enzima. Proporções maiores são aceitáveis se mais dispersão tecidual for desejada.
- Pipette a mídia para cima e para baixo várias vezes com uma pipette de 10 mL para dispersar ainda mais o DP na mídia. Tenha cuidado para evitar grandes bolhas. A dispersão completa é quase impossível devido à natureza pegajosa do tecido. No entanto, também não é necessário, uma vez que as células migrarão para fora do tecido uma vez emplacados.
- Transfira 1 mL do DP disperso para cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (Figura 1F).
- Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C e permita que as células se anivirem e migrem do tecido não disperso por 48 h antes de mudar a mídia. As células primárias precisam ser banhadas em concentrações relativamente altas para atingir 85-90% de confluência dentro de 1 semana. Se isso não for alcançado após 1 semana, descarte a placa.
- Manipulação Genética Opcional de Células DP
- Para alterar as vias de sinalização celular, colher células DP de camundongos de nocaute genético ou de camundongos em que um gene de interesse é flanqueado por locais loxP. Neste último caso, o gene pode ser excluído usando a recombinação Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) para remover o gene ladeado, conforme descrito abaixo. Use o Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) como um vírus de controle para garantir que a infecção viral não cause uma resposta celular.
NOTA: O Ad-eGFP é controlado pelo potencializador de promotores cmv, que é muito forte. O Ad-Cre-GFP é regulado por um IRES, uma região regulatória interna entre o Cre e o GFP, que não é muito forte. Isso resulta em fluorescência mais brilhante em células Ad-eGFP do que as células Ad-Cre-GFP. Confirme os níveis equivalentes de infecção com base no número total de células fluorescing, não nos níveis de fluorescência celular. - Prepare 500 μL de mídia contendo vírus e 10 μg/mL de polibreno por poço. Polibreno auxilia com infecção viral em células próximas à confluência10. Este protocolo baseia-se em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 para Ad-eGFP e 200 Ad-Cre-GFP para infecção genética eficiente com pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular. O número estimado de células é de 4 x 104 células/poço de uma placa de 24 poços:
- Misture a mídia com breve vórtice ou pipetting e adicione 500 μL a cada poço.
- Após 24 horas, adicione mais 500 μL de mídia de cocultura que não contenha polibrena ou vírus adicionais.
- Depois de um total de 48 h, aspirar a mídia contendo vírus e substituir por novas mídias de cocultura. Neste ponto, os neurônios TG podem ser adicionados em cima de filtros transwell.
- Para alterar as vias de sinalização celular, colher células DP de camundongos de nocaute genético ou de camundongos em que um gene de interesse é flanqueado por locais loxP. Neste último caso, o gene pode ser excluído usando a recombinação Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) para remover o gene ladeado, conforme descrito abaixo. Use o Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) como um vírus de controle para garantir que a infecção viral não cause uma resposta celular.
- Dissecção trigeminal do neurônio, dispersão e chapeamento
NOTA: Neste protocolo, a imagem do crescimento neurite na cocultura com células DP foi otimizada utilizando adolescentes (6 semanas de idade) B6.Cg-Tg.Thy1-YFP)16Jrs/J ratos. Sistemas nervosos centrais e periféricos de camundongos Thy1-YFP têm uma etiqueta amarela de proteína fluorescente (YFP), cuja expressão começa em torno de P6-P10 em neurônios e aumenta exponencialmente em todo o sistema nervoso durante a vida pós-natal e adulto11,12. YFP e GFP conservaram sequências que permitem que esses nervos sejam manchados com anticorpos anti-GFP, resultando em uma mancha pan-neuronal. Em última análise, esses camundongos permitem uma melhor visualização e quantificação dos neurônios usados e cultivados na cultura celular.- Eutanize camundongos adolescentes com dióxido de carbono seguido de luxação cervical.
- Decapitar os ratos e remover a pele do crânio. Certifique-se de incluir números equivalentes de machos e fêmeas.
- Insira a ponta de um par de tesouras microdissecares na base do crânio. Corte ao longo da sutura sanittal do crânio (Figura 1A).
- Faça quatro pequenos cortes horizontais: dois ao longo das suturas coronais pelas orelhas, e dois ao longo das suturas lambdoides na base do crânio. Isso deve criar dois retalhos de osso.
- Use o fórceps para descascar os dois retalhos de osso. Isso deve revelar o cérebro.
- Remova o cérebro. Transfira a cabeça para um prato de cultura tecidual com 1x PBS e coloque o microscópio.
- Localize os gânglios TG, que é facilmente visível em roedores13, alojados na matéria dura entre o cérebro e osso do processo maxilar (Figura 1B).
- Corte os três ramos que viajam para os olhos, maxilos e mandíbulas e transfira os gânglios para PBS frios 1x usando fórceps finos de borda reta. Mantenha o prato contendo os gânglios TG no gelo durante a colheita.
- Uma vez colhidos todos os pacotes TG, transfira gânglios para um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mg/mL de colagenase filtrada estéril tipo II usando fórceps frascos.
- Vórtice a colagenase com o pacote TG e coloque o tubo em um banho de água de 37 °C por 25-30 min. Durante esse tempo, pegue o tubo cônico do banho de água, vórtice, e volte ao banho a cada 5-10 min.
- Centrífuga a solução de neurônio colagenase-TG por 2 min a 643 x g.
- um capuz de cultura tecidual, gentilmente aspiraa a colagenase com uma micropipeta.
- Adicione 5 mL de 1% de trypsin filtrado estéril tipo II e vórtice. Coloque o tubo cônico em um banho de água de 37 °C por 5 min.
- Centrífuga o mix trypsin-TG por 5 min a 643 x g. Remova a porção superior da trippsina com uma micropipette, para que os neurônios TG não sejam removidos. Ainda haverá líquido no tubo.
- Adicione mídia suficiente para desativar a trippsina restante (a uma proporção 1:1 ou menor de trippsina para mídia).
- Conte o número de células e dilua a solução para 200.000 células/mL (250 μL de células contendo 50.000 células).
- Coloque filtros transwell revestidos da seção 1.2 em poços com DP.
- Diluir a solução contendo células para que existam 200.000 células/mL. Pipette 250 μL no filtro transwell, e cultura as células a 37 °C durante a noite(Figura 1F).
- No dia seguinte, substitua a mídia por 1 mL da mídia co-cultura por 1 μM uridina e 15 μM 5'-fluor-2'deoxyuridina para impedir a superproliferação de células mesenquimals que podem evitar o crescimento do neurite. Opcional: Adicione fatores de crescimento ou inibidores neste meio de comunicação se tentar mais manipulação.
- Cultura as células para pontos de tempo mais desejados. Este protocolo foi otimizado por 5 dias totais de cultura com a mídia alterada apenas no dia 2 para adicionar inibidores mitocóticos. Períodos de tempo mais longos exigirão mudanças adicionais na mídia.
3. Coleta e Processamento de Amostras
- Coloração trigeminal
- Pipette 1 mL alíquotas de 1x PBS estéreis em uma placa de 24 poços uma capa de cultura de tecido para cada filtro transwell a ser processado.
- Remova o líquido em cima do filtro ser removido com uma pipeta de 200-1.000 μL, tendo cuidado para deixar as camadas das células intactas. As células anexadas devem permanecer presas e as células não ligadas se soltarão durante esta pipetting suave. Um filtro de vácuo pode danificar a camada celular e não é recomendado para aspiração.
- Transfira o filtro para a placa 1x PBS, certificando-se de remover a camada superior de mídia como mencionado na etapa anterior.
- Coloque a placa com todos os filtros transwell e tampas em um roqueiro a 12 rpm ou 40-50 rpm em um agitador orbital por 10 min.
- Aspirar o PBS, incluindo a camada superior como descrito acima, adicione 500 μL de 1xPBS e coloque no roqueiro ou agitador orbital para uma lavagem adicional de 5-10 min.
- Aspirar o 1x PBS mais uma vez e substituir por 4% de paraformaldeído (PFA). Use pelo menos 500 μL para que toda a superfície do filtro esteja submersa. Coloque a placa em um roqueiro a 12 rpm ou agitador orbital a 40-50 rpm em temperatura ambiente por 1 h.
- Retire o PFA e enxágue as placas duas vezes por 5-10 min cada em um roqueiro com 500 μL de 1x PBS.
- Bloqueie com 10% de albumina de soro bovino (BSA) + 5% de soro de cabra/burro, dependendo do animal hospedeiro de anticorpos secundários, em 0,05% Tween-1xPBS (PBST). Use 450-500 μL de solução para que o filtro esteja submerso no líquido.
NOTA: Nesta fase, essas placas podem ser armazenadas a 4 °C por vários meses para serem processadas posteriormente. Use parafilme para selar a placa para garantir que a evaporação não ocorra e verifique regularmente a evaporação para que as superfícies do filtro permaneçam submersas. - Remova o bloco e adicione 450-500 μL de anticorpo primário em 1% BSA-PBST sem um enxaguar adicional. Incubar a 4 °C durante a noite, balançando suavemente.
- Remova a solução primária de anticorpos e enxágue com 500 μL de 1xPBST em um roqueiro, 3 vezes, à temperatura ambiente
- Remova o PBST, adicione anticorpo secundário e incubar em um roqueiro durante a noite a 4 °C envolto em papel alumínio para proteger fluoroforos da degradação da luz. Enxágüe novamente, 3 vezes, com 1x PBST em um roqueiro em temperatura ambiente. Substitua por 1x PBS.
NOTA: Neste ponto, a placa pode ser armazenada por vários meses a 4 °C se embrulhada em papel alumínio para evitar a degradação do fluorofóforo. Use parafilme para selar a placa para garantir que a evaporação não ocorra e verifique regularmente a evaporação para que as superfícies do filtro permaneçam submersas. É melhor imaginar dentro de um mês. - Para imagens ótimas, utilize neurônios do camundongo Thy1-YFP com um anticorpo anti-GFP para manchar especificamente as apararendas neuronais bem acima dos níveis de fundo. Use anti-neurofilamento 200 para manchar precisamente estruturas axonais se os camundongos Thy1-YFP não estiverem disponíveis.
- Imagem como desejado. Os filtros não precisam ser banhados e, em vez disso, podem ser colocados em cima de um deslizamento ou deslizamento para imagem com um microscópio invertido.
NOTA: As áreas do filtro não conterão estruturas aférentas. Tire várias imagens com uma profundidade de pilha z que captura todas as estruturas afantes. Use software de costura para visualizar o crescimento neurite sobre grandes áreas, ou (preferencialmente) regiões de filtro inteiros.
- Coleção de RNA, proteína e mídia
- Enquanto os filtros transwell estão processando, colete a mídia em tubos livres rnase/dnase e congele para ensaios posteriores (ELISA, proteomics, etc.).
- Imediatamente após a coleta de mídia, o buffer de lise de alíquota ou tampão de ensaio de precipitação radioimuno (RIPA) com inibidores de proteinase e fosfatase nos poços. Este protocolo foi otimizado para 100 μL/well em uma placa de 24 poços.
- Deixe os buffers para lemejar células por 5 min, em seguida, raspar cada filtro com uma nova ponta de pipeta e coletar as amostras de células em tubos rnase/dnase-free. Congele a lise para ensaios futuros (PCR semi-quantitativo e/ou quantitativo, mancha ocidental, etc.).
- Imunofluorescência opcional de células de celulose dentárias:
- Levante suavemente os coverslips da Seção 1.1 com fórceps e transfira-os para diferentes poços com 4% de PFA por 1 h com balanço.
- Aspirar pfa e enxaguar os coverslips duas vezes com 1x PBS. Acompanhe isso com permeabilização, bloqueio e imunofluorescência para marcadores de interesse com técnicas padrão de imunofluorescência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esses resultados mostram que o crescimento do neurite TG foi aumentado na presença de células PP primárias no poço subjacente em comparação com o controle da monocultura neurita TG(Figura 2A,C). Há alguma variabilidade de ensaio em crescimento neurite. Assim, uma monocultura de neurônioS TG deve ser incluída em todos os ensaios como um controle para detectar os níveis basais de crescimento neurite. As células primárias do camundongo Tgfbr2f/f foram utilizadas neste protocolo após a infecção de Ad-Cre-GFP e Ad-eGFP ser confirmada em número equivalente de células (Figura 2D). O Ad-eGFP serviu como vetor viral de controle. O Ad-Cre-GFP excluiu o gene ladeado, Tgfbr2, como demonstrado pelo PCR semi-quantitativo (Figura 2E). Nas culturas com exclusão do fator de crescimento transformando beta receptor 2 (Tgfbr2), o crescimento do neurite foi reduzido(Figura 2A-C).
Utilizamos os neurônios TG do camundongo Thy1-YFP e os manchamos com um anticorpo anti-GFP que produzia imagens muito específicas e brilhantes de estruturas axonais bem acima desse fundo, como mostrado na Figura 2. Isso permitiu a coloração específica de marcadores neuronais sem uma coloração não específica de células não neuronais utilizando métodos previamente relatados, como violetacristalina 7. Os grandes poros nos filtros podem se autofluoresce e/ou acumular anticorpos secundários e diminuir a precisão da imagem axonal (Figura 3). Enquanto os neurônios Thy1-YFP com imunofluorescência melhoram drasticamente a imagem, mais informações podem ser removidas com software de limiar automático e, em seguida, quantificadas. Também recomendamos a realização de imunofluorescência para neurofilamento 200 com base em nossos achados preliminares (não mostrados) bem como outros8,9 se os camundongos Thy1-YFP não estiverem disponíveis.
Figura 1: Um esquema da dissecção do rato para obter células para co-cultura. (A)Um diagrama de onde cortar para abrir o crânio do rato e localizar nervos TG, mostrados em preto na última representação. A tesoura indica onde inserir as pontas da tesoura para cortar ao longo das linhas pontilhadas. (B) Uma imagem combinada de darkfield e GFP mostrando os nervos TG Thy1-YFP+ circulados em branco. (C)Os gânglios TG dissecados podem então ser dispersados e cultivados, como mostrado em F. (D)A mandíbula de um rato P7, com fórceps segurando a mandíbula à esquerda e cumes ósseos alveolar contendo dentes não eclodidos em cada lado da língua. (E) Tecido DP (circulou) extraído da estrutura mineralizada (superior) e do esmalte externo (inferior) que foi removido para dispersar e placa em uma placa tratada pela cultura do tecido, como mostrado em F. As imagens não são mostradas em escala. As células DP foram dispersas e cultivadas em confluência antes de adicionar neurônios TG. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Resultados representativos da cocultura. (A-C) Os neurônios Thy1-YFP TG foram cultivados em filtros transwell com 3 μm poros no topo das células Tgfbr2f/f DP primárias. A coloração imunofluorescente foi realizada para a proteína YFP usando um anticorpo anti-GFP para fornecer uma coloração altamente específica das estruturas neuronais sobre todo o filtro. As projeções máximas de imagens de microscopia confocal de 100 μm z-stack em 10x foram coletadas e costuradas com software de costura. Os neurônios TG demonstraram significativamente mais crescimento quando co-cultivados com células DP(A)do que quando cultivados sozinhos(C). O crescimento do neurite não foi induzido quando os neurônios foram co-cultivados com células DP infectadas com Ad-Cre-GFP para derrubar Tgfbr2 (B). Barra de escala = 1.000 μm. O número equivalente de células infectadas com Ad-eGFP e Ad-Cre-GFP são mostrados(D). Barra de escala = 125 μm. PcR semi-quantitativo confirmou o Tgfbr2 KD(E). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Dificuldades técnicas apresentadas na imagem afável. (A)Imagens de brightfield de filtros transwell após coloração violeta cristalina das populações celulares. Grandes poros são prevalentes. A grande seta aponta uma célula que exibe morfologia mesenquimal, enquanto a pequena flecha aponta para uma célula de morfologia neuronal. Violeta cristalizada as duas células sem preconceitos. (B) A coloração imunofluorescente de β3 tubulina com um anticorpo secundário Alexa-488 mostrou uma coloração não específica de múltiplas células, dificultando a imagem de estruturas afórfluas. As imagens são representativas e foram repetidas em vários ensaios para otimizar a imagem mostrada na Figura 2. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Componente | Volume | Concentração | |
| MEM α | 440 mL | ||
| Soro bovino fetal inativado de calor | 50 mL | 10% | |
| L-glutamina de 100x | 5 mL | 1x | |
| Penicilina-estreptomicina 100 x | 5 mL | 1x | |
| Mudar a mídia no segundo dia com inibidores mitóticos nestas concentrações finais | |||
| Uridine | 1 μM | ||
| 5'-Fluor-2'deoxyuridina | 15 μM | ||
Tabela 1: Mídia co-cultura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As atividades diárias da cavidade oral exigem que os dentes sentem estímulos externos e inflamação interna, a fim de permitir o uso e manutenção adequados. No entanto, apenas informações limitadas estão disponíveis sobre os sinais que impulsionam os processos de desenvolvimento da interioração dentária. Este protocolo fornece um método para isolar e co-cultura células DeP primárias e neurônios TG, a fim de estudar a comunicação cruzada entre as duas populações. Várias variáveis foram otimizadas e deixam abertas mais avenidas de pesquisa, conforme descrito abaixo.
Os controles são importantes em cada passo neste ensaio. Um filtro transwell com neurônios TG sem células DP subjacentes deve ser incluído em todos os ensaios para fornecer uma linha de base para o crescimento do TG. Ao excluir um gene de interesse ladeado com uma recombinação Ad-Cre-GFP, um vírus de controle expressando apenas o marcador fluorescente deve ser usado para confirmar que o número equivalente de células foram infectados. Embora tenhamos demonstrado altos níveis de infecção com morte celular mínima em 100 e 200 MOI para Ad-eGFP e Ad-Cre-GFP, respectivamente, cada laboratório deve otimizar essa etapa. Como as proteínas fluorescentes podem ser anexadas a diferentes promotores e, portanto, causar expressão diferencial número equivalente de células infectadas, devem ser contadas células fluorescantes. A intensidade geral da fluorescência é irrelevante porque não reflete com precisão o estado da infecção. É importante demonstrar a exclusão do gene, como mostra o PCR semi-quantitativo neste protocolo (Figura 2). Embora este protocolo não tenha abordado esse tema, pesquisas anteriores demonstraram que ensaios de controle com outras linhas de células poderiam ser incluídos para demonstrar que o crescimento neurite é especificamente induzido pela cocultura com células DP8.
Como este protocolo utiliza células primárias, há várias etapas em que a contaminação pode ser introduzida. Para evitar isso, todos os reagentes devem ser filtrados estéreis. Além disso, recomenda-se que os experimentos para cada variável sejam executados em duplicatas ou triplicados para permitir a remoção de um filtro e esterilização de um poço contaminado sem falha completa do ensaio.
Os deslizamentos de cobertura devem ser revestidos com poli-D-lysine e/ou uma proteína matricial extracelular para garantir a adesão celular DP. Embora as células se conectem inicialmente, a infecção viral causa a morte por levantamento celular em deslizamentos de cobertura não revestidos e evita a manipulação genética do ensaio da co-cultura.
Está bem estabelecido que células não neuronais, como as células schwann dos gânglios TG, podem afetar a sobrevivência das células neuronais na cultura14,15,16. Neste protocolo, a sobrevivência neuronal foi otimizada adicionando 1 μM uridina e 15 μM 5-fluoro-2'deoxyuridina. Sem a adição desses agentes antimitóticos para inibir a proliferação de células Schwann, o crescimento neurite não ocorrerá. Não se sabe se a presença dessas células schwann senescentes na co-cultura altera a resposta neuronal. Isolar neurônios murina requer várias etapas adicionais, e protocolos estão disponíveis para os investigadores que desejam remover essa variável17. Em ambos os casos, a dispersão de neurônios imita um pouco uma axotomia e pode ser considerada para representar lesão/reparo18 a mais do que o desenvolvimento. Outros estudos seriam necessários para determinar as diferenças entre o crescimento axonal in vivo de fascicles versus crescimento axonal de neurônios individuais in vitro, e estes não são abordados neste protocolo.
Este protocolo leva de 1 a 3 semanas do início ao fim. Embora seja possível utilizar células DP que requerem mais de 1 semana para atingir 85-90% de confluência, recomenda-se que as células sejam semeadas em uma densidade alta o suficiente para alcançar a confluência dentro de alguns dias, uma vez que essas células se dividem muito lentamente além desse ponto. Isso geralmente requer cerca de 5-7 P5-8 ratos por fileira de uma placa de 24 poços. Esse protocolo foi otimizado para um total de 5 dias de co-cultura, momento em que a mídia com vermelho fenol começou a mudar de cor. A mídia deve ser alterada se ensaios mais longos forem desejados.
Vários ensaios de cocultura foram realizados para demonstrar crescimento neurite em resposta a fatores secretados pelo DP com placas padrão de cultura detecido revestida saqueada por ECM3,19,20, 21 ou câmaras microfluidas 8,22,23. Este protocolo oferece várias vantagens sobre esses métodos. Por exemplo, gânglios TG e co-cultura de tecido DP exigem uma relação espacial específica para os neuritas sentirem e responderem a sinais paracrinos de curto alcance. Com a cultura dos órgãos, apenas os neuritas nos gânglios mais próximos do tecido DP são capazes de responder3, enquanto os neurônios TG dispersos utilizados neste protocolo são cultivados a uma distância igual das células DP por baixo. Em segundo lugar, as culturas de órgãos podem introduzir necrose tecidual devido à falta de oxigênio e nutrientes disponíveis em grandes amostras24. A co-cultura das células dispersas remove essa possibilidade. Algumas coculturas, incluindo neurônios, exigem mídia neuronal3,22, que pode desempenhar um papel dominante na promoção do crescimento neurite. Este protocolo não adiciona fatores de crescimento específicos do neurônio, permitindo assim uma avaliação da relação direta entre sinais paracrinos das células DP subjacentes e respostas de crescimento neurite. Vale ressaltar que a mídia co-cultura também carece de componentes para promover a mineralização, como o betaglicofosfato. Isso permite que os investigadores determinem como neuritas podem segregar sinais para incentivar a mineralização. No entanto, também limita o estudo apenas incluindo células DP menos diferenciadas sem os odontoblastos mineralizantes que normalmente estariam presentes no vivo.
As respostas colorimétricas da pesquisa anterior7,8 não delineam as contribuições celulares de Schwann nem demonstram morfologia neuronal, uma vez que a violeta cristalina não especificamente mancha todas as células. A coloração imunofluorescente dos filtros pode resultar em altos níveis de fundo que dificultam a imagem afável(Figura 2). O protocolo atual permite a coloração precisa de apararentes neuronais utilizando neurônios TG Thy1-YFP e um anticorpo anti-GFP e fornece um sinal brilhante o suficiente para gerar grandes imagens de crescimento ao longo de uma figura inteira (Figura 3). É possível utilizar outros marcadores neuronais, como anti-neurofilamento 200, se os camundongos Thy1-YFP não estiverem disponíveis.
Finalmente, o uso de células DP primárias de camundongos com genes de interesse ladeados por sites loxP permite uma exclusão simples e eficiente desses genes com um sistema Ad-Cre-GFP. Em estudos futuros, o sistema de recombinase Ad-Cre poderia ser usado nos neurônios TG se eles tivessem um gene de interesse ladeado por locais loxP. Isso facilitaria estudos sobre como os sinais paracrinos da população neuronal influenciam as células DP, particularmente se as células DP forem semeadas no topo dos deslizamentos de cobertura (Seção 1.1). Estudos futuros podem utilizar outras manipulações, como a adição de inibidores farmacológicos e/ou fatores de crescimento. Também é possível modificar esse protocolo para incluir estudos de migração usando filtros transwell de 8 μm porosidade.
Em conclusão, este ensaio de co-cultura transwell utilizando neurônios e células DP permite a investigação de múltiplos parâmetros celulares. Isso possibilita ampliar o corpo de conhecimento sobre as interações mesenquicada-neuronal que promovem e apoiam a inervação dentária.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por a) os Institutos Nacionais de Saúde/NIAMS (números de subvenção R01 AR062507 e R01 AR053860 para RS), b) bolsa da Universidade do Alabama no Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) para sBP do Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial/Instituto Nacional de Saúde, c) um Centro Global de Transtornos Craniofaciais, Bucais e Dentários (GC-CODED) Bolsa piloto e viabilidade ao SBP e d) do Instituto Nacional de Odontologia e Craniofacial Pesquisa/Institutos Nacionais de Saúde K99 DE024406 bolsa ao SBP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
