치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법
Summary
우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.
Abstract
치아 의 식구는 치아가 압력, 온도 및 염증을 감지 할 수 있게하며, 이 모든 것이 치아 기관의 사용 및 유지 보수에 중요합니다. 감각 적인 내면없이, 매일 구강 활동은 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 것입니다. 그 중요성에도 불구하고 치아 발달 및 유지 보수에서 의한 내면화의 역할은 크게 간과되었습니다. 여러 연구는 DP 세포가 치아 안팎으로 TG 축을 유치하고 안내하기 위해 세포외 매트릭스 단백질과 파라크린 신호를 분비한다는 것을 입증했습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 DP mesenchyme와 신경 구심질 사이 크로스토크에 상세한 통찰력을 제공했습니다. 지식의 이 격차를 해결하기 위하여는, 연구원은 이 상호 작용을 조사하기 위하여 공동 문화 및 다양한 기술을 이용하기 시작했습니다. 여기에서, 우리는 기공을 통해 축산 성장을 허용하기 위하여 큰 직경 기공을 가진 오버리 트랜스웰 필터에 분산된 TG 뉴런을 가진 1 차적인 DP 세포를 공동 배양에서 관련시킨 다중 단계를 보여줍니다. loxP 부위에 의해 측면에 있는 관심 있는 유전자를 가진 1차 DP 세포는 아데노바이러스-Cre-GFP 재조합아제 시스템을 사용하여 유전자 결실을 용이하게 하기 위해 활용되었다. Thy1-YFP 마우스에서 TG 뉴런을 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의한 배경 수준 보다 훨씬 높은 표정으로 정밀한 구심성 이미징을 허용했습니다. DP 반응은 단백질 또는 RNA 수집 및 분석을 통해 조사될 수 있고, 또는 탈착식 유리 커버슬립에 도금된 DP 세포의 면역형광 염색을 통해 조사될 수 있다. 미디어는 프로테오믹 분석과 같은 기술을 사용하여 분석할 수 있지만, 미디어에 태아 소 혈청의 존재로 인해 알부민 고갈이 필요합니다. 이 프로토콜은 공동 배양 분석의 조절된 환경에 반응하여 TG 뉴런 및 DP 세포의 형태학적, 유전적, 및 세포골격 반응을 연구하기 위해 조작될 수 있는 간단한 방법을 제공한다.
Introduction
치아 의 식구는 치아가 압력, 온도 및 염증을 감지 할 수 있게하며, 이 모든 것이 치아 기관의 사용 및 유지 보수에 중요합니다. 치과 충치및 외상과 관련되었던 치아 고통을 감지하지 못하면 질병 진행으로 이끌어 냅니다. 따라서 적절한 내면화는 정상적인 치아 성장, 기능 및 관리를위한 요구 사항입니다.
대부분의 장기는 출생 시부터 완벽하게 기능하고 자극되지만, 치아 발달은 출생 후1,2단계에서 치아 내피와 미네랄화가 동시에 발생하는 성인 생활로 확장됩니다. 흥미롭게도, 치과 펄프 (DP) mesenchyme는 처음에 개발 치아 기관으로 축삭 진입을 방지하기 위해 배아 발생 동안 발충제 신호를 분비, 이는 나중에 치아가분화에가까워짐에 따라 유치인자의 분비로 이동3,4. 출생 후 단계 동안, 삼차 (TG) 신경에서 구심성 축축은 상아질 침착이 시작되는 시간 의 주위에 치아에 침투합니다 (Pagella에서 검토, P.외. 5). 몇몇 생체 내 연구는 뉴런 -mesenchymal 상호 작용이 마우스에서 치아 내심을 안내한다는 것을 입증했다 (Luukko에서 검토, K. 외6),그러나 분자 메커니즘의 몇 가지 세부 사항을 사용할 수 있습니다.
세포 공동 배양은 조사자가 신경과 중간 엽 인구 사이 상호 작용을 조작할 수 있는 통제된 환경을 제공합니다. 공동 배양 실험을 통해 치아 내심 및 발달을 유도하는 신호 경로에 대해 더 깊이 파고들 수 있습니다. 그러나, 공동 배양에서 세포를 연구하기 위하여 이용된 몇몇 전통적인 방법은 기술적인 도전을 제출합니다. 예를 들어, 뉴라이트 의 크리스탈 바이올렛 염색은 TG 번들 분산에 포함된 비특이적 슈완 세포를 비특이적으로 염색할 수 있으며, 상대적으로 작은 반응으로 색 강도가 피크일 수 있다7. 미세 유체 챔버는 매력적인 옵션을 제공하지만 트랜스웰 필터8,9보다 상당히 비싸고 DP 분비에 대한 신경 반응의 조사만 허용합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 허용하는 프로토콜을 개발했습니다: a) DP 분비에 대한 응답으로 TG 뉴라이트 의 정확한 염색 및 이미징, b) DP 세포 및/또는 TG 뉴런의 유전자 변형은 특정 신호 전달 경로를 조사하고, c) TG 뉴런에 의해 분비되는 요인에 대한 DP 세포 반응의 조사. 이 프로토콜은 시험관 내 공동 배양 분석법의 조절된 환경에서 치아 내피의 여러 특징을 정밀하게 조사하는 기능을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
구강의 일상 적인 활동은 치아가 적절한 사용과 유지 보수를 허용하기 위해 외부 자극과 내부 염증을 감지해야합니다. 그러나 치아 내막의 발달 과정을 이끄는 신호와 관련하여 제한된 정보만 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 집단 간의 교차 통신을 연구하기 위해 1차 DP 세포 및 TG 뉴런을 분리하고 공동 배양하는 방법을 제공한다. 몇 가지 변수가 최적화되었고 아래에 설명된 대로 연구의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 a) 국립 보건 원 (보조금 번호 R01 AR062507 및 R01 AR053860 에 RS), b) 버밍엄 치과 학술 연구 교육 (DART) 보조금 (번호 T90DE022736 (PI 맥두걸)) 국립 치과 연구소에서 SBP에 알라바마 대학 c) UAB 글로벌 두개안면, 구강 및 치과 장애 센터(GC-CODED) SBP 및 d에 대한 파일럿 및 타당성 보조금) 국립 치과 및 두개안면 연구소 연구/국립 보건원 K99 DE024406 SBP 에 대한 보조금.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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