Summary

Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Published: February 14, 2020
doi:

Summary

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

Abstract

L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Sans innervation sensorielle, les activités orales quotidiennes causeraient des dommages irréparables. Malgré son importance, les rôles de l’innervation dans le développement et l’entretien des dents ont été largement négligés. Plusieurs études ont démontré que les cellules DP sécrètent des protéines de matrice extracellulaire et des signaux paracrines pour attirer et guider les axones TG dans et tout au long de la dent. Cependant, peu d’études ont fourni un aperçu détaillé dans le crosstalk entre le mesenchyme DeP et les afferents neuronaux. Pour combler cette lacune dans les connaissances, les chercheurs ont commencé à utiliser des co-cultures et une variété de techniques pour étudier ces interactions. Ici, nous démontrons les étapes multiples impliquées dans la co-culture des cellules primaires de DP avec des neurones de TG dispersés sur un filtre de transwell sus-lying avec des pores de grand diamètre pour permettre la croissance axonale par les pores. Des cellules primaires de DP avec le gène d’intérêt flanqué des emplacements de loxP ont été employées pour faciliter la suppression de gène utilisant un système de recombinase d’Adenovirus-Cre-GFP. L’utilisation des neurones TG de la souris Thy1-YFP a permis une imagerie afferente précise, avec une expression bien au-dessus des niveaux de fond par microscopie confocale. Les réponses dP peuvent être étudiées par la collecte et l’analyse de protéine ou d’ARN, ou alternativement, par la coloration immunofluorescente des cellules de DP plaquées sur des couvertures en verre amovibles. Les médias peuvent être analysés à l’aide de techniques telles que les analyses protéomiques, bien que cela nécessitera l’épuisement de l’albumine en raison de la présence de sérum bovin fœtal dans les médias. Ce protocole fournit une méthode simple qui peut être manipulée pour étudier les réponses morphologiques, génétiques et cytosquelettiques des neurones TG et des cellules DP en réponse à l’environnement contrôlé d’un test de co-culture.

Introduction

L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Le fait de ne pas sentir la douleur dentaire associée aux caries dentaires et aux traumatismes entraîne une progression de la maladie. Ainsi, l’innervation appropriée est une exigence pour la croissance normale de dent, la fonction et les soins.

Alors que la plupart des organes sont entièrement fonctionnels et innervés au moment de la naissance, le développement des dents s’étend à la vie adulte, avec l’innervation des dents et la minéralisation se produisant de concert pendant les étapes postnatales1,2. Fait intéressant, la pulpe dentaire (DP) mesenchyme sécrète d’abord des signaux répulsifs au cours de l’embryogenèse pour empêcher l’entrée d’axone dans l’organe dentaire en développement, qui se déplace plus tard à la sécrétion de facteurs attractants que la dent se rapproche éruption3,4. Pendant les stades postnatals, les axones afférents du nerf trigéminal (TG) pénètrent dans et tout au long de la dent autour du dépôt de dentin de temps commence (examiné dans Pagella, P. et autres5). Plusieurs études in vivo ont démontré que les interactions neuronales-mesenchymal guident l’innervationdes dents chez la souris (revue dans Luukko, K. et al.6 ), mais peu de détails des mécanismes moléculaires sont disponibles.

Les cocultures cellulaires fournissent des environnements contrôlés dans lesquels les chercheurs peuvent manipuler les interactions entre les populations neuronales et mésenchymales. Les expériences de co-culture permettent d’approfondir les voies de signalisation guidant l’intérivation et le développement des dents. Cependant, plusieurs des méthodes conventionnelles utilisées pour étudier les cellules en co-culture présentent des défis techniques. Par exemple, la coloration violette de cristal de la croissance de neurite peut non-spécifiquement tacher des cellules de Schwann incluses dans des dispersions de faisceau de TG, et il peut y avoir des crêtes dans l’intensité de couleur avec des réponses relativement petites7. Les chambres microfluidiques offrent une option attrayante, mais sont considérablement plus chères que les filtres transwell8,9 et ne permettent que l’étude des réponses neuronales aux sécrétions DP. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé un protocole qui permet : a) la coloration précise et l’imagerie de la croissance de neurite de TG en réponse aux sécrétions de DP, b) la modification génétique des cellules dP et/ou des neurones de TG pour étudier des voies de signalisation spécifiques, et c) l’étude des réponses de cellules de DP aux facteurs sécrétés par des neurones de TG. Ce protocole fournit la capacité d’étudier précisément plusieurs caractéristiques de l’innervation des dents dans l’environnement contrôlé d’un résultat de co-culture in vitro.

   

Protocol

Toutes les expériences sur des souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UAB. 1. Préparation des plaques REMARQUE : Les fiches de couverture peuvent être utilisées pour imager les cellules DP à la fin de l’analyse. Assurez-vous que le couvercle de la plaque est allumé pendant toutes les étapes d’incubation et de rinçant à l’extérieur du capuchon de culture de tissu stérile pour em…

Representative Results

Ces résultats montrent que la croissance de neurite de TG a été augmentée en présence des cellules primaires de DP dans le puits sous-jacent comparé au contrôle de la monoculture de neurite de TG (figure 2A,C). Il y a une certaine variabilité d’assay-to-assay dans la croissance neurite. Ainsi, une monoculture de neurones TG devrait être incluse dans toutes les analyses comme un contrôle pour détecter les niveaux basaux de la croissance neurite. Des cellules prim…

Discussion

Les activités quotidiennes de la cavité buccale exigent que les dents sentent des stimuli externes et une inflammation interne afin de permettre une utilisation et un entretien appropriés. Cependant, seulement peu d’information est disponible concernant les signaux qui conduisent les processus développementaux de l’innervation de dent. Ce protocole fournit une méthode pour isoler et co-culture des cellules primaires DP et des neurones TG afin d’étudier la communication croisée entre les deux populations. Plu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par a) la subvention des National Institutes of Health/NIAMS (numéros de subvention R01 AR062507 et R01 AR053860 à RS), b) la subvention de l’Université de l’Alabama à Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (numéro T90DE022736 (PI MacDougall)) au SBP du National Institute of Dental and Craniofacial Research/National Institutes of Health, c) une subvention pilote et de faisabilité du UAB Global Center for Craniofacial, Oral and Dental Disorders (GC-CODED) à SBP et d) le National Institute of Dental and Craniofacial Subvention K99 DE024406 de Recherche/National Institutes of Health à SBP.

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2
24 Well Cell Culture Plate Corning 3524 Co-culture plate
Alexa-546 anti-chicken Invitrogen A-11040 Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution
Anti-GFP Antibody Aves Lab, Inc GFP-1010 Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution
Anti-Neurofilament 200 antibody Sigma-Aldrich NO142 Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available
B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J The Jackson Laboratory 12603 Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J The Jackson Laboratory 3709 Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons
Collagenase Type II Millipore 234155-100MG Used to disperse trigeminal neurons
Fetal Bovine Serum Gibco 10437 Additive to co-culture media
Fine forceps Fine Science Tools 11413-11 Fine forceps for TG dissection
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml
Lysis Buffer (Buffer RLT) Qiagen 79216 Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture
L-Glutamine Gibco 25030081 Additive to co-culture media
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146-1EA Dissection scissors to open skull
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-545-81 Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing
Minimal Essential Medium a Gibco 12571063 Co-culture media base
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063 Antibiotic additive to co-culture media
Phosphatase Inhibitor Sigma-Aldrich 04 906 837 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
Polybrene Millipore TR-1003-G Used to aid in dental pulp cell transfection
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P7280 Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion
Protease Inhibitors Millipore 05 892 791 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
RNAse/DNAse free eppendorf tubes Denville C-2172 Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay
ThinCert Cell Culture Insert Greiner Bio-One 662631 Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Used fto disperse dental pulp cells
Trypsin Type II Sigma-Aldrich T-7409 Used to disperse trigeminal neurons
Ultra Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40 Ultra fine forceps for dissection
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2
Vacuum Filtration System Millipore SCNY00060 Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter
Vial forceps Fine Science Tools 110006-15 Long forceps for tissue transfer to conicals

References

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Cite This Article
Barkley, C., Serra, R., Peters, S. B. A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals. J. Vis. Exp. (156), e60809, doi:10.3791/60809 (2020).

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