Summary

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Published: February 14, 2020
doi:

Summary

Descriviamo l’isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l’immunofluorescenza o l’analisi RNA/proteina. L’immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l’analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Abstract

L’innervazione dentale consente ai denti di rilevare pressione, temperatura e infiammazione, che sono tutti cruciali per l’uso e il mantenimento dell’organo dentale. Senza l’innervazione sensoriale, le attività orali quotidiane causerebbero danni irreparabili. Nonostante la sua importanza, i ruoli di innervazione nello sviluppo e nella manutenzione dei denti sono stati in gran parte trascurati. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule DP secernono proteine della matrice extracellulare e segnali paracrini per attirare e guidare gli assoni TG dentro e in tutto il dente. Tuttavia, pochi studi hanno fornito informazioni dettagliate sul crosstalk tra il DP mesenchyme e afferenti neuronali. Per colmare questa lacuna nella conoscenza, i ricercatori hanno iniziato a utilizzare le co-culture e una varietà di tecniche per studiare queste interazioni. Qui, dimostriamo i molteplici passaggi coinvolti nella co-cultura delle cellule DP primarie con neuroni TG dispersi su un filtro transwell sovrastante con pori di grande diametro per consentire la crescita assonale attraverso i pori. Le cellule DP primarie con il gene di interesse affiancato da siti loxP sono state utilizzate per facilitare la delezione genica utilizzando un sistema ricombinase Adenovirus-Cre-GFP. L’utilizzo di neuroni TG del topo Thy1-YFP ha permesso una precisa imaging afferente, con espressione ben al di sopra dei livelli di fondo mediante microscopia confocale. Le risposte del DP possono essere studiate attraverso la raccolta e l’analisi di proteine o RNA, o in alternativa, attraverso la colorazione immunofluorescente delle cellule DP placcate su coperture in vetro rimovibile. I media possono essere analizzati utilizzando tecniche come le analisi proteomiche, anche se ciò richiederà l’esaurimento dell’album a causa della presenza di siero bovino fetale nei media. Questo protocollo fornisce un metodo semplice che può essere manipolato per studiare le risposte morfologiche, genetiche e citoscheletriche dei neuroni TG e delle cellule DP in risposta all’ambiente controllato di un saggio di co-cultura.

Introduction

L’innervazione dentale consente ai denti di rilevare pressione, temperatura e infiammazione, che sono tutti cruciali per l’uso e il mantenimento dell’organo dentale. Il mancato rilevamento del dolore dentale associato alla carie dentale e al trauma porta alla progressione della malattia. Pertanto, una corretta innervazione è un requisito per la normale crescita, funzione e cura dei denti.

Mentre la maggior parte degli organi sono completamente funzionali e innervati dal momento della nascita, lo sviluppo dei denti si estende nella vita adulta, con l’innervazione dei denti e la mineralizzazione che si verificano in concerto durante le fasi postnatali1,2. È interessante notare che la polpa dentale (DP) mesenchyme inizialmente secerne segnali repellenti durante l’embriogenesi per impedire l’ingresso dell’assone nell’organo dentale in via di sviluppo, che successivamente si sposta alla secrezione di fattori attrattivi come il dente si avvicina all’eruzione3,4. Durante le fasi postnatali, gli assoni afferenti del nervo trigeminale (TG) penetrano dentro e in tutto il dente intorno al momento in cui inizia la deposizione della dentina (rivisto a Pagella, P. et al.5). Diversi studi in vivo hanno dimostrato che le interazioni neuronale-mesenchymal guidano l’innervazione dentale nei topi (rivisti a Luukko, K. et al.6),ma sono disponibili pochi dettagli dei meccanismi molecolari.

Le co-culture cellulari forniscono ambienti controllati in cui gli investigatori possono manipolare le interazioni tra popolazioni neuronali e mesenchimale. Gli esperimenti di co-cultura consentono di approfondire i percorsi di segnalazione che guidano l’innervazione e lo sviluppo dei denti. Tuttavia, molti dei metodi convenzionali utilizzati per studiare le cellule in co-cultura presentano sfide tecniche. Per esempio, la colorazione viola cristallina della crescita di neurite può non macchiare specificamente le cellule di Schwann incluse nelle dispersioni dei pacchetti TG, e ci possono essere picchi di intensità del colore con risposte relativamente piccole7. Le camere microfluidiche offrono un’opzione interessante, ma sono considerevolmente più costose dei filtri transwell8,9 e consentono solo lo studio delle risposte neuronali alle secrezioni DP. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente: a) precisa colorazione e imaging della crescita di TG neurite in risposta alle secrezioni DP, b) modificazione genetica delle cellule DP e/o neuroni TG per studiare percorsi di segnalazione specifici, e c) indagine delle risposte delle cellule DP a fattori secreti dai neuroni TG. Questo protocollo offre la possibilità di studiare con precisione diverse caratteristiche dell’innervazione dei denti nell’ambiente controllato di un saggio di co-cultura in vitro.

   

Protocol

Tutti gli esperimenti con i topi sono stati approvati dall’UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Preparazione piastra NOTA: i coverlips possono essere utilizzati per l’immagine di celle DP alla fine del saggio. Assicurarsi che il coperchio della piastra sia acceso durante tutte le fasi di incubazione e risciacquo al di fuori del cofano di coltura dei tessuti sterili per evitare la contaminazione durante la lavorazione del campione. <…

Representative Results

Questi risultati mostrano che l’escrescenza di TG neurite è stata aumentata in presenza di cellule primarie DP nel pozzo sottostante rispetto al controllo della monocoltura neurite TG (Figura 2A,C). C’è una certa variabilità saggio-saggio-saggio nella escrescenza neurite. Pertanto, una monocoltura neuronale TG dovrebbe essere inclusa in tutti i saggi come un controllo per rilevare i livelli basali di escrescenza neurite. Le cellule primarie del mouse Tgfbr2f/f …

Discussion

Le attività quotidiane della cavità orale richiedono che i denti percepiscano stimoli esterni e infiammazione interna al fine di consentire un corretto utilizzo e manutenzione. Tuttavia, sono disponibili solo informazioni limitate per quanto riguarda i segnali che guidano i processi di sviluppo dell’innervazione dei denti. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare e co-cultura cellule primarie DP e neuroni TG al fine di studiare la comunicazione incrociata tra le due popolazioni. Diverse variabili sono state ott…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da a) il National Institutes of Health/NIAMS (numeri di sovvenzione R01 AR062507 e R01 AR053860 a RS), b) l’Università dell’Alabama presso Birmingham Dental Academic Research Training (DART) grant (numero T90DE022736 (PI MacDougall)) a SBP dal National Institute of Dental and Craniofacial/National Research Institutes of Health, c) un Centro globale UAB per i disturbi craniofacciali, orali e odontoiatrici (GC-CODED) Pilota e facilità di fattibilità a SBP e d) l’Istituto Nazionale di Odontoiatria e Craniofacial Ricerca/ Istituti nazionali di salute K99 DE024406 sovvenzione a SBP.

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2
24 Well Cell Culture Plate Corning 3524 Co-culture plate
Alexa-546 anti-chicken Invitrogen A-11040 Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution
Anti-GFP Antibody Aves Lab, Inc GFP-1010 Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution
Anti-Neurofilament 200 antibody Sigma-Aldrich NO142 Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available
B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J The Jackson Laboratory 12603 Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J The Jackson Laboratory 3709 Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons
Collagenase Type II Millipore 234155-100MG Used to disperse trigeminal neurons
Fetal Bovine Serum Gibco 10437 Additive to co-culture media
Fine forceps Fine Science Tools 11413-11 Fine forceps for TG dissection
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml
Lysis Buffer (Buffer RLT) Qiagen 79216 Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture
L-Glutamine Gibco 25030081 Additive to co-culture media
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146-1EA Dissection scissors to open skull
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-545-81 Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing
Minimal Essential Medium a Gibco 12571063 Co-culture media base
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063 Antibiotic additive to co-culture media
Phosphatase Inhibitor Sigma-Aldrich 04 906 837 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
Polybrene Millipore TR-1003-G Used to aid in dental pulp cell transfection
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P7280 Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion
Protease Inhibitors Millipore 05 892 791 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
RNAse/DNAse free eppendorf tubes Denville C-2172 Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay
ThinCert Cell Culture Insert Greiner Bio-One 662631 Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Used fto disperse dental pulp cells
Trypsin Type II Sigma-Aldrich T-7409 Used to disperse trigeminal neurons
Ultra Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40 Ultra fine forceps for dissection
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2
Vacuum Filtration System Millipore SCNY00060 Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter
Vial forceps Fine Science Tools 110006-15 Long forceps for tissue transfer to conicals

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Cite This Article
Barkley, C., Serra, R., Peters, S. B. A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals. J. Vis. Exp. (156), e60809, doi:10.3791/60809 (2020).

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