Summary
I denne artikkelen beskriver vi i detalj en protokoll for generering av nevrosfærekulturer fra postnatal mus nevrale stamceller avledet fra hovedmusen nevrogene nisjer. Nevrosfærer brukes til å identifisere nevrale stamceller fra hjernevev som tillater estimering av forløpercelletall. Videre kan disse 3D-strukturene være belagt i differensierende forhold, noe som gir opphav til nevroner, oligodendrocytes og astrocytter, slik at studiet av celleskjebne.
Abstract
Nevrosfæreanalysen er en svært nyttig in vitro-teknikk for å studere de iboende egenskapene til nevrale stamceller /stamceller (NSPCer) inkludert spredning, selvfornyelse og multipotens. I den postnatale og voksne hjernen er NSPCer hovedsakelig tilstede i to nevrogene nisjer: subventrikulær sone (SVZ) som fôrer de laterale ventriklene og den subgranulære sonen til hippocampal dentate gyrus (DG). Isoleringen av de nevrogene nisjene fra postnatal hjerne gjør det mulig å oppnå en høyere mengde NSPCer i kultur med en påfølgende fordel av høyere avkastning. Den nære kontakten mellom celler i hver nevrosfære skaper et mikromiljø som kan ligne nevrogene nisjer. Her beskriver vi, i detalj, hvordan å generere SVZ- og DG-avledede nevrosfærekulturer fra 1-3-dagers gamle (P1-3) mus, samt passaging, for neurosphere ekspansjon. Dette er en fordelaktig tilnærming siden nevrosfæreanalysen tillater en rask generasjon NSPC-kloner (6-12 dager) og bidrar til en betydelig reduksjon i antall dyrebruk. Ved plating av nevrosfærer i differensierende tilstander, kan vi få et pseudomonolayer av celler som består av NSPCer og differensierte celler av forskjellige nevrale slekter (nevroner, astrocytter og oligodendrocytes) slik at studien av handlingene til iboende eller extrinsic faktorer på NSPC proliferasjon, differensiering, celleoverlevelse og neuritogenesis.
Introduction
Neurosphere analysen (NSA) ble først beskrevet i 19921,2 og fortsatt er et unikt og kraftig verktøy i neural stamcelle (NSC) forskning. Isoleringen av NSCer fra de viktigste nevrogene regionene har utfordrende problemer fordi kravene til å opprettholde disse cellene i fysiologiske forhold forblir dårlig forstått. I NSA, celler er kultivert i et kjemisk definert serum-fritt medium med tilstedeværelse av vekstfaktorer inkludert epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF)1,2,3. Neural forløper celler (stamceller og stamfarer) er valgt ved hjelp av disse mitogener siden disse cellene er EGF og FGF-responsive inn en periode med aktiv spredning mens andre celler, nemlig differensierte celler, dø4. Nevrale forløperceller vokser som nevrosfærer, som deretter kan gå stilutfor for å utvide bassenget av disse cellene5. Viktigere, siden disse nevrale stamceller (NSPCer) er multipotente de er i stand til å skille seg inn i de tre store celletyper av sentralnervesystemet (CNS): nevroner, oligodendrocytes og astrocytter5.
NSA gir en fornybar kilde til udifferensierte CNS-forløpere, som kan brukes til å studere flere prosesser, inkludert NSC-spredning og selvfornyelse, og nevronal og glial differensiering, i både fysiologisk og sykdomssammenheng. Videre kan in vitro studier brukes til å evaluere graden av egenspesifikasjon som finnes i nevrale forløpere under utvikling, samt å studere det fulle potensialet til cellene, ved å fjerne extrinsic signaler forbundet med deres normale miljø6. Nevrosfæremodellen er verdifull for å evaluere antatte regulatorer siden ved å opprettholde cellene i et medium blottet for serum, er miljøsignaler bare gitt av de omkringliggende cellene6. Videre, i NSA, NSPCs er lett utvidet i kultur, tettheten av celler per område er høy og heterogene sammensetningen av nevrosfærene har noen likhet med in vivo nisjer6. Disse veletablerte fordelene er grunnen til at denne metodikken har blitt mye brukt av mange forskere.
Følgende protokoll beskriver i detalj alle prosessene fra isolasjon av postnatal NSPC-populasjon fra de to viktigste nevrogene regionene, subventrikulær sone (SVZ) og hippocampal dentate gyrus (DG), til utvidelse av disse cellene som nevrosfærer, samt differensiering i nevroner, astrocytter og oligodendrocytes. Til slutt er ulike analyser også beskrevet for å få tilgang til stilkog multipotensegenskaper av SVZ- og DG-avledede NSPCer.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Det europeiske fellesskap (86/609/EØF; 2010/63/EU; 2012/707/EU) og portugisisk (DL 113/2013) lovgivning for beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Protokollen ble godkjent av "iMm institusjonelle Animal Welfare Body - ORBEA-iMM og national kompetent myndighet - DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária)."
1. Grunnleggende oppsett og utarbeidelse av kulturmedium
- På disseksjonsdagen forbereder du riktig mengde vekstmedium som tilsvarer serumfritt medium (SFM) som består av Dulbeccos modifiserte ørnemedium [(DMEM)/F12 med L-glutamin] (Table of Materials) supplert med 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (penn/strepreptomycin), 1 % B27, med også 10 ng/ml EGF og 5 ng/ml bFGF. Varm kulturmediet til 37 °C i et vannbad.
MERK: Volumet av vekstmedium avhenger av antall valper, for 5 valper forberede ~ 100 ml (50 ml for SVZ og 50 ml for DG); Men etter å ha talt antall celler (trinn 5.1) må det nøyaktige volumet justeres. - For mikrodisseksjon av SVZ og DG, klargjør kalsium- og magnesiumfri Hanks' balanserte saltvannsløsning (HBSS) disseksjonsmedium supplert med 100 U/ml penn/strep.
MERK: Forbered 50–100 ml disseksjonsmedium. - Sett opp et disseksjonsmikroskop og klargjør verktøyene som trengs for å fjerne hjernen (saks og liten slikkepott) og for SVZ og DG mikrodissections (Dumont liten saks, #7 tang, #5 tang, #5S tang) ved å bløtlegge i 70% etanol.
2. Høsting av postnatal (P1−3) musehjerner og SVZ/DG mikrodisseksjoner
- Forbered 60 mm Petri-retter (vekstområde 21 cm2) med HBSS supplert med penn/strep og 2 prøverør (ett for SVZ og én for DG) med 500 μL supplert HBSS hver.
- Euthanize mus valper (P1-3) i henhold til protokollen godkjent av Institutional Animal Care anlegget / retningslinjer. Utfør halshugging med et enkelt snitt med skarp saks ved foten av hjernestammen.
- Hold ventraldelen av kroppen ved foten av hodet og bruk av liten spiss saks, lag et midtlinjesnitt i huden over hele lengden av hodet, og dermed avsløre overflaten av skallen.
- Lag et langsgående snitt ved foten av skallen og fortsett å kutte langs den sagittal suturen ved hjelp av liten saks med en vinkel grunne som mulig for å unngå å skade hjernestrukturene.
- Skrell skallen til sidene ved hjelp av buede tang og utsett hjernen.
FORSIKTIG: Kontroller at dissekeringsinstrumentene er fri for etanol før du berører hjernen. - Isoler hjernen fra skallen ved hjelp av en liten slikkepott, ved å skyve under bunnen av hjernen for å kutte kraniale nerver og blodkar som er koblet til bunnen av hjernen, og overføre hjernen til en Petri-skål som inneholder kaldsupplert HBSS-løsning.
- Plasser Petri-skålen som inneholder hjernen under et dissekerende mikroskop ved lav forstørrelse og plasser hjernen på den sorsaloverflaten.
- Ved hjelp av fine tang, fjern meninges fra ventralsiden av hjernen og olfaktoriske pærer, mens du holder hjernen på plass ved lillehjernen. Roter hjernen på ventralaspektet og skrell av resten av meningene.
MERK: Fjerning av dorsal meninges er et avgjørende skritt for å sikre riktig hjernekutting. - Kast lillehjernen som gjør et kutt ved hjelp av tang. Plasser et filterpapir med en porestørrelse på 11 μm på et vevshakker (Table of Materials) og sett hjernen på filterpapiret ved hjelp av buede spisse tang. Hakk hjernen i 450 μm koronale seksjoner og bruk en våt lamina for å samle den seksjonerte hjernen i en ny Petri-skål fylt med kaldsupplert HBSS.
- For å dissekere ut SVZ, bruk tang til å skille koronale skiver i en fremre-til-bakre måte til å nå skiver med laterale ventrikler, under et dissekerende mikroskop.
- Klipp det tynne laget av vev rundt den laterale veggen av ventriklene (som tilsvarer SVZ) med fine tang, unntatt striatal parenchyma og corpus callosum. Isoler SVZ ved å plassere spissen av tang i de laterale hjørnene av lateral ventrikkel: en umiddelbart under corpus callosum og den andre i vevet umiddelbart ved siden av ventralområdet i den laterale ventrikkelen. Deretter kutter du en liten tråd av vev rundt den laterale ventrikkelen.
- Samle det dissekerte vevet i et prøverør med supplert HBSS-løsning som tidligere ble identifisert som SVZ.
MERK: Utelat SVZ i skiver der både de laterale ventriklene og hippocampalformasjonen begynner å vises. - Gå gjennom alle skiver etter SVZ mikrodisseksjon i en fremre-til-bakre måte og nå hippocampal formasjonen. Ved hjelp av tang kaste den første skive med hippocampus der DG er fortsatt ugjenkjennelig.
- For å fjerne DG, først isolere hippocampus fra skiver. Fokuser mikroskopet på nytt for å visualisere grensene rundt DG.
- Dissekere DG-delen ved å utføre et kutt mellom DG- og CA1-regionen etterfulgt av et vertikalt kutt mellom DG- og CA3-regionen ved hjelp av tang. Fjern fimbria og tilstøtende vev.
MERK: Hos P1-3 dyr er DG nesten umulig å skille fra Ammons horn, men viser et lite tips. - Samle det dissekerte vevet i et prøverør som inneholder supplerede HBSS-løsninger som tidligere ble identifisert som DG.
MERK: Total skade på hippocampus eller området rundt vil gjøre det vanskeligere å isolere DG. Ved hjelp av et atlas av postnatal mus hjernen er viktig når brukeren ikke er kjent med isolering av SVZ og DG vev fra koronale seksjoner.
3. Vevdissosiasjon
- For å dissosiere SVZ- og DG-vevet som er tilstede i sine respektive rør, legg til trypsin-EDTA 0,05 % for å ha en endelig konsentrasjon på 5–10 % av Trypsin-EDTA 0,05 % i HBSS. Inkuber i ca. 15 min ved 37 °C, til vevet er klumpet sammen.
- Vask vevet fra trypsinved å fjerne media og legge til 1 ml ny HBSS supplert løsning i 4 påfølgende tider.
- Fjern HBSS og resuspender det fordøyde vevet i 1 ml SFM supplert med 10 ng/ml EGF og 5 ng/ml bFGF. Mekanisk dissosiere pelleten ved forsiktig pipettering opp og ned ca 7-10x ved hjelp av en P1000 pipette, til du får en homogen celleoppløsning.
FORSIKTIG: Overdreven mekanisk dissosiasjon kan føre til økt celledød og vil påvirke etterfølgende cellevekst negativt.
4. Cell-pair analyse for å studere celle skjebne
- Før eksperimentet, forberede belagt 24-brønn plater for tilhenger monolayer kulturer i henhold til seksjoner 8-10.
- Hvis du vil telle antall SVZ- eller DG-celler (innhentet i avsnitt 3) som skal platers, bruker du en løsning som inneholder 0,2 % Trypan blå og teller cellene ved hjelp av et hematocytometer.
- Fortynn dissosiert celle suspensjon i SFM supplert med 5 ng /ml EGF og 2,5 ng/mL bFGF (lav EGF/bFGF) med en tetthet på 11,300 celler/cm2 og plate dem på belagt glass coverslips.
- Etter 24 timer, fest cellene for immuncytokjemi mot NSC markører som sex bestemmende region Y-boks 2 (Sox2) og nestin samt med en markør for neuronal avstamning (nemlig doublecortin [DCX], for umodne nevroner) (se avsnitt 14).
MERK: Sox2 er en markør for NSCer som gjennomgår mitose. Sox2+/+ cellepar som følge av en enkelt stamcelledeling gjenspeiler stamcelleutvidelse7.
5. Utvidelse av postnatale nevrale stamceller som nevrosfærer
- For å bestemme tettheten av den dissosierte SVZ- eller DG-cellesuspensjonen (innhentet i avsnitt 3), tell cellene ved hjelp av et hematocytometer.
- Fortynn SVZ og DG encellede suspensjon med en tetthet på 2 x 104 celler / ml i SFM supplert med 10 ng / ml EGF og 5 ng / ml bFGF. Frø SVZ og DG celler i ubestrøket 60 mm Petri retter med et siste volum på 5 ml / Petri parabolen.
- Inkuber SVZ- og DG-celler i henholdsvis 6–8 dager og 10–12 dager for å danne primære nevrosfærer ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: Inkubasjonsdager mer enn de som er nevnt kan fremme aggregering av nevrosfærer og høyere nivåer av celledød i midten av nevrosfæren. - Når flertallet av nevrosfærer har en diameter på 150-200 μm, utfør nevrosfærepassasjen.
MERK: Passering av nevrosfærer når de ikke har en passende diameter, kompromitterer alle de neste trinnene.
6. Passering av nevrosfærer
MERK: Følgende protokoll kan brukes til å utvide både SVZ og DG-nevrosfærer.
- For å passere nevrosfærer, samle SFM med vekstfaktorer som inneholder nevrosfærer fra 60 mm Petri parabolen (e) og sentrifuge i 5 min ved 300 x g.
- Kast supernatanten og resuspend er nevrosfærepelleten ved hjelp av et kjemisk dissosiasjonssett (mus) i henhold til produsentens instruksjoner (Materialtabell).
MERK: Vær oppmerksom på inkubasjonstidene nøyaktig, da de er avgjørende for ytelse. - Sentrifuge for 5 min på 300 x g, fjerne supernatant og legge til 1 ml SFM supplert med 10 ng / ml EGF og 5 ng / ml bFGF.
- Treropp og ned ca. 10x med en P1000 pipette for å dissosiere nevrosfærer.
- Telle antall celler ved hjelp av en løsning som inneholder 0,2% Trypan blå og et hematocytometer.
- Reseed celler med en tetthet på 2 x 104 celler / ml i ubestrøket 60 mm Petri retter.
- Inkuber SVZ- og DG-celler i henholdsvis 6–8 dager og 10–12 dager for å oppnå sekundære nevrosfærer ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: Selvfornyelseskapasiteten til SVZ- og DG-avledede NSPCer kan nås ved å følge protokollseksjon 5 og 6. For det, frø SVZ og DG celler med en tetthet på 1,0 x 104 celler /ml (i ubestrøkede 24-brønnplater) i vekst SFM medium som inneholder 5 ng/ml EGF og 2,5 ng/ml bFGF (lav EGF/bFGF). Tell antall resulterende primære og sekundære nevrosfærer.
7. Lagring av nevrosfærer
- Samle mediet som inneholder nevrosfærer (hentet fra trinn 5,3 og 6,7) fra 60 mm Petri-retter.
- Sentrifuge i 5 min ved 300 x g og kast supernatanten.
- Vask cellene 2x med 1 ml HBSS (5 min ved 300 x g).
- Sentrifuge i 5 min ved 300 x g, kast supernatanten og lagre pellet av nevrosfærer ved -20 °C for molekylærbiologianalyse.
8. PDL belegg plate prosedyre
- For å forberede løsning 1 (0,1 M boratbuffer), veie 3,92 g borsyre og fortynnes i 400 ml vann med høy renhet. Juster pH til 8,2 og utgjør opptil 500 ml med høyt renhet vann.
- For å forberede løsning 2 (0,167 M boratbuffer), veie 10,3 g borsyre og fortynnes i 900 ml vann med høy renhet. Juster pH til 8,2 og utgjør opptil 1000 ml med høyt renhetvann.
- For å rekonstituere poli-D-lysin (PDL) (1 mg/ml i 0,1 M boratbuffer), fortynn 100 mg PDL i 100 ml oppløsning 1.
- Lag alisiter på 10 ml til bruk umiddelbart eller frys og oppbevar ved -20 °C.
- Under laminarstrømmen tilsett 1 dekkslip per brønn og steriliser under UV-lys i 15 min.
- Bruk den rekonstituerte PDL-en eller tin frosne rekonstituerte PDL.
- Forbered den endelige oppløsningen på 100 μg/ml PDL i 0,167 M boratbuffer ved å tilsette 10 ml rekonstituert PDL til 90 ml oppløsning 2.
- Tilsett den endelige løsningen på brønner i minst 2 timer til over natten ved 37 °C.
MERK: For 24-brønnplater, tilsett et volum på 500 μL i hver brønn. - Fjern oppløsningen og vask 3x med høyt renhet vann.
- La dekksleppene tørke i lamiklasstrømningshetten.
- La de flerbrønnskulturplatene stå ved 4 °C.
9. PDL/Laminin belegg plate prosedyre
- På dag 1, belegg platene med PDL som beskrevet i avsnitt 8.
- På dag 2 fjerner du PDL-oppløsningen og vasker 3x med vann med høy renhet. La tørke.
- Forbered 5 μg/ml laminin i kald SFM uten vekstfaktorer.
- Tilsett oppløst laminin i dekksleppene og inkuber ved 37 °C over natten.
MERK: For 24-brønnplater, tilsett et volum på 500 μL i hver brønn. - Fjern laminin med en pipette.
MERK: Ikke vask dekkleppene fra laminin. - Bruk umiddelbart eller oppbevares ved -20 °C.
10. Prosedyre for poly-l-ornithin (PLO) /lamininbelegg
- Under laminarstrømmen, tilsett en dekkslip per brønn og steriliser under UV-lys i 15 min.
- Tilsett 0,01% PLO-løsning til hver brønn i 20 min ved romtemperatur (RT).
MERK: For 24-brønnplater, tilsett et volum på 500 μL i hver brønn. - Fjern oppløsningen og vask 3x med sterilisert 1x PBS. La tørke.
- Forbered 5 μg/ml laminin i steril 1x PBS.
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Fjern laminin.
MERK: Ikke vask dekkleppene fra laminin. - Bruk umiddelbart.
MERK: Kontroller at dekkseddelen er fullstendig dekket av PLO-oppløsningen ved å trykke forsiktig på trekkslipen med en pipettespiss. Når de ristes, bør de multi-brønnplatene ikke lage lyd.
11. Evaluering av neuritogenese ved å generere et differensiert monolayer av celle
- Samle media som inneholder nevrosfærer fra 60 mm Petri retter (hentet fra seksjon 5) og sentrifuge for 5 min ved 300 x g på RT.
- Kast supernatanten og dissosiere pelleten av nevrosfærer i 1 ml dissosiasjon PBS (dvs. PBS uten Mg2+/Ca2+ og med EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4,137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 og 0,5 mM EDTA 4Na, på pH = 7,40]) ved å inkubere i 15 min etterfulgt av mekanisk dissosiasjon. Alternativt, dissosiere nevrosfærer ved hjelp av et kjemisk dissosiasjonssett (mus) (Table of Materials).
- Sentrifuge i 5 min ved 300 x g ved RT og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml SFM uten vekstfaktorer.
- Bestem celletetthet ved hjelp av et hematocytometer.
- Fortynn den dissosierte cellesuspensjonen i SFM uten vekstfaktorer med en tetthet på 3766 celler/cm2 og plateceller på belagte glassdekklepper i 24-brønnplater.
- Etter 1–3 dager fikser du celler for immuncytokjemi mot et protein av cytoskjelettet (se avsnitt 14).
12. Differensiering av nevrosfærekulturer
MERK: Nevrosfærer hentet fra celleutvidelse, enten fra primære eller passasjernevrosfærer (innhentet i avsnitt 5 eller 6) kan differensieres i celler fra forskjellige nevrale linjer.
- Når nevrosfærer har en diameter på 150-200 μm, samle 25 μL neurosphere suspensjon medium og plate på belagt glass coverslips, i 24-brønnplater.
MERK: For å samle flere nevrosfærer, roter forsiktig Petri-fatet for å konsentrere nevrosfærene i midten. Deretter pipette fra midten. - Sett platene i en inkubator ved 37 °C i 15 min slik at nevrosfærene holder seg til underlaget. Etterpå, tilsett 500 μL av SFM blottet for vekstfaktorer (differensiative forhold).
- Etter 24 timer, erstatt mediet med frisk SFM blottet for vekstfaktorer.
- Differensier for ulike tidspunkter (f.eks. 2 og 7 dager in vitro, DIV2 og DIV7) med henholdsvis 5 % CO2 og 95 % atmosfærisk luft ved 37 °C.
MERK: Celleoverlevelse, spredning og differensiering kan analyseres ved hjelp av forskjellige celleanalyser.
13. Cellebiologi analyser
- Celle overlevelse analyse
- Utsett belagte nevrosfærer til 3 μg/ml propidiumjodid (PI) i 30 min før cellefiksering i inkubatoren ved 37 °C.
MERK: PI er et autofluorescerende middel som bare er i stand til å komme inn i celler med kompromittert membranintegritet8. Andre metoder for å analysere celleoverlevelse kan brukes som caspase 3 farging eller terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end merking (TUNEL) analyse.
- Utsett belagte nevrosfærer til 3 μg/ml propidiumjodid (PI) i 30 min før cellefiksering i inkubatoren ved 37 °C.
- Analyse av cellespredning
- Utsett belagte nevrosfærer for 10 μM 5-bromo-2'-deoksykuridin (BrdU) i 4 timer før fiksering i inkubatoren ved 37 °C.
MERK: BrdU er en syntetisk tymidinanalog som kan innlemmes under DNA-syntese i prolifererende celler9.
- Utsett belagte nevrosfærer for 10 μM 5-bromo-2'-deoksykuridin (BrdU) i 4 timer før fiksering i inkubatoren ved 37 °C.
- Analyse av celledifferensiering
- Utsett 7-dagers gamle belagte nevrosfærer til 10 μM BrdU i de første 24 timer, i inkubatoren ved 37 °C.
- Fornye SFM uten vekstfaktorer (differensierende forhold) og la cellene utvikle seg i fravær av BrdU i de følgende 6 dagene til fiksering.
MERK: Disse pulsjagende eksperimentene, ved å merke med markører for modne nevrale celler, tillater evaluering av stamceller som skiller seg inn i modne celler under protokollen.
14. Immunfarging av nevrosfærekulturer
- Celle fiksering
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og oppbevar ved 4 °C eller -20 °C.
- Fjern SFM uten vekstfaktorer fra brønner og tilsett, til hver brønn, 500 μL av 4% PFA ved 4 °C i 20 min ved RT.
- Vask 3x med 1x PBS, i 5 min hver gang, coverslips som inneholder differensierte nevrosfærer.
- Oppbevar dekksteletter til det brukes i 500 μL av 1x PBS ved 4 °C.
MERK: Hvis eksperimentet ikke har BrdU, går du til trinn 14.3.
- Avkokeringsmetode (kun for BrdU-eksperimenter)
- Forbered 1 M HCl ved 37 °C.
- Skyll dekselslips 3x i 1x PBS.
- Permeabilize celler i 30 min i PBS som inneholder 1% nonionic overflateaktivt middel (f.eks Triton X-100).
- Denature dsDNA med 1 M HCl forvarmet til 37 °C i 30–40 min ved 37 °C (~300 μL/brønn).
- Vask brønner 4x med 1x PBS.
- Permeabilization og blokkering
- Skyll dekkleppene i 1x PBS i 5 min.
- Inkuber for 1,5 timer med 0,5% nonionic overflateaktivt middel og 3% storfe serum albumin (BSA) i 1x PBS (~ 300 μL / brønn).
MERK: For NeuN, bruk 6 % BSA i 1x PBS.
- Inkubasjon og montering
- På dag 1, uten vask, inkuberceller med primære antistoffer (Table of Materials) i 0,1% nonionic overflateaktivt middel og 0,3% BSA i 1x PBS i inkubasjonskammeret (for 24-brønnplater bruker 20 μL / brønn). La dekksedler inkubere over natten ved 4 °C lys beskyttet hvis antistoffer er konjugert til en fluorophore.
- På dag 2 returnerer du coverslips til sine respektive brønner og skyller 3x i 1x PBS i 5 min.
- Counterstain med passende fluorescenskonjugerte sekundære antistoffer (fortynning 1:200) og med 12 μg/ml hoechst 33342 i 1x PBS i 2 timer ved RT og lys beskyttet i inkubasjonskammeret (20 μL/coverslip).
- Vask dekklepper 3x i 1x PBS i 5 min.
- Monter dekksedlene på mikroskopskliene ved hjelp av 5 μL/coverslip av fluorescensmonteringsmedium.
- La dekkstilene lufttørke ved RT, beskyttet mot lys, i 1 dag.
- Mikroskopi
- Vis og skaffe bilder ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
- For hver betingelse, bruk tre replikater. Utfør celletall i fem uavhengige mikroskopiske felt i hver dekkslip med et mål på 40 x (~100 celler per felt).
15. Utarbeidelse av EGF og bFGF lager løsninger
- EGF lager løsning
- For å rekonstituere lyofilisert EGF, fortynn produktet i vann med høy renhet for å nå en endelig konsentrasjon på 20 μg/ml.
- Aliquot og lagre i mikrorør på -5 til -20 °C.
- bFGF lager løsning
MERK: bFGF må rekonstitueres med en oppløsning på 10 mM Tris, pH 7.6.- Sentrifuger hetteglasset kort før åpning for å bringe innholdet til bunnen.
- Forbered 50 ml 10 mM Tris, pH 7.6. For det veier du 60,57 mg tris ((HOCH2)3CNH2) og fortynn det i 40 ml vann med høy renhet. Juster pH til 7,6 og utgjør opptil 50 ml med høyt renhetvann.
- Forbered 10 ml 0,1 % BSA i 10 mM Tris, pH 7.6. For det, veie 10 mg BSA og fortynne den i 10 ml 10 mM Tris.
- Filterløsninger utarbeidet i trinn 15.2.2 og 15.2.3 med et filter på 0,22 μm under en lamiarstrømningshette.
- Rekonstituer 10 μg bFGF i 1000 μL på 0,1 % BSA i 10 mM Tris med pH 7,6 for å nå en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml. Aliquot i mikrorør ved -20 °C i maksimalt 6 måneder.
Representative Results
SVZ og DG nevrosfærer, oppnådd ved hjelp av NSA, består av udifferensierte celler, positivt for Sox2, en transkripsjonsfaktor involvert i selvfornyelseskapasiteten og positiv for nestin, et mellomliggende filamentprotein uttrykt i NSPCer (figur 1A). I tillegg har SVZ-avledede nevrosfærer større dimensjoner enn sine DG-kolleger (figur 1A). Viktigere, i differensierende forhold migrerer SVZ- og DG-avledede NSPCer ut av nevrosfærer som danner et pseudomonolayer av celler (figur 1B).
For å få tilgang til selvfornyelseskapasiteten utføres celleparanalysen basert på uttrykk for Sox2 og nestin som har en tendens til å forsvinne i å dele celler som starter differensieringsprosessen med en kombinasjon av en markør for nevronal avstamning nemlig DCX. I begge nevrogene regioner, Det er mulig å observere tilstedeværelsen av Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske divisjoner (selvfornyelse) (Figur 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/D CX+/- asymmetriske divisjoner (Figur 2A1,B2) og Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriske divisjoner (differensiering) (Figur 2A2,B1).
Passaging nevrosfærene øker utbyttet av NSPCer; Celledød ved DIV2 endres imidlertid med passering. Faktisk økes prosentandelen av PI-positive celler med cellepassasje i SVZ (P0: 15,6 % ± 1,2 % vs P1: 19,2 % ± 2,7 % vs P2: 32,35 % ± 0,14 % vs P3: 39,6 % ± 4,0 %) og i DG (P0: 16,31 % ± 0,95 % vs P1: 32,1 % ± 1,7 % vs P2: 27,42 % vs P3: 32,2 % ± 3,1 %) (Figur 3).
Neuritogenesis kan evalueres i nevroner hentet fra differensiering av SVZ og DG NSPCer i begynnelsen av differensiering: DIV1 (Figur 4A,D), DIV2 (Figur 4B,E) og DIV3 (Figur 4C,F). Faktisk, som observert i figur 4, øker lengden og forkonsekvensen av neurites med differensiering.
Cellespredning kan evalueres i SVZ- og DG-avledede nevrosfærer. Sammenligning av primære differensierte nevrosfærer ved DIV1 fra SVZ (Figur 5A1) og DG (Figur 5A2)er prosentandelen av BrdU-positive celler høyere i SVZ enn i DG (SVZ: 6,15 % ± 0,64 % vs DG: 3,27 % ± 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Figur 5A3). Videre kan celledifferensiering også nås ved å kombinere BrdU-farging med en moden produsent som nevronale kjerner (NeuN) som identifiserer modne nevroner (figur 5B1,B2). Figur 5B3 viser at prosentandelen av prolifererende stamfarer som differensierer til modne nevroner er lik i SVZ og DG (SVZ: 12,04 % ± 1,58 % vs. DG: 13,56 % ± 0,48 %; p > 0,05; n = 4).
Stilkheten og multipotensen til SVZ- og DG-avledede NSPCer kan nås ved hjelp av NSA ved å evaluere uttrykket for forskjellige markører ved forskjellige differensieringsdager (DIV2 og DIV7). Faktisk er NSCer (nestin- og glial flimmersyreprotein [GFAP]-dobbeltpositive celler) tilstede i begge nevrogene regioner (figur 6A,G). Disse cellene er i stand til å differensiere til umodne nevroner (DCX-positive celler) (Figur 6B,H), modne nevroner (NeuN-positive celler) (Figur 6F,L), oligodendrocyte forløperceller (neuron-glial antigen 2 [NG2] og blodplate-avledet vekstfaktor reseptor α [PDGFRα]- positive celler) (Figur 6C,I), modne oligodendrocytes (myelin grunnleggende protein [MBP]-positive celler) (Figur 6E, K) og astrocytter (GFAP-positive celler) ( Figur6D, J).
Ulike substrater kan brukes til å belegge coverslips for å danne pseudomonolayer av celler under differensierende forhold. Som vist i tilleggsfigur 1,migrerer DG-celler mer når dekksedlene har ekstra belegg med laminin kombinert med PLO eller PDL enn med PDL alene (Tilleggsfigur 1B-H). Faktisk, når PDL og laminin brukes sammen som substrater (Supplerende figur 1C, G), DanneD-celler en mer confluent pseudomonolayer enn SVZ celler som PDL brukes alene (Supplerende figur 1A, E).
Viktigere, disse resultatene viser potensialet i NSA å evaluere stemness og multipotens egenskaper av NSCs avledet fra de to viktigste nevrogene nisjer.
Figur 1: Subventrikulær sone og dentate gyrus avledet NSPC dyrket som nevrosfærer eller som pseudomonolag. (A) Representative brightfield (A1,A3) og fluorescens (A2,A4) bilder av SVZ- og DG-avledede nevrosfærer, hvor kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå) og NSCer for Sox2 (grønn) og nestin (rød). (B) Representative brightfield bilder av pseudomonolayers generert fra SVZ- og DG-avledede nevrosfærer under differensierende forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Celleparanalysen. Representative fluorescensbilder av cellepar avledet fra en stamcelledeling. SVZ og DG kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå), stamceller for Sox2 (rød) og nestin (hvit) samt umodne nevroner med DCX (grønn). Pilspisser i panelene A1 og B1 indikerer Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske selvfornyende divisjoner, piler i panela A1 og B2 indikerer Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/--/+ asymmetrisk inndelinger, stiplede linjepiler i paneler A2 og B1 viser Sox2-/- /-/DCX+/symmetrisk+ differensiatingsdivisjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Celleoverlevelsesanalyse med cellepassaging. Kvantitativ analyse av PI-positive celler ved DIV2 i SVZ- og DG-avledet differensiert nevrosfærekultur, etter 0, 1, 2 og 3 passasjer (P0-P3). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 1−8. PI = propidium Jodid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Neuritogenesis analyse på DIV 1, 2 og 3. Representative konfokal fluorescens bilder av nøytritter, identifisert av βIII-tubulin signal, i SVZ og DG nevroner på (A,D) DIV1, (B, E) DIV2, og (C,F) DIV3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Cellespredningsanalyse. Representative konfokale bilder av BrdU-positive celler ved DIV1 i (A1) SVZ og (A2) DG. - Jeg har ikke noe åsi. Kvantitativ analyse av BrdU-positive celler ved DIV1 i DG- og SVZ-avledet differensiert nevrosfærekultur. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 4. *p < 0,05 ved t-test. Representative fluorescensbilder av BrdU- og NeuN-positive celler ved DIV7 i (B1) SVZ og (B2) DG. Pilspisser indikerer BrdU-/NeuN-positive celler. Jeg har ikke noe å si tildeg. Kvantitativ analyse av BrdU-/NeuN-positive celler ved DIV7 i begge nisjer. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine, syntetisk tymidinanalog. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Nevrale celletyper som finnes i SVZ- og DG-avledet differensiert nevrosfærekultur. Representative fluorescensbilder av SVZ- og DG-avledede celletyper etter 2 og 7 dager med nevrosfæredifferensiering (DIV2 og DIV7), hvor cellekjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå) og: (A,G) NSCer for GFAP (grønn) og nestin (rød), (B,H) umoden nevroner for DCX (grønn), (C,I) oligodendrocyte forløperceller for PDGFRα (grønn) og NG2 (rød), (D,J) astrocytter for GFAP (grønn), (E,K) modne oligodendrocytes for MBP (grønn), og (F,L) modne nevroner for NeuN (rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Testing av forskjellige underlag for neurosphere etterlevelse og migrasjon for å danne et pseudomonolayer. Representative fluorescensbilder av (A,E) SVZ-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin som et substrat, (B,F) DG-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin som substrat, (C,G) DG-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin med laminin som et substrat, og (D,H) DG-avledet pseudomonolayer ved hjelp av poly-D-lysin med poly-L-ornit som et substrat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
In vitro systemer av NSPCs tillate en bedre forståelse av cellulære og molekylære mekanismer, som kan ytterligere valideres i vivo. NSA er en svært kraftig metode for å etterligne fysiologiske forhold på grunn av deres tredimensjonale struktur. Videre er dette kultursystemet også teknisk enklere å kultur10, sammenlignet med andre in vitro-systemer som monolayerkultursystemet. Faktisk, med NSA, er det lett å kontrollere de eksponerte extrinsic signaler under celleutvikling, enten under utvidelsen eller differensieringsfasen, ved å legge til nøyaktige og variable mengder faktorer av interesse for media, samt ved å kule nevrosfærer med andre celletyper6. Videre, sammenlignet med monolayer kulturer, i NSA, er det mulig å få en høyere celletetthet fra en liten mengde vev eller med et lite antall celler, slik at parallelle studier kan utføres, og dermed redusere antall dyr1.
NSA er den vanligste metoden for å isolere og utvide NSCer11,12,13, kan brukes til å estimere antall forløperceller som finnes i en gitt vevsprøve5 og forløpercellefrekvensen mellom ulike forhold. Imidlertid gjør både nevrosfærer og monolayer kulturer ikke redegjøre for quiescence NSCs14. Videre har NSA noen begrensninger11,12,13 og den resulterende nevrosfærefrekvensen avhenger av mange faktorer, inkludert mellomstore komponenter, disseksjonsprosedyren, dissosiasjonsprosessen11,12,13, og nevrosfæreaggregasjon5. Faktisk, i en høy tetthet kultur, nevrosfærer har en tendens til å aggregere. Forsiktighet må derfor utvises ved estimering av antall forløperceller i en prøve. For å overvinne de ovennevnte begrensningene, kan isolerte NSPCer også utvides og overføres i et monolag5,15. Viktigere, ved hjelp av NSA for å sammenligne forløpercellefrekvens mellom ulike forhold er svært nyttig og nøyaktig fordi alle disse begrensningene er implisitte og like blant alle forhold som utføres i samme eksperiment.
Det er kritiske skritt i nevrosfærekulturen som trenger oppmerksomhet. I hjernen høsting trinn, fullstendig fjerning av meninges og god isolering av nevrogene nisjer er avgjørende for å maksimere renheten og utbyttet av NSPCs. Under vevdissosiasjon, på grunn av proteolytisk aktivitet av trypsin, kan overdreven bruk av trypsin eller lengre inkubasjonstider føre til cellelysis. Videre er dagen for passasjen avgjørende for å oppnå en sunn populasjon av nevrosfærer. Passering av nevrosfærer med en diameter høyere enn 200 μm påvirker i stor grad levedyktigheten, proliferative og differensierende kapasiteten til NSPCer. Viktigst, lengre sykluser av passasjer, mer enn 10 kan øke genetisk ustabilitet6. Videre er belegg med PDL og PLD / laminin for SVZ og DG-celler, henholdsvis avgjørende for å sikre god cellemigrasjon ut av nevrosfærene uten å gå på akkord med differensieringsprosessen. Når det gjelder immuncytokjemianalysen, kan lengre inkubasjonstider med PFA kompromittere farging ved å maskere antigenene og øke bakgrunnen.
NSA er et kraftig verktøy for å gi en konsekvent og en ubegrenset kilde til NSPCer for in vitro studier av neural utvikling og differensiering samt for terapeutiske formål16,17. Faktisk kan denne analysen brukes på genetiske og atferdsmessige modeller for å ytterligere forstå molekylære og cellulære mekanismer involvert i NSPC-spredning og differensiering18,19. Denne analysen er også nyttig for å teste ulike stoffer og forbindelser20,21,22 samt å utføre genetiske manipulasjoner19,23 å modulere NSC egenskaper. I tillegg til immuncytokjemi kan omvendt transkripsjonpolymerasekjedereaksjon og vestlig blotanalyse utføres for å få tilgang til RNA og proteinuttrykk, mens elektrofysiologiske studier og kalsiumavbildning kan brukes til å evaluere funksjonen til de nyfødte nevronene21.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av IF/01227/2015 og UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) og R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) fikk et fellesskap fra FCT. Forfatterne vil gjerne takke medlemmene av bioimaging anlegget ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes for mikroskopi hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
- Reynolds, B., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural Stem Cell Isolation and Characterization. Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).
- Xapelli, S., et al. Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures. PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).
- Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures. RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain. SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage. PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).
- Khacho, M., et al. Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program. Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).
- Soares, R., et al. Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats. Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).
- Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis. Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin? Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Kim, H. J., et al. Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells. Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).
