Summary
小さなヘアピン(sh)RNAを用いてC2C12筋芽細胞(ECM)タンパク質をコードする遺伝子を安定的にノックダウンするプロトコルを提供します。ADAMTSL2を例に、ミオチューブ分化に対するC2C12筋芽細胞間におけるmRNA、タンパク質、および細胞レベルのノックダウン効率の検証方法について説明します。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) タンパク質は骨格筋の発達と恒常性に不可欠です。C2C12筋芽細胞のECMタンパク質をコードする遺伝子の安定したノックダウンは、骨格筋発達におけるこれらのタンパク質の役割を研究するために適用することができる。ここで、ECMタンパク質ADAMTSL2を一例として枯渇させるプロトコルについて、C2C12細胞における小さなヘアピン(sh)RNAを用いた。shRNAプラスミドのトランスフェクションに続いて、安定した細胞をピューロマイシンを用いてバッチ選択した。さらに、これらの細胞株の維持およびmRNA発現、タンパク質発現、およびC2C12分化による表現型分析について説明する。この方法の利点は、比較的速いC2C12ノックダウン細胞の生成と、細胞培養培地中の血清の枯渇時にC2C12細胞を多核化筋管に確実に分化することである。C2C12細胞の分化は、明視野顕微鏡法およびMyoD、ミオゲニン、またはミオシン重鎖(MyHC)などの正規マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによってモニタリングされ、ミオチューブへのC2C12ミオブラスト分化の進行を示す。小干渉(si)RNAを有する遺伝子の一過性ノックダウンとは対照的に、C2C12の分化中または筋管成熟中に後に発現する遺伝子は、shRNAを安定して発現するC2C12細胞を生成することによってより効率的に標的化することができる。この方法の限界は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子ノックアウト戦略を用いて克服できる特定のshRNA、ならびに考慮すべきshRNAの潜在的なオフターゲット効果に応じて、ノックダウン効率の変動である。
Introduction
細胞外マトリックス(ECM)タンパク質は、すべての組織に構造的なサポートを提供し、細胞と細胞間の通信を媒介し、細胞の運命を決定します。ECMの形成と動的なリモデリングは、組織および器官の恒常性を維持するために重要である1,2.ECMタンパク質をコードするいくつかの遺伝子における病理学的変異体は、筋ジストロフィーから擬似運動体のビルド3、4に至るまでの形型を有する筋骨格系障害を生じさせる。例えば、ADAMTSL2の病原体変異体は、極めて稀な筋骨格系障害のゲレオフィス性異形成を引き起こし、これは偽筋造り、すなわち骨格筋質量5の明らかな増加を呈する。マウスおよびヒトにおける遺伝子発現データと共に、骨格筋の発達または恒常性6,7におけるADAMTSL2の役割を示唆している。
ここで説明するプロトコルは、ADAMTSL2が細胞培養環境における骨格筋の発達および/または恒常性を調節するメカニズムを研究するために開発された。我々は、マウスC2C12筋芽細胞株においてADAMTSL2を安定的にノックダウンした。C2C12筋芽細胞および筋管への分化は、骨格筋分化および骨格筋生体工学のためのよく記述され、広く使用されている細胞培養モデル8、9である。C2C12細胞は、血清離脱後に明確な分化ステップを経て、培養中3〜10日後に多核化筋管の形成をもたらす。これらの分化工程は、MyoD、ミオゲニン、ミオシン重鎖(MyHC)などの異なるマーカー遺伝子のmRNAレベルを測定することによって確実に監視することができます。C2C12細胞で安定した遺伝子ノックダウンを発生させる利点の1つは、C2C12分化の後期段階で発現する遺伝子を、トランスフェクション後5〜7日間続く小干渉(si)RNAによって達成される一過性ノックダウンと比較して、より効率的に標的にできることであり、トランスフェクション効率の影響を受ける。ここで説明するプロトコルの第2の利点は、プルマイシン選択を用いたC2C12ノックダウン細胞のバッチの比較的高速な生成である。CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトや、ヒトまたは標的遺伝子欠損マウスからの一次骨格筋細胞前駆体の単離などの代替案は、技術的にはより困難であるか、患者の筋肉生検または標的遺伝子欠損マウスの入手可能性をそれぞれ必要とする。しかしながら、他の細胞培養ベースのアプローチと同様に、C2C12細胞の使用には、細胞培養のセットアップの2次元(2D)性質や未分化骨格筋前駆細胞10を維持するために重要な生体内微小環境の欠如などの骨格筋細胞分化モデルとしての使用には限界がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.大腸菌からのshRNAプラスミドDNAの調製
- shRNAプラスミドを担うクローン細菌コロニーの生成
- 標的特異的shRNAプラスミドと制御プラスミドを担持する大腸菌のグリセロールストックを商業供給源(材料表)から得る。
注:3つの異なるshRNAプラスミドが使用され、マウスAdamtsl2 mRNAの異なる領域を標的とした。1つのshRNAは、組換え完全長ADAMTSL2または個々のADAMTSL2タンパク質ドメインをコードする発現プラスミドを用いたレスキュー実験を容易にするために、Adamtsl2の3'非翻訳領域(3'UTR)を標的に選択した。また、スクランブルされたshRNAプラスミドを陰性対照として含めた。shRNA配列の詳細は、図1Aに記載されています。 - shRNA細菌グリセロールストックを室温(RT)で解凍します。10 μg/mL アンピシリン(LB-Amp)を補充したルリア・ベルタニ(LB)寒天プレートに10μLの細菌グリセロールストックを移します。
注:LBアンププレートは、1LのLB培地(1 L:10gのトリプトン、5gの酵母エキス、10gのNaCl、pHを7.0に調整)を12gの寒天と共にオートクレーブすることによって調製されます。培地を〜50°Cまで冷却し、アンピシリン(ストック溶液:滅菌水中の50mg/mL)をμg/mL(LB-Amp寒天)の最終濃度に加えます。10cmのペトリ皿にLB-Amp寒天の~20mLをすぐに注ぎ、使用前に寒天を固めます。LB-Amp寒天の1Lは、典型的には約40 10cmペトリ皿を注ぐのに十分である。LB-Amp寒天を含むペトリ皿は、暗い場所で4°Cで密封保存すれば少なくとも1ヶ月間安定である。 - 細菌を無菌ドライガルスキへらまたは他の適切な方法で広げて単一の細菌コロニーを達成する。37 °Cで一晩逆さまに細菌プレートをインキュベート。
- 標的特異的shRNAプラスミドと制御プラスミドを担持する大腸菌のグリセロールストックを商業供給源(材料表)から得る。
- プラスミド製剤
- 翌朝、個々の細菌コロニーを持つペトリ皿を取り出し、細菌コロニーの過剰増殖および衛星コロニーの形成を避けるために4°Cに貯蔵する。一晩以上保管されている場合は、ペトリ皿を密封します。
- 午後には、ポリプロピレン細菌培養管にLB-Amp培地5mLを加えます。ピペットチップで一晩培養したペトリ皿から単一の細菌コロニーを選択し、LB-Amp培地を含む細菌培養管にピペット先端を噴出させることによりLB-Amp培地を接種する。
- 37°Cで250rpmで250rpmで細菌培養を一晩インキュベートし、蓋をゆるやかに取り付けてエアレーションを可能にした。
- 翌朝、細菌培養管を取り出し、細菌の過剰増殖を避けるために4°Cに保ちます。午後、LB-Amp培地の50mL中の1mLの渦をボルテックスして転写して細菌を250mLの円錐フラスコに再懸濁した。37°Cで250rpmでシェーカーで一晩インキュベートする。
- 翌朝、RTで6,000 x gで50mLの使い捨て遠心管および遠心分離器細菌に15分間細菌を移し、手順1.2.6を続けます。
注:プラスミドDNAをすぐに分離できない場合は、遠心分離工程の後にLB-Amp培地を取り出し、-20°Cでバクテリアペレットを貯蔵してください。 - プラスミド調製キット(ミディスケール)の指示に従って、細菌からプラスミドDNAを抽出します。分光光度計を用いてA260/A280比を測定し、プラスミドDNAの品質を評価します。
注: A260/A280比は>1.8が望ましく、プラスミドDNA製剤の高純度を示す。A260/A280比が低い場合、タンパク質の汚染や抽出試薬の除去不足を示唆しています。さらなるプラスミド精製工程が必要とされ得る。
C2C12細胞の培養とトランスフェクションとピューロマイシン選択
- C2C12細胞培養
- C2C12細胞(材料表)を37°Cの水浴で素早く解凍し、セルフード内の100単位のペニシリンおよびストレプトマイシン抗生物質(無血清DMEM)を添加したDulbeccoの変性イーグル培地(DMEM)培地8mLを含む無菌使い捨て15mL遠心分離管に細胞を注ぎます。RTで160 x gで3分間遠心分離細胞。
- 10%のウシ胎児血清(FBS)(完全DMEM)を補充した無血清DMEMの細胞ペレットを10mLで吸入し、再懸濁する。細胞を10cmの組織培養処理したプラスチック皿に移す。5%のCO2雰囲気で37°Cで加湿インキュベーターで細胞をインキュベートする。
- 翌日、メディアを新鮮な完全なDMEMに置き換えます。
- 3-4 10 cmの皿の低い通路C2C12細胞を拡大する。C2C12細胞が50〜60%の合流に達すると、培地を吸引し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩基(PBS)を用いてC2C12細胞をリンスします。
- 0.25%トリプシン-EDTAの1 mLを加え、RTで2分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞剥離を監視し、必要に応じて細胞の大部分が剥離するまでインキュベーション時間を延長します。
注:慎重に皿をタップすると、細胞を取り除くのに役立ちます。 - ほとんどの細胞が切り離されたら、10 mLの完全なDMEMを皿に加え、容積を数回上下にピペットし、細胞懸濁液を無菌の使い捨て15 mL遠心管に移します。遠心分離細胞はRTで160 x gで3分間、吸引性上清を吸引し、細胞ペレットを凍結培地の2 mL(10%ジメチルスルホキシド[DMSO]/90%FBS)に再懸濁した。
- 凍結液中の10cm皿につき2つの1 mLアリコートを移します。RTイソプロパノールを充填した細胞凍結容器内の-80°C冷凍庫で少なくとも24時間、氷結晶の形成を避けるために1分あたり約−1°Cの凍結速度をもたらす。液体窒素の気相に長期使用する細胞を貯蔵する。
注: ベンダーは、15 番までの C2C12 セルを使用することをお勧めします。著者の経験はまた、より低い通過数細胞が筋管へのより一貫した迅速な分化を示したことを示した。分化の早期発症を避けるためには、C2C12細胞を低い細胞密度(<50%合流)で維持することが不可欠である。C2C12 細胞の差別化または分化は元の筋芽細胞に戻すことができず、破棄する必要があります。
- トランスフェクションのためのC2C12細胞の準備
- 未分化C2C12細胞を10cm皿に培養し、50〜60%の合流点に達するまで培養します。培地を吸引し、10 mLのPBSでC2C12細胞をリンスし、0.25%トリプシン-EDTAの1mLを加えた。RTで2分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞剥離を監視し、必要に応じて細胞の大部分が剥離するまでインキュベーション時間を延長する。
注:慎重に皿をタップすると、細胞を取り除くのに役立ちます。 - ほとんどの細胞が切り離されたら、10 mLの完全なDMEMを皿に加え、細胞懸濁液を無菌の使い捨て15 mL遠心チューブに移します。遠心分離細胞はRTで160 x gで3分間、吸引上清を行い、細胞ペレットを完全DMEMの4 mLで再懸濁した。
- 1.5 mLの反応管に10μLのトリパンブルーを10μLのトリパンブルーと組み合わせ、ピペットを上下に入れ、反応管を注意深くフリックして混合し、細胞を計数スライドに移します。自動セルカウンターを使用して、セル番号/mL を判別します。
- C2C12細胞を50,000個の細胞/mLに希釈し、6ウェルプレート内のウェルあたり100,000個の細胞(2mL)を播種し、一晩のインキュベーション後に約40〜50%の合流率を達成します。5%のCO2雰囲気で37°Cで加湿インキュベーターで細胞をインキュベートする。
- 未分化C2C12細胞を10cm皿に培養し、50〜60%の合流点に達するまで培養します。培地を吸引し、10 mLのPBSでC2C12細胞をリンスし、0.25%トリプシン-EDTAの1mLを加えた。RTで2分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞剥離を監視し、必要に応じて細胞の大部分が剥離するまでインキュベーション時間を延長する。
- ポリエチレニミン(PEI)とピューロマイシン選択を用いたshRNAプラスミドを用いたC2C12細胞のトランスフェクション
- PEIストックソリューションの調製
- 50 mLのガラス媒体ボトルに50mLのガラス媒体ボトルに50mLの蒸留水(ストック溶液濃度:0.32mg/mL)で16mgのPEIを溶解します。溶液を65°Cで1時間、吸入期間中数回激しく溶かし、PEIを完全に溶解させる。
- 50 mLあたり1N HClの15 μLを加えてpH 8に調整します。
注意:HClは腐食性です。集中したHClは、ヒュームフードの下で処理する必要があります。調査官は、適切な個人用保護具を着用する必要があります。 - PEI溶液を-80°Cで緩く取り付けた蓋で1時間凍結し、水浴中の37°Cで急速に解凍して溶解性をさらに高めます。凍結解凍サイクル3xを繰り返します。
- PEIストック溶液を0.5 mLのアリコートに格納し、-20°Cで1回の使用を行います。
- C2C12細胞のトランスフェクション
- PEIストック溶液の25.5μL(8.5μL/μgプラスミドDNA)と1.5 mLの反応チューブで100μLの25mM NaClを組み合わせ、37°Cで5分間インキュベートします。プラスミドDNAの3μgを100 μLの25 mM NaClと組み合わせ、37°Cで5分間インキュベートします。
- 希釈されたPEI試薬の全容を希釈したプラスミドと組み合わせ、軽くピペットを上下にピペットで混ぜます。37 °Cで25分間インキュベートします。
- インキュベーション時間中に、FBSまたは抗生物質を使用せずにDMEMにトランスフェクションすることを意図したC2C12細胞の培地を変更する。
- C2C12細胞にPEI/DNAトランスフェクションミックスを加え、細胞培養皿を注意深く動かして絶えず滴下し、混合します。5%のCO2雰囲気で37°Cで加湿インキュベーターでインキュベートする。6時間経過後、培地を変更してDMEMを完成させます。
- プロマイシンセレクション
- トランスフェクション後24時間、培地を選択培地に切り替えます(完全なDMEMプラス5μg/mLピューロマイシン)。ピューロマイシン耐性C2C12細胞が得られるまでピューロマイシンの選択を続け、通常10〜14日かかります。
- プルマイシン耐性C2C12細胞を低細胞密度(<50-60%合流)で拡張し、ステップ2.1.4-2.1.7に記載されているように、将来の実験のために6-10バイアルの未分化状態および凍結保存を維持する。
注:定期的な細胞培養および拡張のために、5 μg/mLピューロマイシンの存在下で、ピューロマイシン耐性C2C12細胞を維持してください。しかし、分化実験ではピューロマイシンは省略した。
- PEIストックソリューションの調製
3. C2C12分化のフェノール的分析
注:以下に記載する方法は、ウェスタンブロッティングで使用される特異的抗体または定量的ポリメラーゼに使用される遺伝子特異的プライマーを変化させることによって、筋管へのC2C12筋芽細胞分化の一般的な表現型分析に容易に適合させることができる連鎖反応(qPCR)分析。
- C2C12分化プロトコルと明視野顕微鏡
- 12ウェルプレートに150,000個の細胞/井戸を播種します。ピューロマイシン耐性C2C12の培養安定細胞を、5%のCO2雰囲気中の37°Cで加湿インキュベーター中の12ウェルプレート中の選択培地中に。C2C12細胞を完全なDMEMで培養し、それらが約95%の合流に達するまで。
- C2C12細胞の分化を誘導するには、完全なDMEMを無血清DMEM(分化の0日目)に置き換えます。2日ごとに培地を交換し、カメラ付きの反転明視野顕微鏡を使用してC2C12ミオチューブ形成に従ってください。
注:多くのプロトコルは、C2C12細胞をミオチューブに分化するために2%の馬の血清を使用しています。著者の手では、血清を完全に取り除くことは同様の効果を有した。インスリンは、C2C12分化を促進する細胞培養培地への添加剤として記載されている。しかし、現在のプロトコルでは、C2C12細胞は、血清剥奪およびインスリンの添加後3〜5日以内に筋管に確実に分化し、不要と判断した。
- ミオシン重鎖(MyHC)の免疫染色により、ミオチューブを可視化
- 種子50,000ピューロマイシン耐性C2C12細胞は、完全なDMEMの500μLの8ウェルチャンバースライドでチャンバーあたり。完全DMEM(約24時間)で95%の合流点に達するまで培養細胞。
- 分化を誘導するには、完全なDMEMから500μLの無血清DMEM(分化の0日目)に切り替えます。所望の時点で、培地とリンス細胞を3倍のPBSを0.5 mLで吸引する。
メモ:RTで次の手順をすべて実行します。 - 0.2 mL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を PBS で 15 分間希釈し、0.5 mL の PBS 3x をそれぞれ 5 分間にリンスします。
注意: PFA は危険です。適切な予防措置を講じ、パラホルムアルデヒド溶液を有害廃棄物として廃棄してください。 - 5分間PBSで0.2 mL0.5 Mグリシンを用いたクエンチPFAをPBS3x0.5mLでそれぞれ5分間リンスした。
- 0.2 mL の非イオン性界面活性剤/洗剤 (物質表 ) を PBS で 10 分間インキュベートし、細胞膜を透過します。ブロック 0.2 mL の 5% ウシ血清アルブミンの PBS で 1 時間リンス細胞の PBS 3x の 0.5 mL をそれぞれ 5 分ずつ.
- 2時間の2時間のMyHC抗体の0.2 mL(PBSで1:200)を有する細胞をインキュベートし、0.5 mLのPBS 3xをそれぞれ5分間に当たります。
- ヤギ抗マウスローダミン赤結合二次抗体(PBSで1:200)の0.2 mLを有するインキュベート細胞。5分のPBS 3xの0.5 mLの細胞をリンス。
- PBSを定量的に除去した後、チャンバーあたり4′,6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)を含む取り付け培地を1滴加えます。メーカーの指示に従って、カバースリップと取り付け媒体を治します。マニキュアでシール。
- 蛍光顕微鏡を用いてC2C12細胞を観察し、適切なフィルタセットを用いた。
- 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるノックダウン効率の評価
- 第3.1項に記載されているように、12ウェルプレートでの分化条件下のC2C12細胞の培養。
- 所望の時点で、分化培地を取り出し、1 mLのPBSで細胞を1回リンスし、1ウェルあたり0.5mLのRNA抽出試薬(材料表)を加える。慎重に上下にピペットで細胞をライセし、細胞ライセートを無菌1.5mL反応チューブに移します。メーカーのプロトコルに注意深く従ってRNAを分離します。
注意:RNA抽出試薬にはフェノールが含まれています。それはヒュームフードの下で使用されるべきです。RNA抽出試薬廃棄物を回収し、有害廃棄物として処分します。調査官は、適切な個人用保護具を着用する必要があります。 - 最終RNAペレットを20 μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水に溶解します。分光光度計を用いてRNA調製物の量と品質を決定し、品質測定としてA260/A280比を決定します。
注: 12 ウェルプレートの 1 ウェルからの典型的な収率は、合計 RNA の 5-7 μg で、A260/A280の比率は 1.8-2 です。 - 残りの共精製ゲノムDNAを消化するために、PCRチューブ中のDEPC処理水の総体積8μLで1μgのRNAを希釈します。1μLの1μLの反応バッファーと1μLのDNase I(1ユニット/μL)(材料表)を加え、RTで15分間インキュベートし、1μLの停止溶液(25 mM EDTA)を加え、70°Cで10分間インキュベートします。
- cDNAを生成するには、逆転写酵素、ランダムプライマー、4 mM dNTPミックス(dATP、dTTP、dGTP、およびdCTPのそれぞれ1 mM)、および逆転写酵素反応バッファーを含む、10 μLのDNase処理RNAと2x逆転写酵素マスターミックスを組み合わせます。メーカーが推奨するプログラムを使用して、サーモサイクラーで反応をインキュベートします。cDNAを水で1:5の割合で希釈します。
- qRT-PCR反応を準備するには、SYBRグリーンqPCRマスターミックスの5μLを遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー(ストック:10 μM)と共に、反応ごとに2μLのDEPC処理水と組み合わせます。ピペット qPCR 反応は、96 ウェル qRT-PCR プレートの 1 ウェルに反応し、希釈された cDNA を 2 μL 添加します。生物学的複製ごとに3つの技術的複製を設定し、GapdhやHprt1などのハウスキーピング遺伝子を含む。
- pcr 産物をqRT-PCRサーモサイクラーで増幅するには、50 °C(2 分間(ウラシル-DNAグリコシラーゼ [UDG]活性化)、95 °C (デュアルロック DNA ポリメラーゼ活性化) 、95 °C の 40 サイクル (15 s) 、60 °C (30 s) 、72 °C (1 分) を使用します。
- QRT-PCR の結果を定量化するには、GapdhやHprt1などのハウスキーピング遺伝子に正規化する DDCt 法を使用します。
- ウェスタンブロッティングによるノックダウン効率の評価
- ウェスタンブロット分析用の6ウェルプレートにウェル当たり300,000個のピューロマイシン耐性C2C12細胞を播種。24時間後、分化を開始するために培地を無血清DMEMに変更する(分化の0日目)。
- 所望の時点で、1.5 mL反応チューブに1 mLの無血清条件培地を2個、RTで500 x gで5分間遠心分離して切り離された細胞および細胞破片を除去します。
注:このステップは、ECMタンパク質またはコンディショナリン培地中の他の分泌タンパク質が調査される場合にのみ必要です。目的のタンパク質が細胞質に局在しているか、膜結合である場合、細胞培養培地を吸引し、細胞の液化ステップ(3.4.7-3.4.12)を進めます。細胞のリシスは、タンパク質分解分解および細胞層の長期保存の他の意図しない結果を最小限に抑えるために、無血清条件付き培地からのタンパク質沈殿と並行して行われるべきである。 - 遠心分離後、新しい1.5 mL反応チューブに1mLの調合培地を移し、トリクロロ酢酸(TCA)と非イオン界面活性剤/洗剤の混合物を0.391 mL添加してタンパク質を沈殿させる。混合物を簡単にボルテックスし、氷の上で10分間インキュベートします。
注:使用前にタンパク質沈殿混合物を調製するには、55%TCAの0.252 mLと1%の非イオン性界面活性剤/洗剤1%の0.139 mLを、コンディショニングされた培地と渦の1mL当たり短時間組み合わせます。溶液が濁る。
注意: TCA は腐食性であるため、適切に処理する必要があります。 - 4°Cで10分間>16,000 x gで沈殿したタンパク質をペレット。上清を捨てます。
注意: 上清にはTCAが含まれているため、別途回収し、危険物として廃棄する必要があります。 - タンパク質ペレット3xを氷冷アセトンで洗浄し、4°Cで10分間>16,000 x gで毎回遠心分離機を使用します。
- RTで3-4分間タンパク質ペレットを空気乾燥させ、1xドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)サンプルバッファー(50 mM Tris pH 6.8、2%SDS、6%グリセロール、0.004%ブロモフェノール、0.004%ブロモフェノール、5%β-mercapエタノールを添加した50μL)に溶解します。サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、ウェスタンブロッティングに使用して、標準的な手順を使用して目的の標的タンパク質を検出します。
注意:β-メルカプトエタノールは臭気と毒性があり、ヒュームフードで処理する必要があります。 - 細胞内および膜結合タンパク質の場合、細胞層を2 mLのPBSで1回リンスします。
- 1 mLのPBSを加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を掻き取って細胞を取り出す。細胞を1.5mL反応チューブに集め、遠心分離機を3,420 x gで3°Cで3分間収集します。細胞ペレットを1 mLのPBSで3x、遠心分離機を3,420 x gで3,420 x gで3°Cずつ洗浄します。
- 細胞をリセに入れ、0.2 mLのリシス緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 7.5) で細胞ペレットを再懸濁させ、 150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1% NP40、1% デオキシコール酸ナトリウム、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、1 mMオルソバナジン酸ナトリウム) 1x EDTAフリーアーゼ阻害剤カクテル試薬とインキュベート30minの氷上で30分のインキュベート。
- 23 kHzの動作周波数で10の出力電力設定を持つ氷の上の15 sのための超音波。
- 4 °Cで20分間13,680 x gで遠心分離して細胞の破片を除去します。新しい1.5 mL反応チューブで上清を収集し、市販のブラッドフォードアッセイまたはその他の適切な方法を使用してタンパク質濃度を決定します。
- 各サンプルについて、100 μgのタンパク質と5x SDS-PAGEサンプルバッファを合計60 μLで組み合わせ、95°Cで5分間沸騰させます。標準的なウェスタンブロッティング手順でサンプルを分析し、目的の標的タンパク質の存在を確認します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ピューロマイシン耐性C2C12の選択は、非耐性、すなわちトランスフェクションされていない細胞の効率的な排除によるトランスフェクション後10-14日で達成することができる(図1B)。典型的には、細胞の80%以上が細胞培養皿から切り離され、これらの細胞は定期的な細胞維持の間に除去される。コントロールを発現するプロマイシン耐性C2C12細胞(スクランブル)shRNAはスピンドル形状を保持し、低い細胞密度で細長い細胞形態と筋管に分化する能力を有する。血清離脱時のC2C12分化は、明視野顕微鏡法および筋管マーカーミオシン重鎖(MyHC)の免疫染色によってモニターすることができる(図2)。MyHC陽性のミオチューブは、分化開始後3〜5日の間に観察される。Myotube は、MyHC 陽性細胞境界内に複数の DAPI 陽性核が存在する場合に示すように多核化されます。図3Aは、完全なDMEMで培養された安定したC2C12細胞の明るい視野画像を示す。ここで示すノックダウン効率は、40~60% (図 3B)の範囲です。mRNAは、少しAdamtsl2が発現する増殖状態で収穫されたため、ノックダウン効率は低く見えるが、C2C12分化の際には後の時点でノックダウン効率が大きくなると予想され、内因性Adamtsl2が誘導され、より高いレベルで発現する。ウェスタンブロット分析は、コントロールshRNAと比較してshRNA 3086を安定発現してC2C12細胞から得られた細胞ライセート中のADAMTSL2のノックダウンに成功したことを確認した(図3C)。
図1:shRNAコードプラスミドDNAを用いたトランスフェクション後の安定C2C12細胞の選択(A)ターゲット領域(CDS、コード配列、3'-UTR、3'非翻訳領域)、クローンID(以下1977、3086、および972と呼ばれる)、およびAdamtsl2を標的にするために使用されるshRNAの配列を示す表。(B) パネルは、コントロール shRNA と 3 つのAdamtsl2-ターゲティング shRNA でトランスフェクトされた C2C12 細胞の選択を示す。C2C12細胞を24時間後に培地に添加したshRNAプラスミドおよびピューロマイシンをトランスフェクトした。これに対し、統合されたshRNAプラスミドを収容するピューロマイシン耐性細胞は、スピンドル状、わずかに細長く、付着し、生存可能(青色矢印)に見えます。スケールバー = 100 μm.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図2:C2C12筋管分化にミオバラスト。C2C12細胞を分化する明るいフィールド画像は、分化の開始時(0−1日目)の細胞の緻密な石畳の出現を示し、5日目(上段)後に多核化筋管が観察された。ミオシン重鎖を用いたC2C12細胞の分化免疫染色(MyHC、赤)は、ミオチューブのマーカーであり、分化3日目(中央パネル)で誘導される。核はDAPIで染色され、マージされた画像は下のパネルに示される。スケールバー = 50 μm.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3: C2C12細胞の増殖における安定ノックダウンの検証(A) 完全DMEMで培養した安定したC2C12細胞の明視野画像。スケールバー = 300 μm(B) 安定 C2C12 細胞におけるAdamtsl2 mRNA 発現の qRT-PCR 分析。Ct値は、ハウスキーピング遺伝子Hprt1に正規化した。mRNAは分化の発症前に収穫した。誤差範囲は標準偏差を表します。(C) 細胞中のADAMTSL2タンパク質の減少を示すウェスタンブロット分析は、shRNA 3086を安定に発現するC2C12細胞からの細胞ライセート/ECM画分である。内因性ADAMTSL2は、カスタムメイドのポリクローナルペプチド抗体(要求に応じて入手可能)を用いて検出した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、C2C12筋芽細胞におけるECMタンパク質の安定ノックダウンと、筋管へのC2C12筋芽細胞の分化の表現的分析のためのプロトコルを説明する。いくつかの要因が実験の結果を決定し、慎重に検討する必要があります。増殖期のC2C12細胞を維持することは、C2C12細胞をミオブラスト前駆体状態に保つための重要なステップである。一貫して筋管に分化するC2C12細胞の能力を保持することは、i)細胞の通過数、ii)ルーチンメンテナンス中の培養細胞の密度、およびiii)栄養能、細胞培養培地11、12、13の頻繁かつ定期的な補充を必要とする。いくつかの未知のメカニズムのために、より高い通過数C2C12細胞はまた、さらなる筋芽細胞融合11の可能性を失う。C2C12細胞の提供者からの指示は、これらの細胞を通路番号15まで維持することを示唆している。その後、分化電位が低下し、そのような細胞を用いた実験は、より一貫した筋管形成をもたらす可能性がある。一方、メンテナンス中の細胞密度は、同様の効果をもたらす可能性があります9.日常的な細胞培養中にコンフルエントC2C12細胞密度に到達すると、C2C12筋芽細胞分化の開始が促進され、細胞集団の分化ポテンシャルに悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、C2C12細胞の定期的なメンテナンス中にC2C12細胞が高密度に到達するのを防ぐことが非常に重要です。これは、C2C12細胞を低い細胞密度(<50-60%合流)ですでにサブ培養することによって達成できます。血清飢餓は、筋管にC2C12細胞分化を誘導するために使用される。そのため、培地を補充することなく長期間の細胞維持により栄養と血清レベルを厳しく排気する。少なくとも2日ごとに新鮮な血清含有培地を補充すると、栄養素および血清剥奪による望ましくない早期分化の発症を防ぐことができます。
C2C12分化は、典型的には血清飢餓によって誘発される。C2C12分化を誘導するために使用される血清の割合は、結果、具体的にはMyHC陽性筋管14、15を形成するのにかかる時間に大きく影響する可能性がある。いくつかのプロトコルは、様々な血清濃度の下で分化の成功誘導を示す。2-10%FBSまたは馬の血清および完全な血清剥奪の使用は報告され、すべての条件はC2C12の筋管形成をもたらす。血清の割合または血清ロットの変化は、分化のためのマーカーを大きく変化させることができます。また、血清の供給源は、実験結果に影響を与える可能性があり、産国はウシ血清産生時に特定の添加剤を許可するか、許さない場合もあるからである。血清レベルは、特定の実験要件に従って分化速度を達成するように調整することができる。インスリンは、分化および筋管形成16を加速するC2C12細胞の培養培地に添加することができる。
トランスフェクションを介してc2C12細胞にsRNAまたは組み換えタンパク質をコードするプラスミドをC2C12細胞に送達する能力は、C2C12細胞の魅力的な特徴です。いくつかの市販のリポソーム系トランスフェクション試薬は、以前にC2C12細胞にプラスミドDNAを送達するために使用されてきたが、トランスフェクション効率は可変的に報告された17、18、19、20、21である。PEIはまた、合理的なトランスフェクション効率を示し、リポソームベースのトランスフェクション試薬に代わる費用対効果の高い代替手段です。市販のリポソーム系トランスフェクション試薬とPEIとのトランスフェクションとの比較では、トランスフェクション効率に大きな変化はなく、PEI2では若干高い効率が見られた。我々の手では、PEIを用いたトランスフェクション効率は、安定したピューロマイシン耐性C2C12細胞を生成するのに十分であった。しかし、このプロトコルにおける重要なステップは、トランスフェクション試薬のインキュベーション時間を短く保つことである。上記のように、C2C12細胞は、トランスフェクション中の低血清状態への血清離脱および長期暴露に対して感受性であり、C2C12細胞分化を好む可能性があります。トランスフェクションは血清の非存在下で行われるため、トランスフェクション後のインキュベーション時間は、早期分化を防ぐために迅速に血清含有培地を補給するために短く保たれた。ピューロマイシンをトランスフェクション後24時間の培地に添加し、ピューロマイシン耐性C2C12細胞の選択を開始した。分化したミオチューブにプラスミドDNAを導入する方法には、トランスフェクション(最大85%の効率が報告されている)、エレクトロポレーション、またはバイオスタスティックアプローチ23、24、25が含まれる。あるいは、誘導性shRNAプラスミドを収容する安定なC2C12細胞は、ミオチューブ分化の後期段階または筋管成熟時26の間に遺伝子をノックダウンするために生成され得る。
ここで説明した方法は、C2C12細胞におけるADAMTSL2の安定したノックダウンをもたらし、そこで筋管への分化中にその機能を決定することができる。安定したノックダウン細胞の生成は、筋管の形成または成熟中に誘導されるタンパク質の機能を研究するために特に重要である可能性があります。例えばsiRNAによる一過性トランスフェクションは、siRNAの一過性ノックダウン効果が5-7日後に離離れする可能性があるため、これらの遺伝子を効率的にノックダウンするのに十分ではないだろう。あるいは、CRISPR/Cas9を使用したECMタンパク質のノックアウトは技術的に難しく、個々のクローンを選択して配列決定して所望の遺伝子のノックアウトを確実にする必要があります。しかし、進化する試薬のラインはCRISPR/Cas9を将来の機能喪失実験に選ぶ方法をレンダリングする可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
D.H.は国立衛生研究所(国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所、NIAMS、助成金番号AR070748)と、レニ&ピーター・W・メイ整形外科、アイカーン医学部からの種子資金によって支援されています。シナイ山。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
- Tanzer, M. L.
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R.
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J.
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
