Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Stabil nedsättning av gener kodning extracellulära Matrix Proteiner i C2C12 Myoblast Cell Line med små hårnål (sh)RNA

Published: February 12, 2020 doi: 10.3791/60824
Automatic Translation
1, 1, 1
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Vi tillhandahåller ett protokoll för att stabilt slå ner gener som kodar extracellulära matrisproteiner (ECM) i C2C12-myoblaster med små hårnål (sh) RNA. Med inriktning på ADAMTSL2 som exempel beskriver vi metoderna för validering av knockdown-effektiviteten på mRNA-, protein- och cellnivå under C2C12-myoblast till myotubedifferentiering.

Abstract

Extracellulära matrisproteiner (ECM) är avgörande för skelettmuskulaturens utveckling och homeostas. Den stabila knockdown av gener kodning för ECM proteiner i C2C12 myoblaster kan tillämpas för att studera den roll som dessa proteiner i skelettmuskulaturutveckling. Här beskriver vi ett protokoll för att tömma ECM proteinET ADAMTSL2 som ett exempel, med hjälp av små hårnål (sh) RNA i C2C12 celler. Efter transfection av shRNA plasmids, stabila celler var batch-utvalda med puromycin. Vi beskriver vidare underhållet av dessa cellinjer och den fenotypiska analysen via mRNA-uttryck, proteinuttryck och c2C12-differentiering. Fördelarna med metoden är den relativt snabba generationen av stabila C2C12 knockdown celler och tillförlitlig differentiering av C2C12 celler i flerkärniga myotubes vid utarmning av serum i cellodlingsmediet. Differentiering av C2C12 celler kan övervakas av ljusa fält mikroskopi och genom att mäta uttrycksnivåerna av kanoniska markör gener, såsom MyoD, myogenin, eller myosin tung kedja (MyHC) som anger utvecklingen av C2C12 myoblast differentiering i myotubes. I motsats till den övergående nedsättningen av gener med små störande (si) RNA kan gener som uttrycks senare under C2C12-differentiering eller under myotube-mognad riktas mer effektivt genom att generera C2C12-celler som hugger shRNA. Begränsningar av metoden är en variation i knockdown effektivitet, beroende på de specifika shRNA som kan övervinnas genom att använda gen knockout strategier baserade på CRISPR /Cas9, samt potentiella off-target effekter av shRNA som bör beaktas.

Introduction

ECM-proteiner (Extracellular Matrix) ger strukturellt stöd för alla vävnader, medla cellcellkommunikation och bestämmer cellödet. Bildandet och dynamisk ombyggnad av ECM är därför avgörande för att upprätthålla vävnad och organ homeostas1,2. Patologiska varianter i flera gener kodning för ECM proteiner ger upphov till muskuloskeletala sjukdomar med fenotyper från muskeldystrofier till pseudomouscular bygga3,4. Till exempel, patogena varianter i ADAMTSL2 orsaka extremt sällsynta muskuloskeletala sjukdom geleophysic dysplasi, som presenterar med pseudomuskulära bygga, dvs en uppenbar ökning av skelettmuskulatur massa5. Tillsammans med genuttrycksdata hos mus och människor tyder detta på en roll för ADAMTSL2 i skelettmuskelutveckling eller homeostas6,7.

Protokollet som vi beskriver här har utvecklats för att studera den mekanism genom vilken ADAMTSL2 modulerar skelettmuskelutveckling och/eller homeostas i en cellkulturinställning. Vi slog knivhuggna ADAMTSL2 i murine C2C12 myoblast cellinjen. C2C12 myoblaster och deras differentiering i myotubes är en väl beskriven och allmänt använd cellodling modell för skelettmuskulatur differentiering och skelettmuskulatur bioteknik8,9. C2C12 celler går igenom distinkta differentiering steg efter serum tillbakadragande, vilket resulterar i bildandet av multinucleated myotubes efter 3−10 dagar i kultur. Dessa differentieringssteg kan övervakas tillförlitligt genom att mäta mRNA-nivåer av distinkta markörgener, såsom MyoD, myogenin eller myosin tung kedja (MyHC). En fördel med att generera stabila genknockdowns i C2C12 celler är att gener som uttrycks i senare stadier av C2C12 differentiering kan riktas mer effektivt, jämfört med övergående knockdown uppnås genom små-störande (si) RNA, som vanligtvis varar i 5−7 dagar efter transfection, och påverkas av transfection effektivitet. En andra fördel med protokollet som beskrivs här är den relativt snabba generationen av partier av C2C12 knockdown celler med puromycin urval. Alternativ, såsom CRISPR/Cas9-medierad genknockout eller isolering av primära skelettmuskulaturens prekursorer från mänskliga eller målbetingade möss är tekniskt mer utmanande eller kräver tillgång till patientmuskelbiopsier eller mål-gen bristfälliga möss, respektive. Men liknar andra cellkultur baserade metoder, det finns begränsningar i användningen av C2C12 celler som modell för skelettmuskulaturen cell differentiering, såsom tvådimensionella (2D) karaktär cellkultur set-up och bristen på in vivo mikromiljö som är avgörande för att upprätthålla odifferentierade skelettmuskulaturen föregångare celler10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbereda shRNA Plasmid DNA från Escherichia coli

  1. Generering av klonala bakteriekolonier som bär shRNA plasmids
    1. Få glycerollager av E. coli som transporterar målspecifika shRNA-plasmidoch en kontrollplasmid från kommersiella källor (Table of Materials).
      TRE olika shRNA plasmids användes, inriktning olika regioner i murine Adamtsl2 mRNA. En shRNA valdes ut för att rikta in sig på Adamtsl2-regionen (3'untranslated region) för att underlätta räddningsexperiment med uttrycksplasmid som omkodifierar rekombinant adamtsl2 eller enskilda ADAMTSL2-proteindomäner. Dessutom inkluderades en förvrängd shRNA-plasmid som en negativ kontroll. Detaljer om shRNA-sekvenserna finns i figur 1A.
    2. Tina shRNA-bakteriebeståndet vid rumstemperatur (RT). Överför 10 μl bakterielager på en Luria-Bertani (LB) agarplatta kompletterad med 100 μg/mL ampicillin (LB-Amp).
      OBS: LB-Amp plattor bereds genom autoklavning 1 L av LB medium (för 1 L: 10 g tryptone, 5 g jäst extrakt, 10 g NaCl, justera pH till 7,0) tillsammans med 12 g agar. Låt mediet svalna till ~50 °C och tillsätt ampicillin (lagerlösning: 50 mg/ml i sterilt vatten) till en slutlig koncentration av μg/ml (LB-Amp agar). Häll omedelbart ~20 ml LB-Amp agar i en 10 cm Petri skål och låt agarstelnar före användning. 1 L av LB-Amp agar är vanligtvis tillräckligt för att hälla ca 40 10 cm Petri rätter. Petriskålar som innehåller LB-Amp agar är stabila i minst en månad om de förvaras förseglat vid 4 °C i mörker.
    3. Sprid bakterier med steril adryga Spatel eller någon annan lämplig metod för att uppnå enstaka bakteriekolonier. Inkubera bakterieplattor upp och ner över natten vid 37 °C.
  2. Plasmid beredning
    1. Nästa morgon, ta bort Petri skålen med de enskilda bakteriekolonieroch lagra på 4 ° C för att undvika överväxt av bakteriekolonier och bildandet av satellitkolonier. Försegla Petriskålen om den förvaras över natten eller längre.
    2. På eftermiddagen, tillsätt 5 ml LB-Amp medium i en polypropylen bakteriell kultur rör. Välj en enda bakteriekoloni från Petriskålen som odlas över natten med en pipettspets och inokulera LB-Amp medium genom att mata ut pipettspetsen i det bakteriella odlingsröret som innehåller LB-Amp-mediet.
    3. Inkubera bakteriekulturen över natten i en shaker vid 250 rpm vid 37 °C med locket löst fäst för att möjliggöra vidtagning.
    4. Ta ut bakteriell odlingsrör nästa morgon och håll vid 4 °C för att undvika bakteriell överväxt. På eftermiddagen, resuspend bakterier genom virvlande och överföra 1 ml av natten bakteriell kultur i 50 ml LB-Amp medium i en 250 ml konisk kolv. Inkubera över natten i en shaker vid 250 rpm vid 37 °C.
    5. På nästa morgon, överföra bakterier till en 50 ml engångscentrifugrör och centrifugbakterier på 6.000 x g på RT i 15 min. Ta bort mediet och fortsätt med steg 1.2.6.
      OBS: Om plasmid DNA inte kan isoleras omedelbart, ta bort LB-Amp medium efter centrifugeringssteget och förvara bakteriepelleten vid -20 °C.
    6. Följ instruktionerna för plasmidberedningssats (midi-skala) för att extrahera plasmid-DNA från bakterierna. Utvärdera plasmid DNA-kvalitet genom att mäta A260/A280-förhållandet med hjälp av en spektrofotometer.
      OBS: En A260/ A280 förhållande av >1.8 är önskvärt, vilket indikerar hög renhet av plasmid DNA-preparatet. En lägre A260/A280 förhållande tyder kontaminering med protein eller otillräcklig borttagning av extraktionsreagenser. Ytterligare plasmidreningssteg kan krävas.

2. Odling och transfection av C2C12 Celler och Puromycin Urval

  1. C2C12 cellkultur
    1. Tina C2C12 celler(Table of Materials)snabbt i en 37 ° C vattenbad och häll celler i steril engångs15 ml centrifugrör som innehåller 8 mL av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) medium kompletteras med 100 enheter penicillin och streptomycin antibiotika (serumfri DMEM) i en cell kultur huva. Centrifugceller i 3 min vid 160 x g vid RT.
    2. Aspirera supernatant och resuspend cellpelleten i 10 ml serumfri DMEM kompletterad med 10% fetalt bovinserum (FBS) (komplett DMEM). Överför celler till 10 cm vävnadskulturbehandlade plasträtter. Inkubera celler i en fuktad inkubator vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
    3. På nästa dag, byt ut mediet med färska kompletta DMEM.
    4. Expandera c2C12-celler med låg passage på 3−4 10 cm rätter. När C2C12-cellerna når 50−60% sammanflödet, aspirera upp mellan- och skölj C2C12-cellerna med 10 ml fosfatbuffrad koks (PBS).
    5. Lägg till 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA och inkubera i 2 min på RT. Övervaka cellavlossning under mikroskop och förlänga inkubationstiden om det behövs, tills de flesta av cellerna är fristående.
      OBS: Försiktigt knacka skålen kan hjälpa till att rubba cellerna.
    6. När de flesta av cellerna är fristående, tillsätt 10 ml komplett DMEM till skålen, pipettupp och ner flera gånger, och överföra cellfjädring till en steril engångs15 ml centrifugrör. Centrifugceller för 3 min vid 160 x g vid RT. Aspirate supernatant och resuspend cellpelleten i 2 ml frysmedium (10% dimetylsulfoxid [DMSO]/90% FBS).
    7. Överför två 1 ml alikvoter per 10 cm maträtt i kryovialer. Inkubera i en cellisk behållare fylld med RT isopropanol i minst 24 timmar i en frys med -80 °C vilket resulterar i en fryshastighet på ca -1 °C per min för att undvika bildandet av iskristaller. Förvara celler för långvarig användning i ångfasen av flytande kväve.
      Leverantören rekommenderar att du använder C2C12-celler upp till passage nummer 15. Författarnas erfarenheter visade också att lägre passage nummerceller visade mer konsekvent och snabb differentiering i myotubes. Det är viktigt att upprätthålla C2C12 celler vid låg celldensitet (<50% sammanflödet) för att undvika för tidig ansättning av differentiering. Differentiera eller differentierade C2C12-celler kan inte återställas till det ursprungliga myoblasttillståndet och måste kasseras.
  2. Förbereda C2C12-celler för transfection
    1. Kultur odifferentierade C2C12 celler i en 10 cm maträtt tills de når 50−60% sammanflödet. Aspirera mediet, skölj C2C12 celler med 10 ml PBS, och tillsätt 1 ml 0,25% trypsin-EDTA. Inkubera i 2 min på RT, övervaka cellavlossning under mikroskop och vid behov förlänga inkubationstiden tills de flesta cellerna är fristående.
      OBS: Försiktigt knacka skålen kan hjälpa till att rubba cellerna.
    2. När de flesta av cellerna är fristående, tillsätt 10 ml komplett DMEM till skålen och överföra cellfjädring till en steril engångscentrifugeringsrör på 15 ml. Centrifugceller i 3 min vid 160 x g vid RT. Aspirate supernatant och resuspend cellpelleten i 4 ml komplett DMEM.
    3. Kombinera 10 μl cellfjädring med 10 μL trypanblå i ett 1,5 ml reaktionsrör, blanda genom att pipettera upp och ner och försiktigt snärta reaktionsröret och överföra cellerna till en räkningsbild. Bestäm cellnumret/ml:et med hjälp av en automatiserad cellräknare.
    4. Späd C2C12 celler till 50.000 celler/ml och utsäde 100.000 celler (2 ml) per brunn i en 6 brunnsplatta för att uppnå ca 40−50% sammanflödet efter natten inkubation. Inkubera celler i en fuktad inkubator vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
  3. Transfection av C2C12-celler med shRNA-plasmid med polyetomenfimin (PEI) och puromycin val
    1. Beredning av PEI-lagerlösning
      1. Lös upp 16 mg PEI i 50 ml sterilt destillerat vatten (koncentration av lagerlösning: 0,32 mg/ml) i en 50 ml glasmedieflaska med skruvlock. Inkubera lösningen vid 65 °C för 1 h och virvel lösningen kraftigt flera gånger under inkubationstiden för att helt lösa upp PEI.
      2. Justera till pH 8 genom att lägga till 15 μL 1N HCl per 50 ml.
        VARNING: HCl är frätande. Koncentrerad HCl ska hanteras under rökhuven. Utredarna bör bära lämplig personlig skyddsutrustning.
      3. Frys PEI-lösningen vid -80 °C för 1 h med löst fast lock och snabbt tina vid 37 °C i ett vattenbad för att ytterligare förbättra lösligheten. Upprepa frys-tina cykel 3x.
      4. Förvara PEI-lagerlösning i 0,5 ml alikvoter för engångsbruk vid -20 °C.
    2. Transfection av C2C12 celler
      1. Kombinera 25,5 μL (8,5 μL/μg plasmid DNA) i PEI-stamlösningen med 100 μL 25 mM NaCl i ett 1,5 ml reaktionsrör och inkubera i 5 min vid 37 °C. Kombinera 3 μg av plasmid-DNA med 100 μL 25 mM NaCl och inkubera i 5 min vid 37 °C.
      2. Kombinera hela volymen utspädd PEI-reagens med den utspädda plasmid och blanda genom att försiktigt pipetta upp och ner. Inkubera i 25 min vid 37 °C.
      3. Under inkubationstiden, ändra mediet för C2C12-cellerna avsedda för transfection till DMEM utan FBS eller antibiotika.
      4. Tillsätt PEI/DNA-transfection mix till C2C12 celler droppe för droppe och blanda ständigt genom att noggrant flytta cellodlingskålen. Inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Efter 6 h, ändra mediet till fullständig DMEM.
    3. Puromycin urval
      1. 24 h efter transfection, växla medium till markeringmedium (komplett DMEM plus 5 μg/ml puromycin). Fortsätt puromycin val tills puromycin-resistentA C2C12 celler erhålls, vilket vanligtvis tar 10−14 dagar.
      2. Expandera puromycinresistenta C2C12-celler vid låg celldensitet (<50−60% sammanflödet), dvs.
        OBS: Underhåll puromycinresistenta C2C12-celler i närvaro av 5 μg/ml puromycin för rutinmässig cellkultur och expansion. Puromycin utelämnades dock i differentieringsexperimenten.

3. Fenotypisk analys av C2C12 Differentiering

OBS: De metoder som beskrivs nedan kan enkelt anpassas för allmän fenotypisk analys av C2C12-myoblastdifferentiering till myorör genom att variera de specifika antikroppar som används i västerländsk blotting eller genspecifika primers som används i den kvantitativa polymerasen kedjereaktionsanalys (qPCR).

  1. C2C12 differentieringprotokoll och brightfield mikroskopi
    1. Frö 150.000 celler / väl i en 12 brunn tallrik. Kulturpuromycinresistenta C2C12 stabila celler i en 12 brunn sett i urvalsmedium i en fuktad inkubator vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Kultur C2C12 celler i komplett DMEM tills de når ~ 95% sammanflödet.
    2. För att inducera differentiering av C2C12 celler, ersätta komplett DMEM med serumfri DMEM (dag 0 av differentiering). Byt medium varannan dag och följ C2C12-myotubeformation med hjälp av ett inverterat ljust fältmikroskop med kamera.
      OBS: Många protokoll använder 2% häst serum för att skilja C2C12 celler i myotubes. I författarnas händer hade avlägsnandet av serumet helt en liknande effekt. Insulin beskrivs som en tillsats till cellodlingsmediet för att påskynda c2C12-differentiering. Men i det nuvarande protokollet, C2C12 celler tillförlitligt differentieras i myorör inom 3−5 dagar efter serum deprivation och tillsats av insulin ansågs onödigt.
  2. Myosin tung kedja (MyHC) immunostaining att visualisera myotubes
    1. Seed 50 000 puromycinresistenta C2C12-celler per kammare i en 8 brunnskammarbild i 500 μL komplett DMEM. Kulturceller tills de når 95% sammanflödet i komplett DMEM (ca 24 h).
    2. För att inducera differentiering, växla från komplett DMEM till 500 μL serumfri DMEM (dag 0 av differentiering). Vid önskad tidpunkt(er), sug upp mediet och skölj cellerna 3x med 0,5 ml PBS.
      OBS: Utför alla följande steg på RT.
    3. Fixa celler med 0,2 ml 4% paraformaldehyd (PFA) utspädda i PBS i 15 min. Skölj celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min vardera.
      VARNING: PFA är farligt. Vidta lämpliga försiktighetsåtgärder och kassera paraformaldehydlösning som farligt avfall.
    4. Släcka PFA med 0,2 ml 0,5 M glycin i PBS i 5 min. Skölj celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min vardera.
    5. Inkubera celler med 0,2 ml 0,1% icke-jonisk ytaktiva/tvättmedel (Table of Materials) i PBS i 10 min för att permeabilisera cellmembranet. Block med 0,2 ml 5% bovinserumalbumin i PBS för 1 h. Skölj celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min vardera.
    6. Inkubera celler med 0,2 ml MyHC antikroppar (1:200 i PBS) för 2 h. Skölj celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min vardera.
    7. Inkubera celler med 0,2 ml get-anti mus rhodamin rödkonjugerade sekundära antikroppar (1:200 i PBS). Skölj celler med 0,5 ml PBS 3x i 5 min vardera.
    8. Efter att ha tagit bort PBS kvantitativt, tillsätt en droppe monteringsmedium som innehåller 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) per kammare. Täckslip och härda monteringsmedium enligt tillverkarens anvisningar. Försegla med nagellack.
    9. Observera C2C12-celler med ett fluorescensmikroskop med rätt filteruppsättning.
  3. Bedömning av knockdown effektivitet genom kvantitativa realtid polymeras kedjereaktion (qRT-PCR)
    1. Kultur C2C12 celler under differentiering villkor i 12 väl plattor som beskrivs i avsnitt 3.1.
    2. Vid önskad tidpunkt(er), ta bort differentieringsmediet, skölj cellerna en gång med 1 ml PBS och tillsätt 0,5 ml RNA-extraktionsreagens (Materialbord)per brunn. Lyse cellerna genom att försiktigt pipetting upp och ner och överföra cell lysate till en steril 1,5 ml reaktionsrör. Isolera RNA genom att noggrant följa tillverkarens protokoll.
      VARNING: RNA extraktionsreagens innehåller fenol. Det bör användas under en rökhuva. Samla in rna-extraktionsreagensavfall och kassera som farligt avfall. Utredarna bör bära lämplig personlig skyddsutrustning.
    3. Lös upp den slutliga RNA-pelleten i 20 μL dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat vatten. Bestäm kvantiteten och kvaliteten på RNA-preparatet med hjälp av en spektrofotometer och bestäm A260/A280-förhållandet som kvalitetsmått.
      OBS: En typisk avkastning från 1 brunn av en 12 brunn sett är 5−7 μg totalt RNA med en A260/A280-förhållande på 1,8−2.
    4. För att smälta restco-renad genomisk genomisk DNA, späd 1 μg RNA i en total volym av 8 μl DEPC-behandlat vatten i ett PCR-rör. Tillsätt 1 μl 10x reaktionsbuffert och 1 μL DNase I (1 enhet/μL) (Materialtabell)och inkubera i 15 min vid RT. Tillsätt 1 μL stopplösning (25 mM EDTA) och inkubera vid 70 °C i 10 min.
    5. För att generera cDNA, kombinera 10 μl DNase behandlade RNA med 10 μL av 2x omvänd transkriptas master mix, som innehåller omvänd transkriptas, slumpmässiga primers, 4 mM dNTP mix (1 mM vardera av dATP, dTTP, dGTP och dCTP), och omvänd transkriptas reaktionbuffert. Inkubera reaktionen i en termocycler med hjälp av programmet enligt tillverkarens rekommendationer. Späd cDNA med vatten i ett 1:5-förhållande.
    6. För att förbereda qRT-PCR-reaktionen, kombinera 5 μL SYBR grön qPCR-mastermix med 0,5 μL genspecifika framåt- och backprimers (lager: 10 μM) respektive 2 μL DEPC-behandlat vatten per reaktion. Pipette qPCR reaktion i en brunn av en 96 brunn qRT-PCR platta och tillsätt 2 μL av utspädd cDNA. Ställ in tre tekniska replikat för varje biologisk replikat och inkludera en hushållningsgen som Gapdh eller Hprt1.
    7. Förstärka PCR-produkten med en qRT-PCR termocycler med hjälp av följande program: 50 °C för 2 min (uracil-DNA glycosylase [UDG] aktivering), 95 °C för 2 min (dual-lock DNA polymerasaktivering), 40 cykler av 95 °C för 15 s, 60 °C för 30 s och 72 °C i 1 min.
    8. Kvantifiera qRT-PCR resultat med DDCt-metoden normalisera till en hushållning gen, såsom Gapdh eller Hprt1.
  4. Bedömning av knockdown effektivitet genom västra blotting
    1. Seed 300.000 puromycin-resistenta C2C12 celler per brunn i en 6 brunn tallrik för västra blot analys. Efter 24 h, byt medium till serumfri DMEM för att initiera differentiering (dag 0 av differentiering).
    2. Vid önskad tidpunkt(er), samla två 1 ml serumfritt konditionerat medium i ett 1,5 ml reaktionsrör och centrifugi 5 min vid 500 x g vid RT för att ta bort fristående celler och cellskräp.
      OBS: Detta steg är endast nödvändigt om ECM proteiner eller andra utsöndrade proteiner i konditionerat medium undersöks. Om proteinet av intresse lokaliseras i cytoplasman eller är membranbunden, aspirera cellodlingsmediet och fortsätt med celllysstegen (3.4.7−3.4.12). Celllys ska utföras parallellt med proteinutfällningen från serumfritt konditionerat medium för att minimera proteolytisk nedbrytning och andra oavsiktliga konsekvenser av långvarig lagring av cellskiktet.
    3. Efter centrifugering, överför 1 ml konditionerat medium i ett nytt 1,5 ml reaktionsrör och fällningsproteiner genom att lägga till 0,391 ml av en blandning av trikloracetisk syra (TCA) och icke-jonisk ytaktiva/tvättmedel. Kort virvla blandningen och inkubera i 10 min på is.
      OBS: Förbered proteinutfällningsblandningen direkt före användning genom att kombinera 0,252 ml 55% TCA och 0,139 ml 1% icke-jonisk ytaktiva/tvättmedel per ml av konditionerat medium och virvel kort. Lösningen blir grumlig.
      VARNING: TCA är frätande och måste hanteras på lämpligt sätt.
    4. Pellet de fällda proteinerna vid >16 000 x g i 10 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
      VARNING: Supernatanten innehåller TCA och ska samlas in separat och kasseras som farligt material.
    5. Tvätta proteinpelleten 3x med iskallt aceton och centrifug varje gång på >16 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    6. Lufttorka proteinpelleten för 3−4 min vid RT och lös ess i 50 μL av 1x natrium dodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) provbuffert (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% glycerol och 0,004% bromophenol blå, kompletterad med 5% β-mercaptoetanol). Koka provet i 5 min vid 95 °C och använd för västerländsk blottning för att upptäcka önskat målprotein med hjälp av standardprocedurer.
      VARNING: β-Mercaptoetanol är illaluktande och giftig och måste hanteras i en rökhuva.
    7. För intracellulära och membranbundna proteiner, skölj celllagret en gång med 2 ml PBS.
    8. Lägg till 1 ml PBS och rubba celler genom att skrapa dem på brunnen med hjälp av en cellskrapa. Samla celler i ett 1,5 ml reaktionsrör och centrifugera vid 3 420 x g i 3 min vid 4 °C. Tvätta cellpelleten 3x med 1 ml PBS och centrifugera vid 3 420 x g i 3 min vid 4 °C varje gång.
    9. För att lyse cellerna, resuspend cellpelleten i 0,2 ml lysis buffert (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% natriumdeoxycholate, 2,5 mM natrium pyrofosfat, 1 mM β-glycerophosfat, och 1 mM natriumortoovanadate) kompletterad med 1x EDTA-fri protelisthämmare cocktailreaoch inkubera i 30 min på is.
    10. Ultraljudsultraljud för 15 s på is med en uteffektinställning på 10 vid en driftsfrekvens på 23 kHz.
    11. Ta bort cellskräp genom centrifugering vid 13 680 x g i 20 min vid 4 °C. Samla supernatant i en ny 1,5 ml reaktionsrör och bestämma proteinkoncentrationen med hjälp av en kommersiell Bradford analys eller någon annan lämplig metod.
    12. För varje prov, kombinera 100 μg protein med 5x SDS-PAGE provbuffert i en total volym på 60 μL och koka i 5 min vid 95 °C. Analysera prover efter vanliga västerländska blottningförfaranden för närvaron av önskat målprotein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Urval av puromycinresistenta C2C12 kan uppnås i 10−14 dagar efter transfection på grund av effektiv elimineringav icke-resistenta, dvs. Vanligtvis, mer än 80% av cellerna lossnafrån cellodlingskålen och dessa celler tas bort under rutinmässigt cellunderhåll. Puromycinresistenta C2C12 celler som uttrycker kontrollen (kodade) shRNA behålla spindelformen, långsträckt cellmorfologi vid låg celldensitet och förmågan att skilja sig till myorör. C2C12 differentiering vid serum tillbakadragande kan övervakas av ljusa fält mikroskopi och genom immunfärgning för myotube markör myosin tung kedja (MyHC) (Figur 2). MyHC-positiva myotubes observeras mellan 3−5 dagar efter differentieringsinitiering. Myotubes är multinucleated som framgår av förekomsten av mer än en DAPI-positiv kärna inom MyHC-positiva cellgränser. Bild 3A visar ljusa fältbilder av stabila C2C12-celler som odlas i komplett dmem. Den dominoeffektivitet som presenteras här varierar från 40−60%(figur 3B). Eftersom mRNA skördades i proliferativt tillstånd där lilla Adamtsl2 uttrycks, verkar knockdown-effektiviteten låg, men knockdown-effektiviteten förväntas bli större vid senare tidpunkt under C2C12-differentiering, där endogen adamtsl2 framkallas och uttrycks på thus på mycket högre nivåer. Western blot analys bekräftade framgångsrik knockdown av ADAMTSL2 i celllysaren erhållits från C2C12 celler stabilt uttrycka shRNA 3086 jämfört med kontroll shRNA(figur 3C).

Figure 1
Figur 1: Val av stabila C2C12-celler efter transfection med shRNA-kodning plasmid DNA. (A)Tabell som visar målområdet (CDS, kodningssekvens; 3'-UTR, 3'-untranslated region), klon-ID (nedan kallat 1977, 3086 och 972) och sekvens en av de shRNAs som används för att rikta Adamtsl2. (B)Panelerna visar valet av C2C12-celler som transfected med kontrollshRNA och de tre Adamtsl2-inriktningshRNAs. C2C12 celler transfected med shRNA plasmider och puromycin lades till mediet efter 24 h. Puromycin-känsliga celler visas runt och så småningom lossna r rutin cellkultur underhåll (röda pilar). Däremot puromycin-resistenta celler hysa integrerade shRNA plasmider verkar spindel-formad, något långsträckt, bifogad och livskraftig (blå pilar). Skala barer = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: C2C12 myoblast till myotube differentiering. Ljusa fältbilder av differentierade C2C12-celler visar tätt kullerstensutseende av cellerna i början av differentieringen (dag 0−1) och multinucleated myotubes observerades efter dag 5 (övre raden). Immunostaining av differentieraC2C12 celler med myosin tung kedja (MyHC, röd), som är en markör för myotubes, induceras på dag 3 av differentiering (mitten panel). Nuclei färgades med DAPI och den sammanslagna bilden visas i de nedre panelerna. Skala barer = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Validering av stabil nedsättning i förökningav C2C12-celler. (A) Ljusa fältbilder av stabila C2C12 celler odlade i komplett DMEM. Skalstänger = 300 μm. (B) qRT-PCR-analys av Adamtsl2 mRNA-uttryck i stabila C2C12-celler. Ct värden normaliserades till hushållning genen Hprt1. mRNA skördades före uppkomsten av differentiering. Felstaplar representerar standardavvikelse. (C)Western blot analys som visar minskat ADAMTSL2 protein i celllysate/ECM fraktion från C2C12 celler stabilt uttrycker shRNA 3086. Endogen adamtsl2 upptäcktes med hjälp av en skräddarsydd polyklonal peptidantikropp (finns på begäran). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver här ett protokoll för en stabil nedsättning av ECM proteiner i C2C12 myoblasts och för fenotypiskanalys av differentiering av C2C12 myoblaster i myotubes. Flera faktorer avgör resultatet av experimentet och måste övervägas noggrant. Att underhålla C2C12-celler i den växande fasen är ett viktigt steg för att hålla C2C12-cellerna i myoblastprekursortillståndet. Att behålla C2C12-cellernas förmåga att konsekvent skilja åt i myorör beror på i) cellernas passagenummer, ii) tätheten av de odlade cellerna under rutinmässigt underhåll, och iii) näringstillgänglighet, vilket kräver frekvent och regelbunden påfyllning av cellodlingsmediet11,12,13. På grund av några okända mekanismer, högre passage nummer C2C12 celler förlorar också potentialen för ytterligare myoblast fusion11. Instruktionerna från leverantören av C2C12-cellerna tyder på att dessa celler upprätthålls upp till passage nummer 15. Därefter kan differentieringspotentialen minskas och experiment med sådana celler kan resultera i mindre konsekvent myotubebildning. Å andra sidan kan celltätheten under underhåll resultera i liknande effekter9. Nå confluent C2C12 celltätheter under rutinmässig cellkultur främja inledandet av C2C12 hjärtinfarkt differentiering och därmed kan negativt påverka differentiering potential cellpopulationen. Därför är det av avgörande betydelse att förhindra C2C12 celler från att nå hög cell tätheter under rutinmässigA C2C12 cell underhåll. Detta kan uppnås genom redan subodling C2C12 celler vid låga celltätheter (<50−60% sammanflödet). Serum svält används för att inducera C2C12 cell differentiering i myotubes. Därför, upprätthålla celler under längre tider utan att fylla på medium allvarligt avgas närings-och serumnivåer. Fylla på med färskt serum som innehåller medium minst varannan dag kan förhindra uppkomsten av oönskad etiolikdifferentiering på grund av näringsämne och serumbrist.

C2C12 differentiering induceras vanligtvis av serumsvält. Andelen serum som används för att inducera C2C12 differentiering kan kraftigt påverka resultaten, särskilt den tid det tar att bilda MyHC positiva myotubes14,15. Flera protokoll visar framgångsrik induktion av differentiering under olika serumkoncentrationer. Användning av 2−10% FBS eller hästserum och fullständig serumbrist har rapporterats och alla förhållanden resulterar i C2C12-myotube-bildning. Serumprocenten eller förändringen i serumpartiet kan avsevärt ändra markörer för differentiering. Dessutom kan serumkällan påverka det experimentella utfallet, eftersom ursprungslandet kan tillåta eller inte tillåta vissa tillsatser under produktionen av serum i nötkreatur8. Serumnivån kan justeras för att uppnå differentieringshastigheten enligt specifika experimentella krav. Insulin kan läggas till odlingsmediet för C2C12 celler för att påskynda differentiering och myotube bildning16.

Förmågan att leverera plasmider som omkodar shRNA eller rekombinanta proteiner i C2C12-celler via transfection är ett attraktivt inslag i C2C12-celler. Flera kommersiella liposome-baserade transfection reagenser har använts tidigare för att leverera plasmid DNA i C2C12 celler med variabel rapporterade transfection effektivitetsvinster17,18,19,20,21. PEI visar också rimlig transfection effektivitet och är ett kostnadseffektivt alternativ till liposome-baserade transfection reagenser. En jämförelse mellan transfection med en kommersiell liposome-baserade transfection reagens och PEI visade ingen betydande förändring i transfection effektivitet och något högre effektivitet hittades med PEI22. I våra händer var transfection effektivitet med PEI tillräcklig för att generera stabil puromycin-resistentA C2C12 celler. Men ett kritiskt steg i detta protokoll är att hålla inkubationstiden för transfection reagens kort. Som nämnts ovan, C2C12 celler är känsliga för serum tillbakadragande och långvarig exponering för låga serum villkor under transfection kan gynna C2C12 cell differentiering. Eftersom transfection utförs i avsaknad av serum, inkubationstiden efter transfection hölls kort för att leverera snabbt serum-innehållande medium för att förhindra tidig differentiering. Puromycin lades till kulturmediet 24 h efter transfection för att initiera valet av puromycinresistenta C2C12 celler. Metoder för att införa plasmid DNA i differentierade myorör inkluderar transfection (upp till 85% effektiv rapporterade), elektroporation, eller en biolistic strategi23,24,25. Alternativt kan stabila C2C12-celler som hyser en inducible shRNA plasmid genereras för att slå ner gener i senare skeden av myotube differentiering eller under myotube mognad26.

Den metod som beskrivs här resulterade i en stabil nedsättning av ADAMTSL2 i C2C12-celler där dess funktion under differentiering till myorör nu kan fastställas. Generering av stabila knockdown celler kan vara särskilt viktigt att studera funktionen av proteiner som induceras under myotubebildning eller mognad. Övergående transfection med siRNA till exempel skulle inte vara tillräcklig för att effektivt knockdown dessa gener, eftersom den övergående knockdown effekten av siRNA kan avvänja efter 5−7 dagar. Alternativt är knockout av ett ECM-protein med CRISPR/Cas9 tekniskt mer utmanande och enskilda kloner måste väljas och sekvenseras för att säkerställa knockout av önskad gen. Den framväxande raden av reagenser kan dock göra CRISPR/Cas9 till den metod för valning för funktionsbefrielseexperiment i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

D.H. stöds av National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, bidragsnummer AR070748) och utsädesfinansiering från Leni & Peter W. Maj Institutionen för ortopedi, Icahn School of Medicine på Mt. Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Tags

Genetik ADAMTS proteaser ADAMTS-liknande proteiner C2C12 myoblaster extracellulär matris skelettmuskulaturdifferentiering myogenesis shRNA
Stabil nedsättning av gener kodning extracellulära Matrix Proteiner i C2C12 Myoblast Cell Line med små hårnål (sh)RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. … More

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter