Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Стабильный нокдаун генов, кодирующих внеклеточные матричные белки в линии клеток C2C12 Myoblast с использованием мелковолосой (ш)РНК

Published: February 12, 2020 doi: 10.3791/60824
Automatic Translation
1, 1, 1
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Мы предоставляем протокол, чтобы запоздало сбить гены, кодирующие внеклеточные матричные белки (ECM) в миобластах C2C12 с использованием мелковолосой (ш) РНК. Ориентируясь на ADAMTSL2 в качестве примера, мы описываем методы проверки эффективности нокдауна на мРНК, белке и клеточном уровне во время дифференциации C2C12 myoblast к дифференциации миотуста.

Abstract

Внеклеточные матальные белки (ECM) имеют решающее значение для развития скелетных мышц и гомеостаза. Стабильный нокдаун генов кодирования для белков ECM в миобластах C2C12 может быть применен для изучения роли этих белков в развитии скелетных мышц. Здесь мы описываем протокол для истощения белка ECM ADAMTSL2 в качестве примера, используя мелкошерстную РНК (ш) в клетках C2C12. После трансфекции плазмид shRNA, стабильные клетки были отображаются с помощью пуромицицина. Мы далее описываем поддержание этих клеточных линий и фенотипический анализ с помощью экспрессии мРНК, экспрессии белка и дифференциации C2C12. Преимуществами метода являются относительно быстрое поколение стабильных клеток c2C12 нокдауна и надежная дифференциация клеток C2C12 на многоядерные миотубины при истощении сыворотки в среде клеточной культуры. Дифференциация клеток C2C12 может контролироваться с помощью яркой полевой микроскопии и путем измерения уровня экспрессии генов канонических маркеров, таких как миод, миогенин или миозин тяжелой цепи (MyHC), указывающие на прогрессирование дифференциации миобластов C2C12 в миотусы. В отличие от преходящих генов с мелкоинтерферирующей (si) РНК, гены, которые выражаются позже во время дифференциации C2C12 или во время созревания миотубетов, могут быть направлены более эффективно, генерируя клетки C2C12, которые постоянно выражают шРНК. Ограничения метода являются изменчивость в нокдаун эффективности, в зависимости от конкретных shRNA, которые могут быть преодолены с помощью стратегии нокаутгена на основе CRISPR / Cas9, а также потенциальные вне целевых эффектов shRNA, которые должны быть рассмотрены.

Introduction

Внеклеточные матричные белки (ECM) обеспечивают структурную поддержку всех тканей, опосредули клеточную связь и определяют судьбу клеток. Формирование и динамическая ремоделирование ECM, таким образом, имеет решающее значение для поддержания ткани и органа гомеостаза1,2. Патологические варианты в нескольких генах кодирования для белков ECM приводят к нарушениям опорно-двигательного опорно-двигательного опорно-двигательного опорно-двигательного опорно-двигательного опере, с фенотипами от мышечной дистрофии до псевдомускулярной сборки3,4. Например, патогенные варианты в ADAMTSL2 вызывают крайне редкое опорно-двигательного расстройства гелеофизики дисплазии, которая представляет собой псевдомышечное строительство, т.е. явное увеличение массы скелетноймышцы 5. Вместе с данными экспрессии генов в мышах и людях, это предлагает роль для ADAMTSL2 в развитии скелетных мышц или гомеостаза6,7.

Протокол, который мы описываем здесь, был разработан для изучения механизма, с помощью которого ADAMTSL2 модулирует развитие скелетных мышц и/или гомеостаза в обстановке клеточной культуры. Мы stably сбил ADAMTSL2 в линии клеток murine C2C12 myoblast. C2C12 myoblasts и их дифференциации в миотубебии является хорошо описанной и широко используемой модели клеточной культуры для деления скелетных мышц и биоинженерии скелетных мышц8,9. Клетки C2C12 проходят различные этапы дифференциации после отмены сыворотки, что приводит к образованию многоядерных миотубеб после 3–10 дней в культуре. Эти шаги дифференциации можно надежно контролировать путем измерения уровней мРНК различных генов маркеров, таких как миод, миогенин, или миозин тяжелой цепи (MyHC). Одним из преимуществ генерации стабильных генных нокдаунов в клетках C2C12 является то, что гены, которые выражаются на более поздних стадиях дифференциации C2C12, могут быть направлены более эффективно, по сравнению с переходным нокдауном, достигнутым мелкой интерферирующей (si) РНК, которая обычно длится 5–7 дней после трансфекции, и зависит от эффективности трансфекции. Вторым преимуществом протокола, как описано здесь, является относительно быстрое поколение партий клеток нокдауна C2C12 с использованием выбора пуромицина. Альтернативы, такие как CRISPR/Cas9-опосредованный ген нокаут или изоляция первичных прекурсоров клеточных клеток скелетных мышц от человеческих или целевых генов недостаточно мышей технически более сложнымили или требуют наличия биопсии мышц пациента или целевого гена недостаточно мышей, соответственно. Однако, подобно другим подходам, основанным на культуре клеток, существуют ограничения в использовании клеток C2C12 в качестве модели для дифференциации скелетных мышечных клеток, таких как двумерный (2D) характер настройки клеточной культуры и отсутствие микроокружения in vivo, которая имеет решающее значение для поддержания недифференцированных клеток прекурсоров скелетных мышц10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка шРНК Плазмид ДНК из Escherichia палочки

  1. Поколение клональных бактериальных колоний, несущих плазмиды шРНК
    1. Получить глицерол запасов кишечной палочки проведения целевых конкретных плазмидов shRNA и контроля плазмида из коммерческих источников (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных плазмиды shRNA были использованы, ориентированные на различные области мурина Адамцл2 мРНК. Одна шРНК была выбрана для целевой 3'-непереведенного региона (3'UTR) Adamtsl2 для облегчения спасательных экспериментов с выражением плазмидов, кодирующих рекомбинантные полнометражные ADAMTSL2 или отдельные белковые домены ADAMTSL2. Кроме того, в качестве отрицательного контроля была включена плазмида шРНК. Подробная информация о последовательности shRNA приведена на рисунке 1A.
    2. Оттепель shRNA бактериального глицерола бульон при комнатной температуре (RT). Передача 10 л бактериального бульона глицерола на агарную пластину Лурия-Бертани (LB) дополнена 100 мкг/мл ампициллин (LB-Amp).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЛАСТИНы LB-Amp готовятся путем автоматического автоматического отвлечения 1 л лб среды (для 1 л: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, отрегулируйте рН до 7,0) вместе с 12 г агара. Дайте среде охладиться до 50 градусов по Цельсию и добавить ампициллин (запасраствор: 50 мг/мл в стерильной воде) к конечной концентрации мкг/мл (LB-Amp agar). Немедленно залить 20 мл агара LB-Amp в 10 см Петри блюдо и пусть агар затвердеть перед использованием. 1 L из LB-Amp агар, как правило, достаточно, чтобы залить около 40 10 см Петри блюда. Петри блюда, содержащие LB-Amp агар являются стабильными, по крайней мере один месяц, если храниться запечатаны при 4 градусах в темноте.
    3. Распространение бактерий с стерильным шпателем Drygalski или любой другой подходящий метод для достижения отдельных бактериальных колоний. Инкубировать бактериальные пластины вверх дном ночь при 37 градусах Цельсия.
  2. Плазмидный препарат
    1. На следующее утро, удалить чашку Петри с отдельными бактериальными колониями и хранить при 4 градусах Цельсия, чтобы избежать разрастания бактериальных колоний и формирования спутниковых колоний. Печать чашку Петри, если хранится на ночь или дольше.
    2. Во второй половине дня, добавить 5 мл LB-Amp среде в полипропиленовой бактериальной культуры трубки. Выберите одну бактериальную колонию из чашки Петри, культивируемой на ночь с наконечником пипетки и привить LB-Amp среде путем выброса кончика пипетки в бактериальной культуре трубки, содержащей LB-Amp среде.
    3. Инкубировать бактериальной культуры на ночь в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия с крышкой свободно прилагается, чтобы обеспечить аэрацию.
    4. Выняйте бактериальной культуры трубки на следующее утро и держать на 4 кВ, чтобы избежать бактериального разрастания. Во второй половине дня, resuspend бактерий путем вихря и передачи 1 мл ночной бактериальной культуры в 50 мл LB-Amp среды в 250 мл конической колбы. Инкубировать на ночь в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
    5. На следующее утро, передача бактерий в 50 мл одноразовых центрифуг и центрифугбактерий на 6000 х г на RT в течение 15 мин. Удалить среду и продолжить с шагом 1.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмид ДНК не может быть изолирована сразу, удалить LB-Amp среде после шага центрифугации и хранить гранулы бактерий при -20 градусов по Цельсию.
    6. Следуйте инструкциям для плазмид подготовки комплект (миди масштаба) для извлечения плазмид ДНК из бактерий. Оцените качество плазмидной ДНК, измерив соотношение A260/A280 с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: A260/A280 соотношение йgt;1.8 желательно, что свидетельствует о высокой чистоте плазмидной подготовки ДНК. Более низкое соотношение A260/A280 предполагает загрязнение белком или недостаточное удаление ректиров. Возможны дополнительные меры по очистке плазмида.

2. Культирование и трансфекция клеток C2C12 и выбор пуромицина

  1. C2C12 клеточная культура
    1. Оттепель C2C12 клеток(Таблица материалов) быстро в 37 кс водяной бане и залить клетки в стерильной одноразовой 15 мл центрифуги трубки, содержащей 8 мл модифицированного Орел Dulbecco среднего (DMEM) средний дополнен 100 единиц пенициллина и стрептомицина антибиотиков (безсырей DMEM) в клеточной культуре. Центрифуги клетки в течение 3 мин при 160 х г на RT.
    2. Аспирный супернатант и resuspend клеточной гранулы в 10 мл без сыворотки DMEM дополнены 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) (полный DMEM). Передача клеток на 10 см тканевой культуры обработанной пластиковой посудой. Инкубировать клетки в увлажненный инкубатор при 37 градусах По Цельсию в 5% CO2 атмосфере.
    3. На следующий день замените носитель свежим полным DMEM.
    4. Расширьте низкий проход C2C12 клеток на 3-4 10 см блюд. Когда клетки C2C12 достигают 50-60% слияния, аспирируйте средние и промкалывая клетки C2C12 с 10 мл фосфатно-буферного соливого (PBS).
    5. Добавьте 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубировать в течение 2 мин на RT. Монитор отслоение клеток под микроскопом и продлить время инкубации, если это необходимо, пока большинство клеток отделяются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно нажав блюдо может помочь выбить клетки.
    6. Когда большинство клеток отделены, добавить 10 мл полного DMEM к блюду, pipette объем вверх и вниз несколько раз, и передать подвеску ячейки в стерильной одноразовой 15 мл центрифуги трубки. Центрифуги клетки в течение 3 мин при 160 х г на RT. Аспират супернатант и resuspend клеточной гранулы в 2 мл замораживания среды (10% диметил сульфоксид (DMSO) / 90% FBS).
    7. Перенесите два аликвота 1 мл на 10 см в кривиалах. Инкубировать в контейнере для замораживания клеток, наполненном RT изопропанолом, по крайней мере 24 ч в морозильной камере -80 градусов, что приводит к замораживанию около -1 градусов по Цельсию за минуту, чтобы избежать образования кристаллов льда. Хранить клетки для длительного использования в фазе пара жидкого азота.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщик рекомендует использовать ячейки C2C12 до прохождения no 15. Опыт авторов также показал, что нижний проход число клеток показали более последовательной и быстрой дифференциации в миотубайс. Важно поддерживать клетки C2C12 при низкой плотности клеток (Злт;50% слияние), чтобы избежать преждевременного начала дифференциации. Дифференцированные или дифференцированные клетки C2C12 не могут быть возвращены в исходное состояние миобласта и должны быть отброшены.
  2. Подготовка клеток C2C12 к трансфекции
    1. Культура недифференцированных c2C12 клеток в 10 см блюдо, пока они не достигнут 50-60% слияния. Аспирируйте средние, промыть C2C12 клетки с 10 мл PBS, и добавить 1 мл 0,25% трипсин-EDTA. Инкубировать в течение 2 мин на RT, контролировать отслоение клеток под микроскопом, и продлить время инкубации, если это необходимо, пока большинство клеток отделяются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно нажав блюдо может помочь выбить клетки.
    2. Когда большинство клеток отделены, добавьте 10 мл полного DMEM к блюду и перенесите суспензию клетки в стерильную одноразовую центрифугу 15 мл. Центрифуги клетки в течение 3 мин при 160 х г на RT. Аспират супернатант и resuspend клетки гранулы в 4 мл полного DMEM.
    3. Смешайте 10 злику клеточной подвески с 10 злитровым синим в 1,5 мл реакционной трубки, смешайте путем трубопроката вверх и вниз и тщательно щелкните реакционной трубкой и перенесите ячейки на обратный слайд. Определите номер ячейки/мл с помощью автоматизированного счетчика ячейки.
    4. Разбавить клетки C2C12 до 50 000 клеток/мл и семян 100 000 клеток (2 мл) на скважину в 6 скважине, чтобы достичь слияния около 40-50% после ночного инкубации. Инкубировать клетки в увлажненный инкубатор при 37 градусах По Цельсию в 5% CO2 атмосфере.
  3. Трансфекция клеток C2C12 с плазмидом шРНК с использованием полиэтиленина (PEI) и выбора пуромицина
    1. Подготовка акционерного решения PEI
      1. Растворите 16 мг PEI в 50 мл стерильной дистиллированной воды (концентрация бульонного раствора: 0,32 мг/мл) в стеклянной бутылке для средств массовой информации объемом 50 мл с винтовой крышкой. Инкубировать раствор при 65 градусах по Цельсию на 1 ч и вихрь раствор энергично несколько раз в инкубационный период, чтобы полностью растворить PEI.
      2. Отрегулируйте к pH 8 путем добавлять 15 зл 1N HCl в 50 mL.
        ВНИМАНИЕ: HCl коррозионный. Концентрированный HCl должен быть обработан под капотом дыма. Следователи должны носить соответствующее средства индивидуальной защиты.
      3. Заморозить раствор PEI при -80 градусов по Цельсию на 1 ч с слабо прикрепленной крышкой и быстро оттаять при 37 градусах Цельсия в водяной бане для дальнейшего повышения растворимости. Повторите цикл замораживания-оттепели 3x.
      4. Храните PEI биржевое решение в 0,5 мл aliquots для одноразового использования при -20 градусах Цельсия.
    2. Трансфекция клеток C2C12
      1. Объедините 25,5 л (8,5 л/мкг плазмидной ДНК) из стоесвоего стоек запаса PEI со 100 мл 25 мМ NaCl в реакционной трубке 1,5 мл и инкубируйте в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Смешайте 3 мкг плазмидной ДНК со 100 зл и 25 мМ NaCl и инкубируйте в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
      2. Смешайте весь объем разбавленного реагента PEI с разбавленной плазмидой и смешайте, аккуратно прокладывая вверх и вниз. Инкубировать в течение 25 мин при 37 градусах Цельсия.
      3. Во время инкубации, изменить среду C2C12 клеток, предназначенных для трансфекции на DMEM без FBS или антибиотиков.
      4. Добавьте смесь трансфекции PEI/ДНК в клетки C2C12, капля за каплей, и постоянно смешивайте, тщательно перемещая блюдо клеточной культуры. Инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия в 5% co2 атмосфере. После 6 ч измените среду для завершения DMEM.
    3. Выбор пуромицина
      1. 24 ч после трансфекции, переключитесь на среду выбора (полный DMEM плюс 5 мкг/мл пуромицин). Продолжайте отбор пуромицина до тех пор, пока не будут получены устойчивые к пуромицину клетки C2C12, что обычно занимает 10–14 дней.
      2. Расширьте устойчивые к пуромицину c2C12 клетки при низкой плотности клеток (злт;50-60% слияния), т.е. для поддержания недифференцированного состояния и криоконсервации 6–10 флаконов для будущих экспериментов, описанных в шагах 2.1.4–2.1.7.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание пуромицин-устойчивых клеток C2C12 в присутствии 5 мкг/мл пуромицин для обычной культуры клеток и расширения. Тем не менее, пуромицин был опущен в экспериментах дифференциации.

3. Фенотипический анализ дифференциации C2C12

ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные ниже, могут быть легко адаптированы для общего фенотипического анализа дифференциации миобластов C2C12 в миотубеты путем изменения специфических антител, используемых в западной промоулянья или генконкретных грунтов, используемых в количественной полимеразе анализ цепной реакции (qPCR).

  1. Протокол дифференциации C2C12 и ярко-полевая микроскопия
    1. Семя 150000 клеток / хорошо в 12 хорошо пластины. Культура пуромицин-устойчивых C2C12 стабильных клеток в 12 хорошо пластины в среде отбора в увлажненный инкубатор при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 атмосфере. Культура C2C12 клетки в полном DMEM, пока они не достигнут 95% слияния.
    2. Чтобы вызвать дифференциацию клеток C2C12, замените полный DMEM сыворотки без DMEM (день 0 дифференциации). Изменение среды каждые два дня и следовать C2C12 миотус формирования с помощью перевернутого яркого поля микроскоп с камерой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многие протоколы используют 2% лошадистысы сыворотки, чтобы дифференцировать c2C12 клеток в миотубебии. В руках авторов, удаление сыворотки полностью оказаланалогичный эффект. Инсулин описывается как добавка к среде клеточной культуры для ускорения дифференциации C2C12. Тем не менее, в текущем протоколе, C2C12 клетки надежно дифференцированы в миотубевы в течение 3-5 дней после лишения сыворотки крови и добавление инсулина было сочтено ненужным.
  2. Миозин тяжелой цепи (MyHC) иммуно-пятно для визуализации миотубевейс
    1. Семена 50000 пуромицин-устойчивых C2C12 клеток на камеру в 8 хорошо камеры слайд в 500 л полного DMEM. Культурные клетки до тех пор, пока они не достигнут 95% слияния в полном DMEM (около 24 ч).
    2. Чтобы вызвать дифференциацию, переключитесь с полного DMEM на 500 л dMEM без сыворотки (день 0 дифференциации). В нужное время (ы), аспирировать средние и промыть клетки 3x с 0,5 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги на RT.
    3. Исправьте клетки с 0,2 мл 4% параформальдегида (PFA), разбавленного в PBS в течение 15 мин. Промыть клетки с 0,5 мл PBS 3x на 5 мин каждый.
      ВНИМАНИЕ: PFA является опасным. Примите соответствующие меры предосторожности и отбросьте раствор параформальдегида в качестве опасных отходов.
    4. Утолить PFA с 0,2 мл 0,5 м глицина в PBS в течение 5 мин. Промыть клетки с 0,5 мл PBS 3x на 5 мин каждый.
    5. Инкубировать клетки с 0,2 мл 0,1% неионических сурфактант / моющее средство (Таблица материалов) в PBS в течение 10 мин, чтобы проницать клеточной мембраны. Блок с 0,2 мл 5% бычьей сыворотки альбумина в PBS для 1 ч. Промыть клетки с 0,5 мл PBS 3x на 5 мин каждый.
    6. Инкубировать клетки с 0,2 мл антител MyHC (1:200 в PBS) для 2 ч. Промыть клетки с 0,5 мл PBS 3x на 5 мин каждый.
    7. Инкубировать клетки с 0,2 мл козьего-анти-мыши родамин красно-конъюгированных вторичных антител (1:200 в PBS). Промыть клетки с 0,5 мл PBS 3x на 5 мин каждый.
    8. После удаления PBS количественно, добавить одну каплю монтажа среды, содержащей 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) на камеру. Coverslip и вылечить монтаж среды в соответствии с инструкциями производителя. Печать с лаком для ногтей.
    9. Наблюдайте клетки C2C12 с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего набора фильтров.
  3. Оценка эффективности нокдауна с помощью количественной реакции полимеразы в реальном времени (qRT-PCR)
    1. Культура C2C12 клеток в условиях дифференциации в 12 пластин, как описано в разделе 3.1.
    2. В нужное время (ы), удалить дифференциациисреды,промыть клетки один раз с 1 мл PBS, и добавить 0,5 мл реагента экстракции РНК ( Таблица материалов ) в скважине. Лизет клетки, тщательно пипетки вверх и вниз и передачи лизата клетки стерильной 1,5 мл реакционной трубки. Изолировать РНК, тщательно следуя протоколу производителя.
      ВНИМАНИЕ: Реагент экстракции РНК содержит фенол. Его следует использовать под капотом дыма. Сбор РНК добычи реагентов отходов и утилизировать в качестве опасных отходов. Следователи должны носить соответствующее средства индивидуальной защиты.
    3. Растворите окончательный гранулы РНК в 20 зл диэтил-пирокарбонат (DEPC) обработанной воды. Определить количество и качество подготовки РНК с помощью спектрофотометра и определить соотношение A260/A280 в качестве меры качества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная урожайность от 1 скважины из 12 пластины скважины составляет 5-7 мкг общей РНК с соотношением A260/A280 1,8 х 2.
    4. Чтобы переварить остаточную совместно очищенную геномную ДНК, разбавьте 1 мкг РНК в общем объеме 8 злиц очищенной DEPC воды в трубке ПЦР. Добавьте 1 кЛ 10-кратного буфера реакции и 1 кЛ DNase I (1 единица/л)(Таблица материалов)и инкубировать в течение 15 мин. Добавить 1 кЛ стоп-раствора (25 мМ EDTA) и инкубировать при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
    5. Для создания cDNA, объединить 10 л DNase обработанных РНК с 10 зл 2x обратной транскриптазы мастер смеси, содержащие обратную транскриптазу, случайные грунтовки, 4 мМ dNTP смесь (1 мМ каждый из dATP, dTTP, dGTP, и dCTP), и обратный буфер реакции транскриптазы. Инкубировать реакцию в термоцикле, используя программу в соответствии с рекомендацией производителя. Разбавить кДНК водой в соотношении 1:5.
    6. Для подготовки реакции qRT-PCR, объедините 5 qL sYBR зеленый qPCR мастер смеси с 0,5 л гена конкретных вперед и обратный грунтовки (запас: 10 мкм), соответственно, и 2 Зл DEPC-обработанной воды на реакцию. Реакция Pipette qPCR в одном колодце пластины qRT-PCR и добавить 2 злиц разбавленной кДН. Настроили три технических репликата для каждой биологической репликации и включите ген домашнего хозяйства, такой как Gapdh или Hprt1.
    7. Усилируйте продукт ПЦР термоциклом qRT-PCR, используя следующую программу: 50 градусов по Цельсию на 2 мин (активация уракила-ДНК гликосилазы) и 95 градусов по Цельсию за 2 мин (активация полимеразы двойного замка), 40 циклов по 95 градусов по Цельсию на 15 с, 60 градусов по Цельсию на 30 с и 72 градуса.
    8. Количественные результаты qRT-PCR с использованием метода DDCt нормализации для домашнего гена, таких как Gapdh или Hprt1.
  4. Оценка эффективности нокдауна по западным промотированием
    1. Семена 300000 пуромицин-устойчивых c2C12 клеток на хорошо в 6 хорошо пластины для западного анализа подись. После 24 ч, изменить средний на сыворотки без DMEM инициировать дифференциацию (день 0 дифференциации).
    2. В нужное время (ы), собрать два 1 мл без сыворотки кондиционированной среде в 1,5 мл реакционную трубку и центрифугу в течение 5 минут при 500 х г на RT, чтобы удалить отдельные клетки и мусор клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только в том случае, если исследованы белки ECM или другие выделяемые белки в условной среде. Если интересующий белок локализован в цитоплазме или связан мембраной, аспирируй среду клеточной культуры и продолжайте этапы лизиса клетки (3.4.7–3.4.12). Лиза клетки должны быть выполнены параллельно с выпадением белка из сыворотки свободной кондиционированной среде, чтобы свести к минимуму протеолитическую деградацию и другие непредвиденные последствия длительного хранения клеточного слоя.
    3. После центрифугации, передача 1 мл условного среднего в новой 1,5 мл реакционной трубки и осадки белков, добавив 0,391 мл смеси трихлороацетической кислоты (TCA) и неионных сурфакт/моющее средство. Кратко вихрь смеси и инкубировать в течение 10 минут на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте смесь протеинового осадка непосредственно перед использованием, сочетая 0.252 мл 55% TCA и 0.139 мл 1% неионических сурфактант/моющее средство на мл условной среды и вихря кратко. Раствор становится мутным.
      ВНИМАНИЕ: TCA коррозионный и должны быть обработаны надлежащим образом.
    4. Пеллети осажданные белки по цене 16 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
      ВНИМАНИЕ: Супернатант содержит TCA и должен быть собран отдельно и утилизирован в качестве опасного материала.
    5. Вымойте протеиновые гранулы 3x с ледяным ацетоном и центрифугой каждый раз по цене 16 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    6. Воздушно-сухой протеиновый гранулы в течение 3-4 мин на РТ и растворяется в 50 л 1x натрия dodecyl сульфат полиакриламимид гель электрофорекс (SDS-PAGE) образец буфера (50 мм Tris pH 6.8, 2% SDS, 6% глицерол, и 0,004%% % рмофофор синий, добавка с 5%. Отварить образец в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию и использовать для западного blotting для обнаружения желаемого белка цели с помощью стандартных процедур.
      ВНИМАНИЕ: К-Меркаптоэтанол пахучий и токсичный и должен быть обработан в дымовой капот.
    7. Для внутриклеточных и мембранных связанных белков, промыть клеточный слой один раз с 2 мл PBS.
    8. Добавьте 1 мл PBS и выбить клетки, выскабливая их из колодца с помощью скребка клетки. Собирайте клетки в реакционную трубку 1,5 мл и центрифугу при 3420 х г в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте клетку гранулы 3x с 1 мл PBS и центрифуги на 3420 х г в течение 3 мин при 4 Градуса Х каждый раз.
    9. Для выщелачивания клеток, повторно приостановить клеточные гранулы в 0,2 мл буфера лисиса (20 мм Tris-HCl pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ Na2EDTA, 1 мМ EGTA, 1% NP40, 1% дезоксихолят натрия, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 ММ-глицерофосфат, и 1 мМ ортовантоват натрия 3 mM.
    10. Ультрасоникат на 15 с на льду с мощностью 10 на рабочей частоте 23 кГц.
    11. Удалите клеточный мусор центрифугированием при 13 680 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите супернатант в новой 1,5 мл реакционной трубки и определить концентрацию белка с помощью коммерческого брэдфордского анализа или любого другого подходящего метода.
    12. Для каждого образца смешайте 100 мкг белка с 5-кратным буфером проб SDS-PAGE в общем объеме 60 кл и кипятите в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Проанализируйте образцы стандартными западными процедурами промотирования на наличие желаемого целевого белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Отбор пуромицин-резистентного C2C12 может быть достигнут через 10–14 дней после трансфекции за счет эффективной ликвидации неустойчивых, т.е. нетрансинфицированных клеток(рисунок 1В). Как правило, более 80% клеток отделиться от клеточной культуры блюдо и эти клетки удаляются во время регулярного обслуживания клеток. Пуромицин-устойчивые клетки C2C12, выражающие контроль (зашифрованный) shRNA сохраняют шпиндель-форму, удлиненную морфологию клеток при низкой плотности клеток и способность дифференцироваться в миотубины. Дифференциация C2C12 при выводе сыворотки может контролироваться с помощью яркой полевой микроскопии и иммунонаблюдения за миотубетевым маркером миозина тяжелой цепи (MyHC) (Рисунок 2). MyHC-положительные миотубайты наблюдаются между 3-5 дней после начала дифференциации. Миотубемы многоядерные, как показано на наличие более одного DAPI-положительного ядра в пределах MyHC-положительных клеточных границ. Рисунок 3А показывает яркие полевые изображения стабильных ячеек C2C12, культивированных в полном DMEM. Эффективность нокдауна, представленная здесь, колеблется от 40–60%(рисунок 3B). Так как мРНК была собрана в пролиферативном состоянии, где выражается маленький Adamtsl2, эффективность нокдауна представляется низкой, но эффективность нокдауна, как ожидается, будет больше на более поздних временных точках во время дифференциации C2C12, где эндогенные Adamtsl2 индуцированы и, таким образом, выражается на гораздо более высоких уровнях. Западный анализ поблужки подтвердил успешный нокдаун ADAMTSL2 в клеточном лисате, полученном из клеток C2C12, успокоительно выражающих шРНК 3086 по сравнению с контрольной shRNA (Рисунок 3C).

Figure 1
Рисунок 1: Выбор стабильных клеток C2C12 после трансфекции с шРНК-кодирующей плазмидной ДНК. (A) Таблица, показывающая область цели (CDS, последовательность кодирования; 3'-UTR, 3'-непереведенный регион), идентификатор клона (далее именуемый 1977, 3086, и 972), и последовательность shRNA, используемых для целевой Adamtsl2. (B) Панели показывают выбор C2C12 клеток, трансфицируемых с контролем shRNA и три Adamtsl2-таргетингаshRNAs. C2C12 клетки были трансфицируются плазмидsh shRNA и пуромицин был добавлен в среду после 24 ч. Пуромицин чувствительных клеток появляются круглые и в конечном итоге отделить во время рутинного поддержания культуры клеток (красные стрелки). В отличие от этого, устойчивые к пуромицину клетки, укрывающие интегрированные плазмиды шРНК, появляются шпиндель-образными, слегка удлиненные, прикрепленные и жизнеспособные (синие стрелки). Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: C2C12 myoblast к дифференциации миотубе. Яркие полевые изображения дифференирующих клеток C2C12 показывают плотный вид булыжника клеток в начале дифференциации (день 0-1) и многоядерные миотубебы наблюдались после дня 5 (верхний ряд). Иммуностогенирование дифференциирующих клеток C2C12 с миозином тяжелой цепи (MyHC, красный), который является маркером для миотубайсов, индуцируется на 3-й день дифференциации (средняя панель). Ядра были окрашены DAPI и объединенное изображение показано в нижних панелях. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Проверка стабильного нокдауна в пролиферирующих клетках C2C12. (A) Яркие полевые изображения стабильных ячеек C2C12 культивировались в полном DMEM. Шкала баров 300 мкм. (B) qRT-PCR анализ экспрессии Adamtsl2 мРНК в стабильных клетках C2C12. Ct значения были нормализованы для домашнего хозяйства ген hprt1. мРНК была собрана до начала дифференциации. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение. (C) Западный анализ побелки, показывающий снижение белка ADAMTSL2 в клеточном лизате/фракции ECM из клеток C2C12, устойчиво выражающих shRNA 3086. Эндогенный ADAMTSL2 был обнаружен с помощью специально гололедового пептидного антитела (доступно по запросу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описываем здесь протокол для стабильного нокдауна белков ECM в миобластах C2C12 и для фенотипического анализа дифференциации миобластов C2C12 в миотубы. Несколько факторов определяют исход эксперимента и должны быть тщательно рассмотрены. Поддержание клеток C2C12 в фазе пролиферации является критическим шагом для поддержания клеток C2C12 в состоянии прекурсора мизобластного периода. Сохранение способности клеток C2C12 последовательно дифференцироваться в миотубевые вещества зависит от i) числа прохода клеток, ii) плотности культивированных клеток во время рутинного обслуживания, и iii) доступности питательных веществ, требующей частого и регулярного пополнения клеточной культуры среднего11,12,13. Из-за некоторых неизвестных механизмов, более высокое число прохода C2C12 клетки также теряют потенциал для дальнейшего слияния myoblast11. Инструкции от поставщика клеток C2C12 предлагают поддерживать эти клетки до прохода номер 15. После этого потенциал дифференциации может быть уменьшен, и эксперименты с такими клетками могут привести к менее последовательному формированию миотубет. С другой стороны, плотность клеток во время обслуживания может привести к аналогичным эффектам9. Достижение смежных плотностей клеток C2C12 во время обычной клеточной культуры способствует инициированию дифференциации миобласта C2C12 и, таким образом, может негативно повлиять на потенциал дифференциации популяции клеток. Поэтому крайне важно предотвратить достижение клеток C2C12 высокой плотностью клеток во время обычного обслуживания клеток C2C12. Этого можно достичь за счет уже субкультивирования клеток C2C12 при низкой плотности клеток (стечение 50-60%). Сывороточный голод используется, чтобы вызвать дифференциацию клеток C2C12 в миотубеты. Таким образом, поддержание клеток в течение более длительного времени без пополнения средних серьезно исчерпать питательные вещества и сыворотки. Пополнение свежей сыворотки, содержащей среднюю, по крайней мере каждые два дня может предотвратить начало нежелательной преждевременной дифференциации из-за недостатка питательных веществ и сыворотки.

Дифференциация C2C12 обычно вызвана голодом в сыворотке. Процент сыворотки, используемой для индуцирования дифференциации C2C12, может значительно повлиять на результаты, в частности, время, необходимое для формирования MyHC положительных миотубайт14,15. Несколько протоколов показывают успешную индукцию дифференциации при различных концентрациях сыворотки. Сообщалось об использовании 2-10% FBS или лошадиной сыворотки и полной лишении сыворотки, и все условия приводят к образованию миотубевсики C2C12. Процент сыворотки или изменения в сыворотке может значительно изменить маркеры для дифференциации. Кроме того, источник сыворотки может повлиять на экспериментальный результат, так как страна происхождения может или не может допускать определенные добавки при производстве сыворотки крупного рогатого скота8. Уровень сыворотки можно было бы скорректировать для достижения дифференциации в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями. Инсулин может быть добавлен в культурную среду клеток C2C12 для ускорения дифференциации и формирования миотубетов16.

Способность доставлять плазмиды, кодирующие shRNA или рекомбинантные белки, в клетки C2C12 через трансфекцию является привлекательной особенностью клеток C2C12. Несколько коммерческих липосомы основе трансфекционных реагентов были использованы ранее для доставки плазмидной ДНК в клетки C2C12 с переменной сообщили трансфекционной эффективности17,18,19,20,21. PEI также показывает разумную эффективность трансфекции и является экономически эффективной альтернативой липосомы основе трансфекционных реагентов. Сравнение трансфекции с коммерческим липосомна основе трансфекционного реагента и PEI показали никаких значительных изменений в эффективности трансфекции и несколько более высокую эффективность была найдена с PEI22. В наших руках эффективность трансфекции с PEI была достаточна для создания стабильных устойчивых к пуромицину клеток C2C12. Однако важным шагом в этом протоколе является сокращение времени инкубации трансфекционного реагента. Как уже упоминалось выше, клетки C2C12 чувствительны к выводу сыворотки и длительное воздействие низких условий сыворотки во время трансфекции может способствовать дифференциации клеток C2C12. Так как трансфекция осуществляется в отсутствие сыворотки, время инкубации после трансфекции было не хватает, чтобы быстро пополнить запасы сыворотки, содержащей среду для предотвращения преждевременной дифференциации. Пуромицин был добавлен в среду культуры 24 ч после трансфекции, чтобы инициировать отбор устойчивых к пуромицину клеток C2C12. Методы внедрения плазмидной ДНК в дифференцированные миотубины включают трансфекцию (до 85% эффективности, сообщается), электропорацию или биолистный подход23,24,25. Кроме того, стабильные клетки C2C12 укрывательство индуцируемых плазмида shRNA может быть создан, чтобы сбить гены на более поздних стадиях дифференциации миотубетов или во время созреваниямиотубет26.

Описанный здесь метод привел к стабильному нокдауну ADAMTSL2 в клетках C2C12, где теперь можно определить его функцию во время дифференциации в миотубеты. Генерация стабильных клеток нокдауна может быть особенно важно для изучения функции белков, которые индуцируются во время формирования миотубетов или созревания. Переходный переход с siRNA, например, не будет достаточно, чтобы эффективно нокдаун этих генов, так как переходный эффект нокдауна siRNA может отлжек после 5-7 дней. Кроме того, нокаут белка ECM с использованием CRISPR/Cas9 технически более сложным и отдельных клонов должны быть выбраны и секвенированы для обеспечения нокаута желаемого гена. Однако эволюционная линейка реагентов может сделать CRISPR/Cas9 методом выбора для экспериментов с потерей функциональности в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

D.H. поддерживается Национальными институтами здравоохранения (Национальный институт артрита и заболеваний опорно-мостов, NIAMS, номер гранта AR070748) и семенной фонд от Лени и Питер А. Мая Департамент ортопедии, Icahn школы медицины в Гора Синай.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Tags

Генетика Выпуск 156 ПРОтеазы ADAMTS АДАМТС-подобные белки Миобласты C2C12 внеклеточная матрица дифференциация скелетных мышц миогенез шРНК
Стабильный нокдаун генов, кодирующих внеклеточные матричные белки в линии клеток C2C12 Myoblast с использованием мелковолосой (ш)РНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. … More

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter