Summary
Les méthodes actuelles d’analyse de l’adhésion des patients aux régimes complexes de pharmacorésistants-tbsi (DR-TB) peuvent être inexactes et à forte intensité de ressources. Notre méthode analyse les cheveux, une matrice facilement recueillie et stockée, pour des concentrations de 11 médicaments CONTRE la tuberculose DR. À l’aide de LC-MS/MS, nous pouvons déterminer les niveaux de médicaments sous-nanogrammes qui peuvent être utilisés pour mieux comprendre l’observance des médicaments.
Abstract
La tuberculose pharmacorésistante (TBD) est une menace croissante pour la santé publique, et l’évaluation des niveaux de médicaments thérapeutiques peut avoir d’importants avantages cliniques. Les niveaux de médicaments plasmatiques sont l’évaluation actuelle de l’étalon-or, mais nécessitent une phlébotomie et une chaîne de froid, et ne capturent que l’adhérence très récente. Notre méthode utilise les cheveux, une matrice qui est facilement recueillie et réfléchissant à l’adhérence à long terme, pour tester 11 médicaments antituberculeux. Des travaux antérieurs de notre groupe montrent que les niveaux de médicaments antirétroviraux chez les cheveux sont associés aux résultats du VIH. Notre méthode pour les médicaments DR-TB utilise 2 mg de cheveux (3 cm proximal à la racine), qui est pulvérisé et extrait dans le méthanol. Les échantillons sont analysés à l’attention d’une seule méthode LC-MS/MS, quantifiant 11 médicaments dans une course de 16 minutes. Les limites inférieures de quantification (LLOQ) pour les 11 médicaments varient de 0,01 ng/mg à 1 ng/mg. La présence de médicaments est confirmée en comparant les ratios de deux transitions de spectrométrie de masse. Les échantillons sont quantifiés à l’aide du rapport de zone du médicament par rapport à l’isotopologue de drogue détérité, 15N ou 13C-étiqueté. Nous avons utilisé une courbe d’étalonnage allant de 0,001-100 ng/mg. L’application de la méthode à un échantillon de commodité d’échantillons de cheveux prélevés sur des patients atteints de DR-TB sur la thérapie directement observée (DOT) a indiqué des niveaux de médicaments dans les cheveux dans la gamme dynamique linéaire de neuf des onze médicaments (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacine, clofazimine, bédaquiline, prétomanid). Aucun patient n’était sur le prothionamide, et les niveaux mesurés pour l’éthionamide étaient proches de son LLOQ (avec d’autres travaux examinant plutôt la pertinence du métabolite d’éthionamide pour surveiller l’exposition). En résumé, nous décrivons le développement d’un panel multi-analyte pour les médicaments DR-TB dans les cheveux comme une technique de surveillance thérapeutique des médicaments pendant le traitement pharmacorésistant de la tuberculose.
Introduction
Au XXIe siècle, la tuberculose pharmacorésistante (TB-DR) est une catastrophe en évolution pour les programmes nationaux de lutte contre la tuberculose déjà faibles, avec des cas confirmés qui ont doublé au cours des cinq dernières années seulement, représentant près d’un tiers de tous les décès liés à la résistance aux antimicrobiens dans le monde1,2. Le traitement réussi de la TUBERCULOSE DR a traditionnellement exigé des régimes de deuxième intention plus longs et plus toxiques que le traitement de la tuberculose sensible à la drogue. En outre, les patients atteints de DR-TB ont souvent des défis préexistants importants à l’adhésion, qui a contribué à l’émergence de la résistance initialement3.
Contrairement à l’infection par le VIH où les charges virales peuvent être utilisées pour surveiller le traitement, les critères de substitution de la réponse au traitement dans la tuberculose sont retardés et peu fiables au niveau individuel4. La surveillance de l’observance des patients, un prédicteur important de la concentration et de l’échec du traitement antituberculeux sous-thérapeutiques, est également difficile. L’adhésion auto-déclarée souffre de biais de rappel et le désir de s’il vous plaît fournisseurs5,6. Le nombre de pilules et les systèmes de surveillance des événements médicamenteux (MEMS) peuvent être plusobjectifs 7, mais ne mesurent pas la consommation réelle de drogues8,9,10. Les niveaux de médicaments dans les biomatrices peuvent fournir des données d’observance et pharmacocinétiques. Par conséquent, les niveaux de médicaments plasmatiques sont couramment utilisés dans la surveillance des médicaments thérapeutiques11,12. Dans le contexte de la surveillance de l’adhérence des médicaments, cependant, les niveaux de plasma représentent une exposition à court terme et sont limités par une variabilité intra- et interpériabilité importante des patients lorsqu’ils déterminent la plage de référence appropriée de l’observance. Les effets du « manteau blanc », où l’observance s’améliore avant les visites à la clinique ou à l’étude, compliquent encore davantage la capacité des niveaux plasmatiques à fournir des modèles précis d’adhérence des médicaments13.
Hair est un biomatrix alternatif qui peut mesurer l’exposition à long terme de drogue14,15. Beaucoup de médicaments et de métabolites endogènes incorporent dans la matrice de protéine de cheveux de la circulation systémique pendant que les cheveux grandissent. Comme ce processus dynamique continue pendant la croissance des cheveux, la quantité de médicament déposé dans la matrice de cheveux dépend de la présence continue de la drogue en circulation, ce qui rend les cheveux une excellente lecture temporelle de la prise de médicaments. Les cheveux en tant que biomatrix ont l’avantage supplémentaire d’être facilement collectés sans avoir besoin de chaîne de froid pour le stockage et l’expédition par rapport au sang. En outre, les cheveux sont non-biorisqueux, ce qui offre des avantages de faisabilité supplémentaires dans le domaine.
Les niveaux de médicaments capillaires ont longtemps été utilisés dans les applications médico-légales16. Au cours de la dernière décennie, les niveaux d’antirétroviraux capillaires (ARV) ont démontré leur utilité dans l’évaluation de l’observance des médicaments dans le traitement et la prévention du VIH, auxquels notre groupe a contribué. Les niveaux d’ARV dans les cheveux se sont avérés être les plus forts prédicteurs indépendants des résultats de traitement dans l’infection de VIH17,18,19,20,21. Pour déterminer si les niveaux de cheveux des patients atteints de tuberculose DR auront le même utilité à prédire les résultats du traitement, nous avons utilisé la LC-MS/MS pour mettre au point et valider une méthode d’analyse de 11 médicaments antituberculeux dans de petits échantillons de cheveux. Dans le cadre d’une évaluation initiale de la performance de l’analyse, nous avons mesuré les niveaux de médicaments antituberculeux dr dans un échantillon pratique de patients atteints de TUBERCULOSE DR recevant un traitement directement observé (DOT) au Cap-Occidental, Afrique du Sud22.
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Protocol
Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant la collecte d’échantillons de cheveux. Nous avons obtenu l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université du Cap et de l’Université de Californie à San Francisco.
1. Échantillonnage des cheveux
- Obtenir un consentement éclairé écrit.
- Utilisez des ciseaux propres pour couper environ 20-30 mèches de cheveux du cuir chevelu de la région occipitale aussi près du cuir chevelu que possible.
- Placer le ruban adhésif autour du côté distal des cheveux pour indiquer la directionnalité. Pliez l’échantillon de cheveux dans un carré de papier d’aluminium et entreposez-le à température ambiante. Étiqueter l’extrémité distale des cheveux pour éviter une contamination possible de la manipulation supplémentaire de l’extrémité proximal.
- En plus des échantillons de patients, recueillir des « cheveux blancs » : un échantillon de cheveux du cuir chevelu d’une personne qui n’a pas pris de médicaments contre la tuberculose. Recueillir une grande quantité (30 mg de cheveux blancs pour chaque échantillon de 20 patients).
2. Extraction de médicaments
- Étiquetez les tubes de perles. Chaque échantillon de patient nécessite un tube. Étiqueter 12 tubes de "C0" à "C11", un pour chacun des 12 points d’étalonnage. Étiquetez un tube pour un contrôle de qualité faible, un tube pour le contrôle de la qualité moyenne et un tube pour un contrôle de haute qualité. Enfin, étiquetez un tube pour Matrix Blank.
- Ouvrez le carré de papier d’aluminium contenant l’échantillon de cheveux. Si l’échantillon de cheveux est plus de 3 cm, couper les cheveux à 3 cm de l’extrémité proximale et utiliser cette partie proximale pour l’analyse.
- Peser 2 mg de l’échantillon de cheveux dans un tube de perle.
- Peser 2 mg de cheveux blancs dans 16 tubes de perles supplémentaires. Ceux-ci seront utilisés comme points d’étalonnage, contrôles de qualité, et la matrice vide. Les tubes suivront la même procédure d’extraction que les échantillons de patients, en plus d’être augmentés avec des normes de référence des médicaments aux niveaux indiqués dans les étapes 2.8 et 2.9.
- Placez tous les tubes de perles dans l’homogénéise. Exécutez l’homogénéiseur à la vitesse 6,95 m/s. Courez pendant deux cycles de 30 s chacun, avec une période de repos de 15 s entre les deux cycles.
- Faire un mélange standard interne et l’ajouter aux échantillons.
- Ajouter 40 ml de méthanol dans un flacon volumetrique de 50 ml.
- Dans les flacons de verre ambre, faire les mélanges des normes internes indiquées dans le tableau 1, en utilisant le méthanol comme solvant.
REMARQUE : Le méthanol est très volatil. Laisser toutes les fioles plafonnées au cours de ce processus pour prévenir la perte due à l’évaporation. - À partir de ces mélanges, ajoutez le volume indiqué dans le tableau 1 au flacon volumetrique de 50 ml. Ensuite, remplissez le flacon à 50 ml de méthanol.
- Capuchon et mélanger le flacon volumetric. Ajouter 500 L du mélange à chacun des tubes pulvérisés, à l’exception du tube blanc de matrice. Ajouter 500 l de méthanol au tube blanc de matrice.
- Faites des mélanges standard de référence.
- Constituent des normes de référence soignées des médicaments suivants avec du méthanol pour obtenir la concentration indiquée dans le tableau à l’étape 2.7.2. Seulement 1 ml de concentrations suivantes est nécessaire.
- Ajoutez 1768 L de méthanol à une fiole, puis ajoutez les quantités de norme de référence énumérées dans le tableau 2 à la même fiole pour obtenir un volume final de 2 ml. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 1x". Vortex.
- Spike 100 L de "Ref Std Mix 1x" en méthanol de 900 ll dans une nouvelle fiole. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 10x". Vortex.
- Spike 100 L de "Ref Std Mix 10x" en méthanol de 900 ll dans une nouvelle fiole. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 100x". Vortex.
- Spike 100 L de "Ref Std Mix 100x" en méthanol de 900 ll dans une nouvelle fiole. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
- Piquez les tubes courbes d’étalonnage en ajoutant la quantité de Ref Std Mix décrite dans le tableau 3.
- Créez des mélanges QC et des tubes de contrôle de la qualité des pointes.
- Étiquette 5 flacons "QC-A" par "QC-E".
- Ajoutez les quantités suivantes de méthanol aux cinq flacons étiquetés :
QC-A: 990 l
QC-B: 940 l
QC-C: 950 l
QC-D: 980 l
QC-E: 950 l
- À l’aide des stocks de médicaments de 1 mg/mL créés à l’étape 2.7.1, ajoutez 10 l aux flacons spécifiques énumérés ci-dessous. Pour les stocks de BDQ et de CLF, qui sont à 0,5 mg/mL, ajoutez 20 L aux flacons énumérés ci-dessous.
QC-A: PTH
QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
QC-D: PTH, EMB
QC-E: CLF, BDQ, PTM
REMARQUE : Certains médicaments sont présents dans plusieurs mélanges. - Étiquetez une fiole comme «QC-A df100». Diluer 10 l de QC-A en méthanol de 990 L.
- Étiquetez une fiole comme « faible stock de QC ». Ajouter le méthanol de 1832 L à cette fiole. Ajouter les quantités de mélanges QC détaillées ci-dessous:
QC-A df100: 80 l
QC-B: 8 l
QC-C: 80 l
- Étiquetez une fiole comme « stock mid QC ». Ajouter du méthanol de 760 L à cette fiole. Ajouter les quantités de mélanges QC détaillées ci-dessous:
QC-A df100: 800 l
QC-B: 40 l
QC-C: 400 l
- Étiquetez une fiole comme « stock de Haute-CQ ». Ajouter 1376 lil de méthanol à cette fiole. Ajouter les quantités de mélanges QC détaillées ci-dessous:
QC-D: 160 l
QC-E: 320 l
MFX, 1mg/mL stock: 16 'L
INH, 1mg/mL stock: 32 lL
LFX, 1mg/mL stock: 32 lL
LZD, 1mg/mL stock: 32 lL
PZA, 1mg/mL stock: 32 'L
- Spike 10 L Low QC stock dans le tube de perle Low QC.
- Spike 10 L Mid QC stock dans le tube de perles Mid QC.
- Spike 10 L High QC stock dans le tube de perle High QC.
- Placer tous les tubes dans un shaker chaud pendant 2 h à 37 oC. Secouer devrait être assez lent pour que l’eau ne s’éclabousse pas sur les tubes.
- Retirer les tubes du shaker. Transférer le liquide des tubes de perles dans de nouveaux tubes de microcentrifuge. Étiquetez ces tubes de microcentrifugeuse de la même manière.
- Ajouter 500 l de méthanol aux vieux tubes. Casquette et vortex.
- Pour une deuxième fois, transférer le liquide des tubes de perles dans le tube de microcentrifuge correspondant. Il est acceptable de transférer les cheveux pulvérisés. Cela finira par être centrifugé.
- Centrifuger les tubes de microcentrifuge pendant 10 min à 2 800 x g.
- Retirez soigneusement le liquide et transférez-le dans de nouveaux tubes de centrifugeuse avec des étiquettes correspondantes. Veillez à ne pas déranger ou transférer la boulette de cheveux.
- Évaporer le liquide dans les tubes de centrifugeuse à la sécheresse à 32 oC.
- Reconstituer les échantillons en ajoutant 200 L de phase mobile A (eau de qualité HPLC avec 1% d’acide formique) aux tubes secs. Vortex.
- Transférer le liquide dans des flacons ambre avec des inserts de 250 L.
3. Préparation LC-MS/MS
- Faire un litre de phase mobile A (eau de qualité HPLC avec 1% d’acide formic) en ajoutant de l’eau de qualité HPLC à un flacon volumetrique d’un litre. Ensuite, ajoutez 10 ml d’acide formique de 95 % à ce flacon, puis remplissez-le à la ligne avec de l’eau de qualité HPLC.
- Faire un litre de phase B mobile (acetonitrile avec 0,1% d’acide formic) en ajoutant un peu d’acéréonitrile à un flacon volumetrique d’un litre. Ensuite, ajoutez 1 ml d’acide formique à 95 % de l’acide formique, puis remplissez-le à la ligne avec de l’acétonitrile.
- Installez une colonne de 2 x 100 mm avec une taille de particules de 2,5 m et une taille de pore de 100 m avec des perles de phényl à l’éther polaires entièrement faites de silice poreuse dans le compartiment de colonne. Assurez-vous que la colonne a également recommandé fabricant cartouche de garde installé.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition de données et la configuration matérielle en double clic. Mettez en surbrillance LCMS et cliquez sur Active Profile.
- Cliquez sur New Sub-Project, ou, si d’autres sous-projets existent déjà, cliquez sur Copy Sub-Project. Nommez le sous-projet.
- Cliquez sur nouveau document. Méthode d’acquisitionen double clic . Cliquez sur Mass Spec dans la fenêtre de la méthode d’acquisition.
- Modifier le dropdown de type d’analyse en MRM (MRM). Assurez-vous que Polarity est réglé sur Positive.
- Cliquez sur Liste d’importation et sélectionnez le fichier .csv MDR-TB LCMS transitions.csv qui est inclus dans les matériaux supplémentaires.
- Faites défiler vers le bas et réglez la durée à 16.751 min. Le temps de cycle approprié et le nombre de cycles se rempliront automatiquement.
- Dans la barre latérale gauche, cliquez sur Valco Valve intégré. Assurez-vous que le nom de position pour l’étape 0 est A. Dans la colonne Total Time (min), tapez 0,4 dans la première rangée et 13 dans la deuxième rangée.
- Dans la colonne Position, placez la ligne un à B et la ligne deux à A.
- Dans la barre latérale gauche, cliquez sur la pompe binaire. Réglez le gradient et le tableau de débit selon le tableau 4.
- Dans la barre latérale gauche, cliquez sur Autosampler. Modifier le volume d’injection à 10 l. Cliquez sur le contrôle de température activé et réglé à 4 oC.
- Dans la barre latérale gauche, cliquez sur Column Compartment. Fixez les températures droites et gauches à 50 oC.
- Fermer et enregistrer la méthode.
- Créez le lot en cliquant sur new Document et en sélectionnant le lot d’acquisition. Tapez un nom d’ensemble et sélectionnez la méthode nouvellement créée à partir de la barre de décrochage.
- Dans une feuille de calcul, créez un lot qui suit cet ordre : courbe d’étalonnage, contrôles de qualité, échantillons de patients, courbe d’étalonnage, contrôles de qualité, échantillons de patients, courbe d’étalonnage, contrôles de qualité. Ajouter les injections vides de solvants au début et à la fin de la course, ainsi qu’avant et après la courbe d’étalonnage, les contrôles de qualité et les échantillons de patients. Mettez au moins huit injections vides de solvant après des injections de la courbe d’étalonnage et de fiole de contrôle de haute qualité afin de réduire le report d’analyte.
REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajouter plus d’injections vides de solvants en fonction de l’âge de la colonne. - Dans la colonne adjacente aux noms de l’échantillon, tapez la position d’autosampler appropriée pour la fiole correspondante.
- Cliquez sur Ajouter l’ensemble. Dans la fenêtre pop-up, tapez le nombre d’échantillons dans le lot.
- Copiez et collez les noms d’échantillons et les emplacements de flacons de la feuille de calcul au lot nouvellement créé.
- Allez à l’onglet Soumettre. Cliquez sur le bouton Soumettre.
- Dans une feuille de calcul, créez un lot qui suit cet ordre : courbe d’étalonnage, contrôles de qualité, échantillons de patients, courbe d’étalonnage, contrôles de qualité, échantillons de patients, courbe d’étalonnage, contrôles de qualité. Ajouter les injections vides de solvants au début et à la fin de la course, ainsi qu’avant et après la courbe d’étalonnage, les contrôles de qualité et les échantillons de patients. Mettez au moins huit injections vides de solvant après des injections de la courbe d’étalonnage et de fiole de contrôle de haute qualité afin de réduire le report d’analyte.
- Système d’équilibre en insérant la ligne de solvant A dans la phase mobile A et la ligne de solvant B dans la phase mobile B. Ouvrez la soupape de purge sur la pompe binaire.
- Définir la composition du solvant à 50 % B à un débit de 4 ml/min. Allumez la pompe binaire.
- Après 5 min, diminuer le débit à 0,3 ml/min. Fermer la soupape de purge. Vérifiez s’il y a des fuites.
- Dans le logiciel, appuyez sur Equilibrate sur la barre d’outils supérieure. Définir l’heure à 'gt;5 min, appuyez SUR OK.
- Une fois l’instrument équilibré, les modules en bas à droite de la fenêtre apparaîtront verts. Vérifiez que la pression s’est stabilisée, puis commencez le lot en cliquant sur l’échantillon de démarrage .
4. Analyse des données
- Une fois le lot terminé, ouvrez le logiciel de quantitation. Cliquez sur l’icône de baguette magique pour créer une nouvelle table de résultats.
- Cliquez sur Parcourir pour naviguer vers le dossier approprié, puis mettre en évidence le fichier de données et cliquez sur la flèche pointant droit pour déplacer les données dans la zone sélectionnée. Cliquez sur Next.
- Sélectionnez Créer une nouvelle méthode et cliquez sur Nouveau. Entrez le nouveau nom de méthode de quantitation et appuyez sur Enregistrer etensuite .
- Sélectionnez la première injection du point d’étalonnage du milieu. Appuyez sur Next.
- Les tiques marquent toutes les transitions des normes internes dans la colonne IS.
- Pour les transitions quantifiées pour les normes de référence, sélectionnez l’IS correspondant dans la colonne nom de l’IS. Cliquez sur Next.
- Faites défiler les transitions pour vous assurer que le temps de rétention automatiquement sélectionné est précis. Assurez-vous que Gaussian Smoothing est réglé à 1,5. Tous les autres paramètres par défaut peuvent rester tels qu’ils sont (c.-à-d. pourcentage de bruit 100 %, sous-ligne de base. Fenêtre 2.00 min, Peak Splitting 2 points).
REMARQUE : Si vous le voulez, modifiez les paramètres d’intégration automatique à ce stade. Étant donné que ces paramètres changent en fonction de la configuration des instruments, nous n’avons pas inclus le nôtre ici. - Cliquez sur Finition pour appliquer la méthode de quantitation au lot.
- Cliquez sur le haut à gauche Affiche le bouton d’examen de pointe pour afficher les chromatogrammes. Naviguez à travers les transitions à l’aide de la barre latérale gauche. Faites défiler chaque injection de chaque transition quantifiée et intégrez manuellement le bon pic si nécessaire.
- Pour intégrer manuellement un pic, cliquez sur le bouton de mode d’intégration manuelle Enable, zoomez sur le chromatogramme en cliquant et en faisant glisser le long de l’axe x ou y, puis dessinez une ligne d’une ligne de base à l’autre ligne de base, en définissant le sommet. La figure 3 présente deux chromatogrammes : l’un qui a l’INH, et a donc été intégré manuellement, et l’autre qui n’a pas l’INH.
REMARQUE : Toutes les injections doivent être intégrées à l’aide des mêmes paramètres. La largeur maximale peut fournir une ligne directrice pour adhérer à ces paramètres, mais parfois la largeur de pointe sera différente. Pour quantifier un pic, le temps de rétention doit être à moins de 0,15 min du temps de rétention prévu pour cet analyte (tel que défini par les pics standard de référence), qualitativement confirmé comme ayant le rapport quantificateur attendu à la qualification (comme indiqué dans la figure 2), et avoir un rapport signal-bruit supérieur à 10.
- Pour intégrer manuellement un pic, cliquez sur le bouton de mode d’intégration manuelle Enable, zoomez sur le chromatogramme en cliquant et en faisant glisser le long de l’axe x ou y, puis dessinez une ligne d’une ligne de base à l’autre ligne de base, en définissant le sommet. La figure 3 présente deux chromatogrammes : l’un qui a l’INH, et a donc été intégré manuellement, et l’autre qui n’a pas l’INH.
- Dans la colonne Type d’échantillon, définissez les injections de courbes d’étalonnage (à l’exception des injections de courbes d’étalonnage vierge) à la norme. Définissez les injections de contrôle de la qualité en contrôle de la qualité. Laissez les injections restantes comme inconnu.
REMARQUE : Cela sera réparti sur toutes les transitions. - Dans la colonne concentration réelle, tapez les concentrations trouvées dans le tableau 5 pour toutes les courbes d’étalonnage et les injections de contrôle de la qualité.
- Cliquez sur la seconde en haut à gauche Affiche le bouton courbe d’étalonnage. Cliquez sur le bouton Régression.
- Définir le type de pondération à 1/x et appuyez SUR OK.
- Validez la courbe d’étalonnage et les échantillons de contrôle de la qualité pour s’assurer que le lot a fonctionné avec succès.
- Pour chaque transition de référence quantifiée (et non les transitions standard internes), regardez la précision de chaque courbe d’étalonnage (dans la colonne de précision). Au moins les deux tiers des points d’étalonnage doivent avoir une précision dans les 80-120%.
- Pour les points d’étalonnage bien en dehors de la précision prévue, l’injection peut être une valeur aberrante. Exclure les valeurs aberrantes si leur concentration calculée est plus de deux écarts standard par rapport aux deux autres injections de ce flacon. En cliquant sur le bouton «et pic » pour « ne pas trouver de bouton au-dessus de chaque chromatogramme .
- Vérifiez que la valeur R affichée au-dessus de la courbe d’étalonnage est de 0,975 .
- Vérifiez que toutes les injections de contrôle de la qualité ont une précision dans les 80-120%.
- Si toutes les conditions sont remplies, le lot est passé et les échantillons peuvent être quantifiés. Cliquez sur Modifier modifier la barre d’outils, puis cliquez sur Copier la table entière. Coller la table dans une feuille de calcul.
- Prenez la moyenne de la concentration calculée des deux injections d’échantillons pour déterminer la concentration déclarée de chaque échantillon.
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Representative Results
Une illustration d’un chromatogramme avec des niveaux confirmés de tous les 11 médicaments DR-TB est montrée dans la figure 1. Le temps de rétention de chaque analyte peut changer lors de l’utilisation de différents instruments et colonnes, de sorte que le temps de rétention exact doit être déterminé individuellement.
Les Chromatogrammes d’ion extraits (CIB) pour un médicament particulier (isoniazid, INH) dans l’un des étalonneurs (échantillon de cheveux blancs aigués avec les normes de référence des médicaments DR-TB) sont indiqués dans la figure 2. Les transitions quantifiées et qualificatives sont utilisées pour confirmer qualitativement la présence du médicament, car le rapport entre la zone de quantificateur et la zone de qualification reste constant entre les échantillons. La norme interne est également surveillée pour s’assurer que chaque injection d’échantillon est normalisée.
Aux fins de la démonstration, nous avons analysé un échantillon de commodité de 15 échantillons de cheveux parmi une population d’étude totale de 96 patients prenant des médicaments DR-TB dans des conditions de DOT de Western Cape, Afrique du Sud. Le tableau 6 présente des niveaux représentatifs de médicaments antituberculeux à d’un niveau parmi les plus bas et les plus élevés mesurés pour chaque analyte. Bien que les données pour 15 échantillons de patients soient présentées, chaque analyte n’a pas eu 15 niveaux rapportés parce que chaque patient est sur une combinaison différente de médicaments DR-TB. Aucun des patients n’était sur le prothionamide, et seulement un seul patient prenait pretomanid.
Figure 1. Une illustration d’un chromatogramme représentatif montrant des pics des 11 analytes dans la méthode DR-TB (EMBMD ethambutol; INH isoniazid; Pyrazinamide PZAMD; Éhionamide ETHMD; Prothionamide PTHMD; Lévofloxacine LFXMD; Moxifloxacine MFXMD; LZDMD linezolid; PTMmd pretomanid; Bedaquiline BDQMD; Clofazimine CLFMD). Parce que la sensibilité de la méthode pour chaque analyte est différente, INH, LZD, LFX, MFX et LZD ont été augmentés à 20 ng/mg cheveux tandis que BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH et PTM ont été pointes à 2 ng/mg cheveux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Deux Chromatogrammes d’ion extraits (CIB) d’une injection de point d’étalonnage 9 (C9), isoniazid (INH) à 20 ng/mg. Le haut EIC montre à la fois la transition quantifiée INH (bleu, étiqueté INH-2) et la transition qualificative INH (rouge, étiqueté INH-3). Le CŒu inférieur montre la réponse de l’INH-d4, la norme interne (IS) utilisée pour quantifier INH. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Captures d’écran du processus de quantitation. La partie supérieure est une liste partielle d’échantillons montrant des données d’injection pour un analyte (INH, isoniazid) sur 12 points d’étalonnage (étiqueté C0-C11), trois niveaux de QC, et six échantillons. La partie inférieure gauche est la courbe d’étalonnage, allant de 0,5 ng/mg -100 ng/mg. Les points bleus opaques sont des points d’étalonnage. Les carrés bleus transparents sont des points de contrôle de la qualité. La valeur R est indiquée en haut à gauche (0,99722) avec pondération 1/x. Les deux chromatogrammes en bas à droite illustrent un échantillon avec INH (chromatogramme supérieur) et un échantillon sans INH (chromatogramme inférieur). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Médicaments dans chaque mélange | Concentration de chaque médicament dans le mélange | Volume de mélange ajouté à 50mL vol. flacon |
| Mix 1: CLF-d7, EMB-d4 | 10 g/mL | 40 l |
| Mix 2: LFX-d8, PTH-d5 | 10 g/mL | 10 l |
| Mix 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS pour PTM) | 10 g/mL | 20 l |
| Mix 4: PZA 15N-d3 | 10 g/mL | 200 l |
| Mix 5: INH-d4 | 10 g/mL | 100 l |
Tableau 1. Concentration et quantité de chaque norme interne à ajouter à un flacon volumetrique de 50 ml.
| Drogue | Concentration de stock | Volume ajouté |
| BDQ (BDQ) | 0,5 mg/mL | 8 ll |
| Clf | 0,5 mg/mL | 8 ll |
| Emb | 1 mg/mL | 4 ll |
| PTH (PTH) | 1 mg/mL | 4 ll |
| Ptm | 1 mg/mL | 4 ll |
| Inh | 1 mg/mL | 40 l |
| Lfx | 1 mg/mL | 40 l |
| LZD (LZD) | 1 mg/mL | 40 l |
| Mfx | 1 mg/mL | 40 l |
| Pza | 1 mg/mL | 40 l |
Tableau 2. Quantité de chaque norme de référence de médicament à ajouter à "Ref Std Mix 1" flacon.
| Nom de l’étiquette | Vial tiré de | Volume ajouté |
| C0 | N/A | 0 l |
| C1 (en) | Ref Std Mix df1000 | 5 ll |
| C2 | Ref Std Mix df1000 | 10 l |
| C3 | Ref Std Mix df1000 | 20 l |
| C4 | Ref Std Mix df100 | 5 ll |
| C5 | Ref Std Mix df100 | 10 l |
| C6 (en) | Ref Std Mix df100 | 20 l |
| C7 (en) | Ref Std Mix df10 | 5 ll |
| C8 | Ref Std Mix df10 | 10 l |
| C9 | Ref Std Mix df10 | 20 l |
| C10 | Ref Std Mix df1 | 5 ll |
| C11 | Ref Std Mix df1 | 10 l |
Tableau 3. Quantité de chaque Ref Std Mix intermédiaire à ajouter aux 12 points d’étalonnage.
| Temps total (min) | Débit (L/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
Tableau 4. Le débit et le gradient de phase mobile utilisés pour chaque injection.
| Point d’étalonnage | Concentration réelle de BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) | Concentration réelle d’INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg) |
| C0 | 0 | 0 |
| C1 (en) | 0.005 | 0.05 |
| C2 | 0.01 | 0.1 |
| C3 | 0.02 | 0.2 |
| C4 | 0.05 | 0.5 |
| C5 | 0.1 | 1 |
| C6 (en) | 0.2 | 2 |
| C7 (en) | 0.5 | 5 |
| C8 | 1 | 10 |
| C9 | 2 | 20 |
| C10 | 5 | 50 |
| C11 | 10 | 100 |
Tableau 5. Concentration finale d’analytes dans chaque point d’étalonnage.
| Drogue | Lod (cheveux ng/mg) |
LLOQ (LLOQ) (cheveux ng/mg) |
ULOQ (ULOQ) (cheveux ng/mg) |
Valeurs de l’échantillon (ng/mg cheveux) Échantillons: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109 |
| Bedaquiline | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| Clofazimine | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| Ethambutol | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| Ethionamide | 0.01 | 0.01 | 10 | Lt;LOD, 'lt;LOD, 0.01, 0.01, 0.01, 0.02, 0.02, 0.17 |
| Isoniazid | 0.05 | 0.5 | 100 | Lt;LOD, 'lt;LOD, 0.12, 0.26, 0.84, 0.94, 1.36, 2.88, 4.03, 4.04, 9.14 |
| Levofloxacin | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| Linezolid | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| Moxifloxacin | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| Pretomanid | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| Prothionamide | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| Pyrazinamide | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
Tableau 6. Niveaux représentatifs de médicaments mesurés chez 15 patients prenant des médicaments CONTRE la tuberculose DR sous DOT. La limite de détection (LOD), la limite inférieure de quantification (LLOQ) et la limite supérieure de quantification (ULOQ) de la méthode pour chaque médicament sont données pour comparaison.
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Discussion
Nous rapportons ici le protocole pour la méthode que nous avons développée et validée pour quantifier 11 médicaments antituberculeux utilisés dans le traitement de la TUBERCULOSE DR dans de petits échantillons de cheveux à l’aide de LC-MS/MS. Aucune autre méthode pour quantifier ces 11 médicaments dans les cheveux n’a été précédemment développée, validée et publiée. Notre méthode peut quantifier les niveaux de sous-nanogrammes de médicaments dans seulement 20-30 mèches de cheveux d’environ 3 centimètres (cm) de longueur (2 mg) et a déjà étévalidée 22. Le faible poids des cheveux analysés signifie que les patients impliqués dans l’étude peuvent participer discrètement et potentiellement revenir pour des tests répétés sans crainte d’exposer le cuir chevelu chauve. Nous avons déjà publié des données sur l’association entre les niveaux de médicaments DR-TB dans les cheveux et les résultats de traitement DR23. Par conséquent, le développement et la validation de cette méthode de panel multi-analyte représente une avancée significative dans le domaine de la surveillance des médicaments thérapeutiques DR-TB.
Les cheveux nécessitent des techniques d’homogénéisation différentes de celles requises avec des biomatrices liquides. La pulvérisation des mèches de cheveux a permis un accès efficace du solvant d’extraction aux analytes dans la matrice de cheveux. Ainsi, une caractéristique importante de notre méthode est le processus d’extraction rapide et facile des médicaments des cheveux à l’aide des échantillons pulvérisés. Le temps d’incubation pendant le processus d’extraction n’est que de deux h, en raison de la grande surface accessible des cheveux pulvérisés, et il n’y a pas d’étape de nettoyage, en raison de la petite taille de l’échantillon (2 mg). Il faut cependant prendre soin de limiter la dégradation des médicaments pendant le processus d’extraction. Le protocole utilise une pulvérisation à deux cycles, avec une période de refroidissement de 45 s entre les cycles. Ce processus évite la surchauffe et potentiellement dégrader les médicaments dans les cheveux.
Contrairement à de nombreuses analyses capillaires pour les drogues d’abus, cette méthode n’utilise pas une étape de lavage. Les médicaments antituberculeux sont sous forme de capsules ou de comprimés, ce qui limite les sources possibles de contamination externe et la nécessité subséquente de se laver les cheveux avant l’analyse. De futures études pourraient analyser le solvant de lavage des poils des patients atteints de TUBERCULOSE DR afin d’évaluer la contamination externe.
Bien que la pulvérisation des cheveux favorise l’extraction efficace de médicaments, elle a ses propres limites. Notre laboratoire a constaté que si les cheveux sont pulvérisés dans laruptrice de perles et laissés à température ambiante, la concentration de certains des 11 médicaments diminue au fil des semaines et des mois. Cela peut être dû à la grande surface des cheveux pulvérisés exposés à l’atmosphère qui peuvent favoriser l’oxydation et d’autres réactions de dégradation. Si une étude de stabilité des médicaments dans les cheveux est désirée, les cheveux peuvent être coupés avec des ciseaux en petits segments de 'lt;1 cm, homogénéisés à la main, puis laissés à température ambiante pendant des semaines ou des mois pendant l’étude de stabilité. Lorsque cette coupe des cheveux est pulvérisée le jour de l’analyse, nous n’avons observé aucune dégradation significative des médicaments au fil du temps. Par conséquent, dans l’exécution du protocole décrit, nous recommandons que les cheveux soient pulvérisés le jour où ils sont extraits. De même, tous les mélanges de médicaments inférieurs à 10 g/mL devraient être préparés le jour de l’extraction.
Aucune méthode déjà publiée n’est disponible pour évaluer la pertinence des plages dynamiques linéaires (LLOQ-ULOQ) que nous avons établies pour chaque médicament antituberculeux dans la méthode multi-analyte. Cependant, l’échantillon de commodité d’échantillons de cheveux de Western Cape, afrique du Sud, indique la pertinence de la gamme dynamique linéaire de cette méthode. À l’exception de l’éthionamide, du pretomanid et du prothionamide, plus de 95 % des niveaux de médicaments que nous avons mesurés chez ces patients se situent dans la plage dynamique linéaire de chaque analyte. Un seul patient prenait le pretomanid (qui a été détecté), et aucun patient ne prenait le prothionamide. Pour l’éthionamide, nous émettons l’hypothèse que le médicament ne peut pas se déposer à la matrice de cheveux bien, comme notre LOD est 0.01 ng/mg cheveux (ou 10 pg/mg cheveux) et pourtant seulement un des huit patients prenant de l’éthionamide a des niveaux supérieurs à 0,02 ng/mg cheveux. Un examen plus approfondi est justifié pour déterminer la pharmacocinétique de différents médicaments antituberculeux dans les cheveux. Par exemple, une alternative potentielle pour la surveillance des médicaments comme l’éthionamide est de développer une méthode ciblant leur métabolite(s) à la place. Nous avons fait une observation similaire pour delamanid, un nouveau médicament DR-TB, qui faisait initialement partie de ce panel. Une méthode ciblant le métabolite de delamanid est actuellement en cours de validation dans notre laboratoire, parce que le métabolite se trouve dans des concentrations plus élevées que le médicament parent. La même procédure peut être effectuée pour l’éthionamide. Les concentrations de médicaments dans le tableau 6 sont présentées en groupe parce que les résultats individuels et les résultats cliniques ne sont pas au centre de ce document de méthode. L’évaluation individuelle de ce groupe de patients a été publiée ailleurs23.
Les patients contribuant de petits échantillons de cheveux pour l’étude de démonstration ont été administrés une série de régimes de drogue par l’intermédiaire de DOT dans un arrangement d’hospitalisé, et tous les régimes ont été documentés selon des dossiers d’allaitement pendant la période d’hospitalisation. Cependant, comme c’est courant chez les patients atteints de tuberculose DR, des régimes médicamenteux antérieurs et mal documentés avaient également été administrés avant leur séjour à l’hôpital. Ceci a mené à la détection des drogues dans les cheveux de patient qui n’ont pas été notées sur leurs dossiers d’hospitalisé. Par conséquent, nous n’avons pas pu utiliser ces échantillons pour déterminer la spécificité de la méthode, car nous n’avons pas pu déterminer si ces échantillons étaient vraiment de faux positifs. Au lieu de cela, nous avons testé les cheveux de patients qui ne prenaient pas de médicaments CONTRE la tuberculose DR. Aucun médicament ANTItuberculeux n’a été détecté dans ces échantillons, ce qui indique que la méthode est spécifique.
Bien que notre méthode démontre l’utilité d’utiliser les cheveux dans la mesure des médicaments DR-TB, l’analyse des cheveux a son propre ensemble de limitations. Parce que les cheveux sont une matrice solide, la pointe des normes de référence des médicaments pendant la validation de la méthode ne permet pas l’intégration complète des normes dans la matrice comme avec l’urine et le sang. Ainsi, l’évaluation de récupération se limite à la détection du médicament après avoir craché sur la matrice solide, et non pas la récupération réelle de la matrice. De même, parce que les cheveux sont une matrice alternative qui est encore à l’étude pour les tests, aucune gamme de référence facilement disponible pour les médicaments ne sont disponibles pour évaluer la pertinence de la méthode. Plus d’études pharmacocinétiques sur l’incorporation de médicaments dans les cheveux seront utiles pour mieux comprendre l’utilité des niveaux de médicaments capillaires dans la surveillance de l’observance. Enfin, la bonne collection d’échantillons de cheveux sur les sites de terrain a ses propres défis uniques. Bien que la collecte et le stockage des échantillons de cheveux nécessitent moins de ressources que les autres biomatrices, il faut prendre soin d’identifier les extrémités distales et proximales de toutes les mèches de cheveux de plus de 2 cm. Les mèches de cheveux plus longues peuvent avoir des concentrations de médicaments différentes le long du brin, selon l’utilisation de médicaments au fil du temps. Un étiquetage adéquat permet d’analyser des segments spécifiques des brins; dans le cas de notre méthode, les trois centimètres de cheveux les plus proches du cuir chevelu ont été utilisés pour déterminer les données les plus récentes sur l’observance des médicaments. Un étiquetage adéquat nécessite des procédures de formation et d’assurance de la qualité sur les sites.
En résumé, nous avons mis au point le premier panneau multi-analyte pour analyser les médicaments antituberculeux utilisés pour la tuberculose DR par l’intermédiaire de LC-MS/MS dans de petits échantillons de cheveux. Étant donné la faisabilité de la collecte et du stockage des cheveux dans des milieux limités dans les ressources, notre méthode représente une avancée potentiellement significative dans le domaine de la surveillance des médicaments thérapeutiques antituberculeux. Les mesures objectives de l’exposition aux médicaments qui tiennent compte à la fois de l’observance et de la variabilité pharmacocinétique individuelle peuvent fournir une indication précoce de l’inefficacité des régimes de traitement, aidant ainsi à la fois le traitement individuel ainsi que la limitation de la transmission communautaire de la DR-TB24.
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Disclosures
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe et Monica Gandhi).
Acknowledgments
Les auteurs tient à remercier le professeur Keertan Dheda, le Dr Ali Esmail et Marietjie Pretorius de l’Institut pulmonaire de l’Université du Cap qui ont facilité la collecte d’échantillons de cheveux pour l’étude. Les auteurs reconnaissent également avec gratitude les contributions des participants à cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
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