Summary
Os métodos atuais de análise da adesão dos pacientes a regimes complexos de tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) podem ser imprecisos e intensivos em recursos. Nosso método analisa o cabelo, uma matriz facilmente coletada e armazenada, para concentrações de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar níveis de drogas de sub-nanogramas que podem ser utilizados para entender melhor a adesão aos medicamentos.
Abstract
A tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) é uma ameaça crescente à saúde pública, e a avaliação dos níveis de medicamentos terapêuticos pode ter importantes benefícios clínicos. Os níveis de drogas plasmáticas são a avaliação padrão-ouro atual, mas requerem flebotomia e uma cadeia fria, e capturam apenas a adesão muito recente. Nosso método utiliza o cabelo, uma matriz que é facilmente coletada e reflexo da adesão a longo prazo, para testar 11 medicamentos anti-TB. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostram que os níveis de drogas antirretrovirais nos cabelos estão associados aos desfechos do HIV. Nosso método para drogas DR-TB utiliza 2 mg de cabelo (3 cm proximal à raiz), que é pulverizado e extraído em metanol. As amostras são analisadas com um único método LC-MS/MS, quantificando 11 medicamentos em um período de 16 minutos. Os limites mais baixos de quantificação (LLOQs) para os 11 fármacos variam de 0,01 ng/mg a 1 ng/mg. A presença de drogas é confirmada comparando-se as razões de duas transições de espectrometria de massa. As amostras são quantificadas usando a proporção da droga para o iotopologue de droga denominado, 15N-, ou 13C-labeled. Utilizou-se uma curva de calibração variando de 0,001-100 ng/mg. A aplicação do método a uma amostra de conveniência de amostras de cabelo coletadas de pacientes com DR-TB em terapia diretamente observada (DOT) indicou níveis de fármacos no cabelo dentro da faixa dinâmica linear de nove das onze drogas (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimina, bedaquiline, pretomanid). Nenhum paciente estava em prothionamida, e os níveis medidos de ethionamida estavam próximos de seu LLOQ (com trabalho suplementar, examinando a adequação do metabólito da ethionamida para a exposição ao monitoramento). Em resumo, descrevemos o desenvolvimento de um painel multi-anilte para medicamentos DR-TB no cabelo como uma técnica de monitoramento de drogas terapêuticas durante o tratamento de TB resistente a medicamentos.
Introduction
No século XXI, a TB resistente a medicamentos (DR-TB) é uma catástrofe em evolução para programas de controle nacional de TB já fracos, com casos confirmados dobrando apenas nos últimos 5 anos, representando quase um terço de todas as mortes relacionadas à resistência antimicrobiana globalmente1,2. O tratamento bem-sucedido da TB-DR tem exigido convencionalmente regimes de segunda linha mais longos e tóxicos do que o tratamento para a TB sensível a medicamentos. Além disso, os pacientes com TB-DR frequentemente têm desafios pré-existentes significativos para a adesão, o que contribuiu para o surgimento da resistência inicialmente3.
Ao contrário da infecção pelo HIV, onde as cargas virais podem ser usadas para monitorar o tratamento, os pontos finais substitutos da resposta ao tratamento em TB são atrasados e não são confiáveis em um nível individual4. O monitoramento da adesão do paciente, um importante preditor da concentração de medicamentos anti-TB subterapêuticos e falha no tratamento, também é desafiador. A adesão autorreferida sofre de viés de recall e o desejo de agradar aos provedores5,6. A contagem de comprimidos e os sistemas de monitoramento de eventos medicamentosos (MEMS) podem ser mais objetivos7, mas não medem o consumo real de drogas8,,9,10. Os níveis de medicamentos em biomatrices podem fornecer dados de adesão e farmacocinética. Portanto, os níveis de fárres plasmáticos são comumente utilizados no monitoramento de drogas terapêuticas11,12. No contexto do monitoramento da adesão a medicamentos, no entanto, os níveis plasmáticos representam exposição a curto prazo e são limitados por significativa variabilidade intra e interpaciente ao determinar a faixa de referência de adesão adequada. Os efeitos do "jaleco branco", onde a adesão melhora antes das visitas clínicas ou de estudo, complicam ainda mais a capacidade dos níveis plasmáticos de fornecer padrões precisos de adesão a medicamentos13.
O cabelo é uma biomatriz alternativa que pode medir a exposição a medicamentos a longo prazo14,15. Muitas drogas e metabólitos endógenos incorporam-se à matriz proteica capilar da circulação sistêmica à medida que o cabelo cresce. Como esse processo dinâmico continua durante o crescimento capilar, a quantidade de droga depositada na matriz capilar depende da presença contínua da droga em circulação, tornando o cabelo uma excelente leitura temporal da ingestão de drogas. O cabelo como biomatriz tem a vantagem adicional de ser facilmente coletado sem a necessidade de cadeia fria para armazenamento e expedição em comparação com o sangue. Além disso, o cabelo não é bioperigoso, o que proporciona vantagens adicionais de viabilidade no campo.
Os níveis de drogas capilares têm sido usados há muito tempo em aplicações forenses16. Na última década, os níveis de antirretroviral capilar (ARV) demonstraram utilidade na avaliação da adesão de medicamentos no tratamento e prevenção do HIV, para os quais nosso grupo contribuiu. Os níveis de ARV nos cabelos têm se mostrado os mais fortes preditores independentes dos desfechos de tratamento na infecção pelo HIV17,18,19,20,21. Para determinar se os níveis de cabelo dos pacientes com TB-DR terão a mesma utilidade na previsão do resultado do tratamento, utilizou-se o LC-MS/MS para desenvolver e validar um método para analisar 11 medicamentos DR-TB em pequenas amostras de cabelo. Como avaliação inicial do desempenho do ensaio, medimos os níveis de medicamentos DR-TB em uma amostra de conveniência de pacientes com TB-DR recebendo terapia observada diretamente (DOT) no Cabo Ocidental, África do Sul22.
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Protocol
Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da coleta de amostras de cabelo. Obtivemos a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Cidade do Cabo e da Universidade da Califórnia, Em São Francisco.
1. Amostragem de cabelo
- Obter consentimento informado por escrito.
- Use uma tesoura limpa para cortar aproximadamente 20-30 fios de cabelo do couro cabeludo da região occipital o mais próximo possível do couro cabeludo.
- Coloque a fita ao redor do lado distal do cabelo para indicar direcionalidade. Dobre a amostra de cabelo em um quadrado de folha de alumínio e armazene à temperatura ambiente. Rotular a extremidade distal do cabelo para evitar uma possível contaminação devido ao manuseio adicional da extremidade proximal.
- Além das amostras dos pacientes, coletar "cabelo em branco": uma amostra de cabelo do couro cabeludo de alguém que não tomou medicação para tuberculose. Coletar uma grande quantidade (>30 mg de cabelo em branco para cada 20 amostras de pacientes).
2. Extração de drogas
- Etiquetar tubos de tala. Cada amostra do paciente requer um tubo. Etiqueta 12 tubos de "C0" a "C11", um para cada um dos 12 pontos de calibração. Rotular um tubo para baixo controle de qualidade, um tubo para controle de qualidade média e um tubo para controle de alta qualidade. Por último, rotule um tubo para Matrix Blank.
- Abra o quadrado de folha de alumínio contendo amostra de cabelo. Se a amostra de cabelo for maior que 3 cm, corte o cabelo a 3 cm da extremidade proximal e use essa porção proximal para análise.
- Pesar 2 mg da amostra de cabelo em um tubo de conta.
- Pesar 2 mg de cabelo em branco em 16 tubos de talva adicionais. Estes serão usados como pontos de calibração, controles de qualidade e matriz em branco. Os tubos seguirão o mesmo procedimento de extração das amostras do paciente, além de serem cravados com padrões de referência de medicamentos nos níveis indicados nas etapas 2.8 e 2.9.
- Coloque todos os tubos de contas no homogeneizador. Executar homogeneizador a velocidade de 6,95 m/s. Executar para dois ciclos de 30 s cada, com um período de descanso de 15 s entre os dois ciclos.
- Faça uma mistura padrão interna e adicione-a às amostras.
- Adicione ~40 mL de metanol a um frasco volumétrica de 50 mL.
- Em frascos de vidro âmbar, faça as misturas das normas internas indicadas na Tabela 1, utilizando o metanol como solvente.
NOTA: O metanol é muito volátil. Deixe todos os frascos tampados durante este processo para evitar perdas devido à evaporação. - A partir dessas misturas, adicione o volume mostrado na Tabela 1 ao frasco volumétrica de 50 mL. Em seguida, encha o frasco a 50 mL com metanol.
- Tampe e misture o frasco volumétrica. Adicione 500 μL da mistura a cada um dos tubos de cabelo pulverizados, exceto o tubo em branco da matriz. Adicione 500 μL de metanol ao tubo em branco da matriz.
- Faça misturas padrão de referência.
- Constituem padrões de referência puros dos seguintes medicamentos com metanol para obter a concentração mostrada na tabela na etapa 2.7.2. Apenas 1 mL das seguintes concentrações é necessário.
- Adicione 1768 μL de metanol a um frasco e, em seguida, adicione as quantidades de padrão de referência listadas na Tabela 2 ao mesmo frasco para obter 2 mL volume final. Rotular este frasco "Ref Std Mix 1x". Vórtice.
- Espeto 100 μL de "Ref Std Mix 1x" em 900 μL de metanol em um novo frasco. Rotular este frasco "Ref Std Mix 10x". Vórtice.
- Espeto 100 μL de "Ref Std Mix 10x" em 900 μL de metanol em um novo frasco. Rotular este frasco "Ref Std Mix 100x". Vórtice.
- Espeto 100 μL de "Ref Std Mix 100x" em 900 μL de metanol em um novo frasco. Rotular este frasco "Ref Std Mix 1000x". Vórtice.
- Espete os tubos da curva de calibração adicionando a quantidade de Ref Std Mix descrita na Tabela 3.
- Crie misturas de QC e espigão tubos de controle de qualidade.
- Etiqueta 5 frascos "QC-A" através de "QC-E".
- Adicione as seguintes quantidades de metanol aos cinco frascos rotulados:
QC-A: 990 μL
QC-B: 940 μL
QC-C: 950 μL
QC-D: 980 μL
QC-E: 950 μL
- Utilizando os estoques de medicamentos de 1 mg/mL criados na etapa 2.7.1, adicione 10 μL aos frascos específicos listados abaixo. Para as ações BDQ e CLF, que estão a 0,5 mg/mL, adicione 20 μL aos frascos listados abaixo.
QC-A: PTH
QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
QC-D: PTH, EMB
QC-E: CLF, BDQ, PTM
NOTA: Algumas drogas estão presentes em múltiplas misturas. - Rotular um frasco como "QC-A df100". Diluir 10 μL de QC-A em 990 μL de metanol.
- Rotular um frasco como "Baixo estoque qc". Adicione 1832 μL de metanol a este frasco. Adicione as quantidades de misturas de QC detalhadas abaixo:
QC-A df100: 80 μL
QC-B: 8 μL
QC-C: 80 μL
- Rotular um frasco como "Mid QC stock". Adicione 760 μL de metanol a este frasco. Adicione as quantidades de misturas de QC detalhadas abaixo:
QC-A df100: 800 μL
QC-B: 40 μL
QC-C: 400 μL
- Rotular um frasco como "Alto estoque de QC". Adicione 1376 μL de metanol a este frasco. Adicione as quantidades de misturas de QC detalhadas abaixo:
QC-D: 160 μL
QC-E: 320 μL
MFX, 1mg/mL stock: 16 μL
INH, 1mg/mL estoque: 32 μL
LFX, 1mg/mL stock: 32 μL
LZD, 1mg/mL estoque: 32 μL
PZA, 1mg/mL estoque: 32 μL
- Espeto de 10 μL Baixo QC no tubo de conta Low QC.
- Espeto de 10 μL Mid QC no tubo de conta do QC médio.
- Espeto de 10 μL alto QC no tubo de conta high QC.
- Coloque todos os tubos em agitador quente por 2 h a 37 °C. O tremor deve ser lento o suficiente para que a água não espirre nos tubos.
- Remova os tubos do agitador. Transfira o líquido dos tubos de esfera saque para novos tubos de microcentrífuga. Rotule esses tubos de microcentrifuge da mesma forma.
- Adicione 500 μL de metanol aos tubos antigos. Tampa e vórtice.
- Pela segunda vez, transfira o líquido dos tubos de esfera para o tubo de microcentrífuga correspondente. Não há problema em transferir cabelo pulverizado. Isso acabará por ser centrifugado.
- Centrifugação dos tubos de microcentrífuga por 10 min a 2.800 x g.
- Remova cuidadosamente o líquido e transfira-o para novos tubos de centrífuga com etiquetas correspondentes. Tenha cuidado para não perturbar ou transferir a pelota de cabelo.
- Evaporar o líquido nos tubos de centrífuga até secar a 32 °C.
- Reconstituir as amostras adicionando 200 μL de fase Móvel A (água de grau HPLC com ácido fórmico de 1%) aos tubos secos. Vórtice.
- Transfira o líquido para frascos âmbar com inserções de 250 μL.
3. Preparação lc-MS/MS
- Faça um litro de fase Móvel A (água de grau HPLC com 1% de ácido fórmico) adicionando um pouco de água de grau HPLC a um frasco volulítico de um litro. Em seguida, adicione 10 mL de >95% de ácido fórmico a esse frasco e, em seguida, encha a linha com água de grau HPLC.
- Faça um litro de fase Móvel B (acetonitrilo com 0,1% de ácido fórmico) adicionando um pouco de acetonitrilo a um frasco volumétrica de um litro. Em seguida, adicione 1 mL de >95% de ácido fórmico a esse frasco e, em seguida, encha a linha com acetonitrilo.
- Instale uma coluna de 2 x 100 mm com tamanho de partícula de 2,5 μm e tamanho de poros de 100 Å com contas de fenil com teto polar, ligadas ao éter totalmente feitas de sílica porosa no compartimento da coluna. Certifique-se de que a coluna também tem o cartucho de proteção recomendado pelo fabricante instalado.
- Abra o software de aquisição de dados e clique duas vezes em Configuração de hardware. Destaque LCMS e clique em Ativar perfil.
- Clique em Novo subprojetoou, se outros subprojetos já existirem, clique em Copiar subprojeto. Nomeie o subprojeto.
- Clique em Novo Documento. Duplo clique no método de aquisição. Clique em Especificação de Massa na janela método de aquisição.
- Alterar a isto de tipo de varredura para MRM (MRM). Certifique-se de que a Polarity está definida como Positiva.
- Clique em Lista de Importação e selecione o método MDR-TB LCMS do arquivo .csv transições.csv que está incluído em Materiais Suplementares.
- Role para baixo e defina a duração para 16.751 min. O tempo de ciclo e o número adequados de ciclos serão preenchidos automaticamente.
- Na barra lateral esquerda, clique em Válvula Valco Integrada. Certifique-se de que o nome da posição para o passo 0 é A. Na coluna Tempo Total (min), digite 0,4 na primeira linha e 13 na segunda linha.
- Na coluna Posição, defina a linha 1 para B e a linha dois para A.
- Na barra lateral esquerda, clique em Bomba Binária. Defina a tabela de gradiente e taxa de fluxo de acordo com a Tabela 4.
- Na barra lateral esquerda, clique em Autosampler. Alterar o volume da injeção para 10 μL. Clique no controle de temperatura ativado e defina para 4 °C.
- Na barra lateral esquerda, clique em Coluna Compartimento. Coloque as temperaturas direita e esquerda para 50 °C.
- Feche e salve o método.
- Criar lote clicando em Novo Documento e selecionando O Lote de Aquisição. Digite um nome definido e selecione o método recém-criado na barra de isto.
- Em uma planilha, crie um lote que segue esta ordem: curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade. Adicione injeções em branco solvente no início e no final da corrida, bem como antes e depois da curva de calibração, controles de qualidade e amostras de pacientes. Coloque pelo menos oito injeções em branco solvente após injeções da curva de calibração e frasco de controle de alta qualidade, a fim de reduzir o câmbio de analyte.
NOTA: Mais injeções em branco de solvente podem precisar ser adicionadas dependendo da idade da coluna. - Na coluna adjacente aos nomes da amostra, digite a posição de amostrador apropriado para o frasco correspondente.
- Clique em Adicionar conjunto. Na janela pop-up, digite o número de amostras no lote.
- Copie e cole nomes de amostras e locais de frascos da planilha para o lote recém-criado.
- Vá para a guia Enviar. Clique em Enviar botão.
- Em uma planilha, crie um lote que segue esta ordem: curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade. Adicione injeções em branco solvente no início e no final da corrida, bem como antes e depois da curva de calibração, controles de qualidade e amostras de pacientes. Coloque pelo menos oito injeções em branco solvente após injeções da curva de calibração e frasco de controle de alta qualidade, a fim de reduzir o câmbio de analyte.
- Equilibre o sistema inserindo a linha A de solvente na fase Móvel A e na linha B do solvente na fase Móvel B. Abra a válvula de purga na bomba binária.
- Coloque a composição do solvente em 50% B a 4 mL/min de fluxo. Ligue a bomba binária.
- Após 5 min, diminua o fluxo para 0,3 mL/min. Feche a válvula de purga. Verifique se há vazamentos.
- No software, pressione Equilibre na barra de ferramentas superior. Definir o tempo para >5 min, pressione OK.
- Depois que o instrumento tiver se equilibrado, os módulos no canto inferior direito da janela aparecerão verdes. Verifique se a pressão estabilizou e, em seguida, inicie o lote clicando em Iniciar amostra.
4. Análise de dados
- Depois que o lote estiver concluído, abra o software de quantificar. Clique no ícone de varinha para criar uma nova tabela resultados.
- Clique em Procurar para navegar até a pasta apropriada e, em seguida, destacar o arquivo de dados e clique na seta de apontar para o botão direito do mouse para mover os dados para a área Selecionada. Clique em Next.
- Selecione Criar novo método e clique em Novo. Insira o nome do novo método de quantitação e pressione Salvar e, em seguida, Next.
- Selecione a primeira injeção do ponto de calibração do meio. Pressione Next.
- Marcar todas as transições das normas internas na coluna IS.
- Para as transições de quantificador para as normas de referência, selecione o IS correspondente na coluna NOME IS. Clique em Next.
- Role as transições para garantir que o tempo de retenção selecionado automaticamente seja preciso. Certifique-se de que a suavização gaussiana está definida como 1,5. Todas as outras configurações padrão podem permanecer como estão (ou seja, Porcentagem de ruído 100%, Sub linha de base. Janela 2.00 min, Pico Dividindo 2 pontos).
NOTA: Se quiser, modifique os parâmetros de integração automática neste momento. Uma vez que esses parâmetros mudam com base na configuração do instrumento, não incluímos o nosso aqui. - Clique em Concluir para aplicar o método de quantitação ao lote.
- Clique no canto superior esquerdo Exibe o botão de revisão de pico para exibir cromatogramas. Navegue pelas transições usando a barra lateral esquerda. Role cada injeção de cada transição de quantificador e integre manualmente o pico correto, se necessário.
- Para integrar manualmente um pico, clique no botão Ativar o modo de integração manual, dê zoom no cromatograma clicando e arrastando ao longo do eixo x ou y e, em seguida, desenhe uma linha de uma linha de base para a outra linha de base, definindo o pico. A Figura 3 apresenta dois cromatogramas: um que tem INH e, portanto, foi integrado manualmente, e outro que não possui INH.
NOTA: Todas as injeções devem ser integradas usando os mesmos parâmetros. A largura máxima pode fornecer uma diretriz para aadesão a esses parâmetros, mas às vezes a largura do pico difere. Para quantificar um pico, o tempo de retenção deve estar dentro de ±0,15 min do tempo de retenção esperado para esse análdio (conforme definido pelos picos padrão de referência), qualitativamente confirmado como tendo a razão de quantificador esperado para o qualificador (como mostrado na Figura 2),e ter uma razão sinal-ruído maior que 10.
- Para integrar manualmente um pico, clique no botão Ativar o modo de integração manual, dê zoom no cromatograma clicando e arrastando ao longo do eixo x ou y e, em seguida, desenhe uma linha de uma linha de base para a outra linha de base, definindo o pico. A Figura 3 apresenta dois cromatogramas: um que tem INH e, portanto, foi integrado manualmente, e outro que não possui INH.
- Na coluna Tipo de amostra, defina as injeções da curva de calibração (com exceção das injeções da curva de calibração em branco) para Padrão. Defina as injeções de controle de qualidade para controle de qualidade. Deixe as injeções restantes como desconhecidas.
NOTA: Isso será definido em todas as transições. - Na coluna Concentração Real, digite as concentrações encontradas na Tabela 5 para todas as injeções de curva de calibração e controle de qualidade.
- Clique no segundo do canto superior esquerdo Exibe o botão de curva de calibração. Clique no botão Regressão.
- Definir tipo de ponderação para 1/x e pressionar OK.
- Valide a curva de calibração e as amostras de controle de qualidade para garantir que o lote tenha sido aplicado com sucesso.
- Para cada transição de referência de quantificador (não transições padrão internas), veja cada precisão de injeção da curva de calibração (na coluna Precisão). Pelo menos dois terços dos pontos de calibração devem ter uma precisão dentro de 80-120%.
- Para pontos de calibração muito fora da precisão esperada, a injeção pode ser um outlier. Exclua os outliers se sua concentração calculada estiver a mais de dois desvios-padrão das outras duas injeções desse frasco. Clicando no" et peak to 'not found button above each chromatogram.
- Verifique se o valor R exibido acima da curva de calibração é de >0,975.
- Verifique se todas as injeções de controle de qualidade têm uma precisão dentro de 80-120%.
- Se todas as condições acima estiverem satisfeitas, o lote passou e as amostras podem ser quantificadas. Clique em Editar na barra de ferramentas e clique em Copiar tabela inteira. Cole a mesa em uma planilha.
- Tome-se a média da concentração calculada das duas injeções de amostra para determinar a concentração relatada de cada amostra.
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Representative Results
Uma ilustração de um cromatograma com níveis confirmados de todas as 11 drogas DR-TB é mostrada na Figura 1. O tempo de retenção de cada analizadopode mudar ao usar diferentes instrumentos e colunas, de modo que o tempo exato de retenção deve ser determinado individualmente.
Os Cromatogramas de Íon extraídos (EICs) para uma droga específica (isoniazida, INH) em um dos calibradores (amostra de cabelo em branco cravada com padrões de referência de drogas DR-TB) são mostrados na Figura 2. As transições de quantificador e qualificatório são usadas para confirmar qualitativamente a presença da droga, uma vez que a razão entre a área de quantificador e a área de qualificação permanece constante entre as amostras. O padrão interno também é monitorado para garantir que cada injeção de amostra seja normalizada.
Para fins de demonstração, analisamos uma amostra de conveniência de 15 amostras de cabelo entre uma população total de 96 pacientes que tomavam medicamentos DR-TB sob condições DOT do Cabo Ocidental, África do Sul. A Tabela 6 apresenta níveis representativos de medicamentos dr-TB nos níveis mais baixos e mais altos medidos para cada analisato. Embora sejam apresentados dados de 15 amostras de pacientes, cada um não teve 15 níveis relatados porque cada paciente está em uma combinação diferente de medicamentos DR-TB. Nenhum dos pacientes tomava prothionamida, e apenas um único paciente tomava pretomanida.
Figura 1. Ilustração de um cromatograma representativo mostrando picos dos 11 aniálicos no método DR-TB (EMB= ethambutol; INH= isoniazida; PZA= pirazinamida; ETH= ethionamida; PTH= prothionamida; LFX= levofloxacina; MFX = moxifloxacina; LZD= linezolid; PTM= pretomanide; BDQ= bedaquilina; CLF= clofazimina). Como a sensibilidade do método para cada análtico é diferente, INH, LZD, LFX, MFX e LZD foram cravados em 20 ng/mg de cabelo, enquanto BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH e PTM foram cravados em 2 ng/mg de cabelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Dois Cromatogramas de Íon extraídos (EICs) de uma injeção do ponto de calibração 9 (C9), isoniazida (INH) a 20 ng/mg. O EIC superior mostra tanto a transição do quantificador INH (azul, rotulado INH-2) quanto a transição qualificatória INH (vermelho, rotulado INH-3). O EIC inferior mostra a resposta do INH-d4, o padrão interno (IS) usado para quantificar o INH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Capturas de tela do processo de quantitação. A porção superior é uma lista de amostras parciais que mostra dados de injeção para um analíte (INH, isoniazida) em 12 pontos de calibração (rotulados C0-C11), três níveis de QC e seis amostras. A parte inferior esquerda é a curva de calibração, variando de 0,5 ng/mg -100 ng/mg. Pontos azuis opacos são pontos de calibração. Quadrados azuis transparentes são pontos de controle de qualidade. O valor R é mostrado no canto superior esquerdo (0,99722) com ponderação de 1/x. Os dois cromatogramas no cantograma inferior direito ilustram uma amostra com INH (cromatograma superior) e uma amostra sem INH (cromatograma inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Drogas em cada mistura | Concentração de cada droga em mistura | Volume de mistura adicionado a 50mL vol. frasco |
| Mix 1: CLF-d7, EMB-d4 | 10 μg/mL | 40 μL |
| Mix 2: LFX-d8, PTH-d5 | 10 μg/mL | 10 μL |
| Mix 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS for PTM) | 10 μg/mL | 20 μL |
| Mix 4: PZA 15N-d3 | 10 μg/mL | 200 μL |
| Mix 5: INH-d4 | 10 μg/mL | 100 μL |
Tabela 1. Concentração e quantidade de cada padrão interno para adicionar a um frasco volumétrica de 50 mL.
| Droga | Concentração de estoque | Volume adicionado |
| BDQ | 0,5 mg/mL | 8 μL |
| Clf | 0,5 mg/mL | 8 μL |
| EMB | 1 mg/mL | 4 μL |
| Pth | 1 mg/mL | 4 μL |
| Ptm | 1 mg/mL | 4 μL |
| Inh | 1 mg/mL | 40 μL |
| LFX | 1 mg/mL | 40 μL |
| LZD | 1 mg/mL | 40 μL |
| Mfx | 1 mg/mL | 40 μL |
| Pza | 1 mg/mL | 40 μL |
Tabela 2. Quantidade de cada padrão de referência de droga para adicionar ao frasco "Ref Std Mix 1".
| Nome do rótulo | Frasco extraído de | Volume adicionado |
| C0 | N/A | 0 μL |
| C1 | Ref Std Mix df1000 | 5 μL |
| C2 | Ref Std Mix df1000 | 10 μL |
| C3 | Ref Std Mix df1000 | 20 μL |
| C4 | Ref Std Mix df100 | 5 μL |
| C5 | Ref Std Mix df100 | 10 μL |
| C6 | Ref Std Mix df100 | 20 μL |
| C7 | Ref Std Mix df10 | 5 μL |
| C8 | Ref Std Mix df10 | 10 μL |
| C9 | Ref Std Mix df10 | 20 μL |
| C10 | Ref Std Mix df1 | 5 μL |
| C11 | Ref Std Mix df1 | 10 μL |
Tabela 3. Quantidade de cada intermediário Ref Std Mix para adicionar aos 12 pontos de calibração.
| Tempo Total (min) | Vazão (μL/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
Tabela 4. A taxa de fluxo e o gradiente de fase móvel utilizados para cada injeção.
| Ponto de calibração | Concentração real de BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) | Concentração real de INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg) |
| C0 | 0 | 0 |
| C1 | 0.005 | 0.05 |
| C2 | 0.01 | 0.1 |
| C3 | 0.02 | 0.2 |
| C4 | 0.05 | 0.5 |
| C5 | 0.1 | 1 |
| C6 | 0.2 | 2 |
| C7 | 0.5 | 5 |
| C8 | 1 | 10 |
| C9 | 2 | 20 |
| C10 | 5 | 50 |
| C11 | 10 | 100 |
Tabela 5. Concentração final de analytes em cada ponto de calibração.
| Droga | Lod (ng/mg de cabelo) |
LLOQ (ng/mg de cabelo) |
ULOQ (ng/mg de cabelo) |
Valores amostrais (cabelo ng/mg) Amostras: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109 |
| Bedaquilina | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| Clofazimine | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| Ethambutol | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| Ethionamide | 0.01 | 0.01 | 10 | |
| Isoniazid | 0.05 | 0.5 | 100 | |
| Levofloxacin | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| Linezolid | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| Moxifloxacina | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| Pretomanida | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| Prothionamida | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| Pirazinamida | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
Tabela 6. Níveis representativos de medicamentos medidos em 15 pacientes que tomam medicamentos dr-TB sob DOT. Para comparação, são dados o limite de detecção (LOD), o limite inferior de quantificação (LLOQ) e o limite superior de quantificação (ULOQ) do método para cada droga.
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Discussion
Relatamos aqui o protocolo para o método que desenvolvemos e validamos para quantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados no tratamento de DR-TB em pequenas amostras de cabelo utilizando LC-MS/MS. Nenhum outro método para quantificar essas 11 drogas em cabelos foi previamente desenvolvido, validado e publicado. Nosso método pode quantificar os níveis de sub-nanogramas de drogas em apenas 20-30 fios de cabelo de aproximadamente 3 centímetros (cm) de comprimento (~2 mg) e já foi validado22. O baixo peso do cabelo analisado significa que os pacientes envolvidos no estudo podem participar discretamente e potencialmente retornar para testes repetidos sem medo de expor o couro cabeludo careca. Publicamos anteriormente dados sobre a associação entre os níveis de medicamentos DR-TB nos desfechos de tratamento de DB23. Portanto, o desenvolvimento e validação deste método de painel multi-analyte representa um avanço significativo no campo do monitoramento de medicamentos terapêuticos DR-TB.
O cabelo requer técnicas de homogeneização diferentes das exigidas com biomatrices líquidos. A pulverização dos fios de cabelo permitiu acesso eficiente de solvente de extração a analytes na matriz capilar. Assim, uma característica importante do nosso método é o processo de extração rápida e fácil de medicamentos a partir de cabelos usando as amostras pulverizadas. O tempo de incubação durante o processo de extração é de apenas dois h, devido à grande área de superfície acessível do cabelo pulverizado, e não há etapa de limpeza, devido ao pequeno tamanho da amostra (2 mgs). Deve-se tomar cuidado, porém, para limitar a degradação da droga durante o processo de extração. O protocolo utiliza uma pulverização de dois ciclos, com um período de resfriamento de 45 s entre os ciclos. Esse processo evita o superaquecimento e potencialmente degrada as drogas no cabelo.
Ao contrário de muitas análises capilares para drogas de abuso, este método não usa uma etapa de lavagem. Os medicamentos DR-TB vêm em forma de cápsula ou comprimido, limitando possíveis fontes de contaminação externa e a subsequente necessidade de lavar cabeloantes da análise. Estudos futuros poderiam analisar solvente de lavagem de cabelos de pacientes com TB-DR para avaliar a contaminação externa.
Embora a pulverização capilar promova uma extração eficiente de drogas, ela tem suas próprias limitações. Nosso laboratório descobriu que se o cabelo é pulverizado no ruptor de abelhas e deixado à temperatura ambiente, a concentração de algumas das 11 drogas diminui ao longo de semanas e meses. Isso pode ser devido à grande área superficial do cabelo pulverizado exposto à atmosfera que pode promover oxidação e outras reações de degradação. Se um estudo de estabilidade dos medicamentos no cabelo for desejado, o cabelo pode ser cortado com tesoura em pequenos segmentos de <1 cm, homogeneizado à mão, e depois deixado à temperatura ambiente por semanas ou meses durante o estudo de estabilidade. Quando este corte de cabelo é pulverizado no dia da análise, não observamos nenhuma degradação significativa da droga ao longo do tempo. Assim, ao realizar o protocolo descrito, recomendamos que os cabelos sejam pulverizados no dia em que forem extraídos. Da mesma forma, todas as misturas de medicamentos abaixo de 10 μg/mL devem ser preparadas no dia da extração.
Não estão disponíveis métodos previamente publicados para avaliar a adequação das faixas dinâmicas lineares (LLOQ-ULOQ) que estabelecemos para cada droga de TB no método multi-analyte. No entanto, a amostra de conveniência de amostras de cabelo do Cabo Ocidental, África do Sul, indica a adequação do alcance dinâmico linear deste método. Com exceção da ethionamida, pretomanida e prothionamida, mais de 95% dos níveis de medicamentos que medimos nesses pacientes estão dentro do intervalo dinâmico linear de cada análio. Apenas um paciente estava tomando pretomanide (que foi detectado), e nenhum paciente estava tomando prothionamida. Para a etionamida, temos a hipótese de que a droga não pode se depositar bem na matriz capilar, pois nosso LOD é 0,01 ng/mg de cabelo (ou 10 ppg/mg de cabelo) e ainda assim apenas um dos oito pacientes que tomam ethionamida tem níveis superiores a 0,02 ng/mg de cabelo. Um exame mais aprofundado é necessário para determinar a farmacocinética de diferentes drogas de TB no cabelo. Por exemplo, uma alternativa potencial para monitorar drogas como a ethionamida é desenvolver um método direcionado aos seus metabólitos. Fizemos uma observação semelhante para delamanid, um novo medicamento DR-TB, que inicialmente fazia parte deste painel. Um método direcionado ao metabólito de delamanide está atualmente em processo de validação em nosso laboratório, porque o metabólito é encontrado em concentrações mais altas do que a droga-mãe. O mesmo procedimento pode ser realizado para ethionamida. As concentrações de medicamentos na Tabela 6 são apresentadas em grupo porque os resultados individuais e os desfechos clínicos não são o foco deste artigo do método. A avaliação individual desse grupo de pacientes foi publicada em outros lugares23.
Os pacientes que contribuíram com amostras de cabelos pequenos para o estudo de demonstração foram administrados uma variedade de regimes medicamentosos via DOT em ambiente de internação, e todos os regimes foram documentados de acordo com os registros de enfermagem durante o período de internação. No entanto, como é comum entre os pacientes com TB-DR, regimes medicamentosos anteriores e mal documentados também haviam sido administrados antes de sua internação. Isso levou à detecção de medicamentos no cabelo do paciente que não foram notados em seus registros de internação. Portanto, não pudemos utilizar essas amostras para determinar a especificidade do método, pois não pudemos determinar se essas amostras eram realmente falsos positivos. Em vez disso, testamos cabelos de pacientes que não estavam tomando drogas DR-TB. Não foram detectados medicamentos DR-TB nestas amostras, indicando que o método é específico.
Embora nosso método demonstre a utilidade do uso do cabelo na medição de medicamentos DR-TB, a análise capilar tem seu próprio conjunto de limitações. Como o cabelo é uma matriz sólida, a pisão dos padrões de referência de medicamentos durante a validação do método não permite a integração total dos padrões na matriz como com urina e sangue. Assim, a avaliação da recuperação limita-se à detecção de drogas após a espetada na matriz sólida, e não à recuperação real da matriz. Da mesma forma, como o cabelo é uma matriz alternativa que ainda está sendo explorada para testes, não há faixas de referência prontamente disponíveis para medicamentos disponíveis para avaliar a adequação do método. Mais estudos farmacocinéticos sobre a incorporação de medicamentos em cabelos serão úteis para entender melhor a utilidade dos níveis de medicamentos capilares no monitoramento de adesão. Finalmente, a coleta adequada de amostras de cabelo em locais de campo tem seus próprios desafios únicos. Embora a coleta e o armazenamento de amostras de cabelo exijam menos recursos do que outros biomatrices, deve-se tomar cuidado para identificar as extremidades distais e proximais de quaisquer fios de cabelo maiores que 2 cm. Fios de cabelo mais longos podem ter diferentes concentrações de drogas ao longo do fio, dependendo do uso de medicamentos ao longo do tempo. A rotulagem adequada permite a análise de segmentos específicos dos fios; no caso do nosso método, os três centímetros de cabelo mais próximos ao couro cabeludo foram utilizados para determinar os dados mais recentes sobre a adesão aos medicamentos. A rotulagem adequada requer treinamento e procedimentos de garantia de qualidade nos locais.
Em resumo, desenvolvemos o primeiro painel multi-anallyte para análise de medicamentos de TB utilizados para DR-TB via LC-MS/MS em pequenas amostras de cabelo. Dada a viabilidade de coletar e armazenar cabelos em ambientes limitados a recursos, nosso método representa um avanço potencialmente significativo no campo do monitoramento de medicamentos terapêuticos da TB. Medidas objetivas de exposição a medicamentos que levem em conta tanto a adesão quanto a variabilidade farmacocinética individual podem fornecer indicação precoce de regimes de tratamento ineficazes, auxiliando tanto o tratamento individual quanto limitando a transmissão comunitária de DR-TB24.
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Disclosures
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe e Monica Gandhi).
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao professor Keertan Dheda, ao Dr. Ali Esmail e a Marietjie Pretorius, do Instituto de Pulmão da Universidade da Cidade do Cabo, que facilitaram a coleta de amostras de cabelo para o estudo. Os autores reconhecem ainda com gratidão as contribuições dos participantes deste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
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