Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

छोटे बालों के नमूनों में 11 दवा प्रतिरोधी टीबी दवाओं की मात्रा के लिए मान्य एलसी-एमएस/एमएस पैनल

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60861
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

Summary

जटिल दवा प्रतिरोधी तपेदिक (डीआर-टीबी) आहार के रोगियों के पालन का विश्लेषण करने के वर्तमान तरीके गलत और संसाधन-प्रधान हो सकते हैं । हमारी विधि 11 DR-TB दवाओं की सांद्रता के लिए बालों, एक आसानी से एकत्र और संग्रहीत मैट्रिक्स का विश्लेषण करती है। एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके, हम उप-नैनोग्राम दवा के स्तर का निर्धारण कर सकते हैं जिसका उपयोग दवा पालन को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है ।

Abstract

दवा प्रतिरोधी तपेदिक (डीआर-टीबी) एक बढ़ते सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा है, और चिकित्सीय दवा के स्तर के आकलन के महत्वपूर्ण नैदानिक लाभ हो सकते हैं । प्लाज्मा दवा का स्तर वर्तमान सोने के मानक आकलन कर रहे हैं, लेकिन phlebotomy और एक ठंडी श्रृंखला की आवश्यकता है, और केवल बहुत हाल ही में पालन पर कब्जा । हमारी विधि बालों का उपयोग करती है, एक मैट्रिक्स जो आसानी से एकत्र किया जाता है और दीर्घकालिक पालन को प्रतिबिंबित करता है, 11 एंटी-टीबी दवाओं के लिए परीक्षण करने के लिए। हमारे समूह द्वारा पिछले काम से पता चलता है कि बालों में एंटीरेट्रोवायरल दवा का स्तर एचआईवी परिणामों के साथ जुड़े रहे हैं । डॉ-टीबी दवाओं के लिए हमारी विधि 2 मिलीग्राम बालों (जड़ तक 3 सेमी समीपस्थ) का उपयोग करती है, जिसे मेथनॉल में स्पंदित और निकाला जाता है। नमूनों का विश्लेषण एक एलसी-एमएस/एमएस विधि के साथ किया जाता है, जो 16 मिन रन में 11 दवाओं की मात्रा निर्धारित करता है । 11 दवाओं के लिए क्वांटिफिकेशन (एलओओक्यू) की कम सीमा०.०१ एनजी/एमजी से लेकर 1 एनजी/एमजी तक है । दवा की उपस्थिति दो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री संक्रमण के अनुपात की तुलना करके पुष्टि की है । नमूनों को दवा के क्षेत्र अनुपात का उपयोग करके deuterated, 15एन-या 13सी-लेबल वाली दवा आइसोटोपोलोग को निर्धारित किया जाता है । हमने 0001-100 एनजी/एमजी से लेकर अंशांकन वक्र का उपयोग किया । सीधे मनाया चिकित्सा (डॉट) पर डॉ टीबी रोगियों से एकत्र बालों के नमूनों की एक सुविधा नमूने के लिए विधि का आवेदन ग्यारह दवाओं में से नौ की रैखिक गतिशील रेंज के भीतर बालों में दवा के स्तर का संकेत (isoniazid, pyrazinamide, एथबुटोल, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, बेडक्विलिन, प्रीटोमैनिड) । कोई रोगी प्रोथिओमाइड पर नहीं था, और एथिओनेमाइड के लिए मापा स्तर अपने LLOQ के करीब थे (आगे के काम के बजाय निगरानी जोखिम के लिए एथिओमाइड के मेटाबोलाइट की उपयुक्तता की जांच) । सारांश में, हम दवा प्रतिरोधी टीबी उपचार के दौरान चिकित्सीय दवा निगरानी के लिए एक तकनीक के रूप में बालों में डॉ टीबी दवाओं के लिए एक बहु-एनालाइट पैनल के विकास का वर्णन करते हैं ।

Introduction

इक्कीसवीं सदी में, दवा प्रतिरोधी टीबी (DR-TB) पहले से ही कमजोर राष्ट्रीय टीबी नियंत्रण कार्यक्रमों के लिए एक उभरती तबाही है, पुष्टि मामलों के साथ पिछले 5 वर्षों में दोहरीकरण अकेले, सभी रोगाणुरोधी प्रतिरोध से संबंधित मौतों के लगभग एक तिहाई के लिए लेखांकन विश्व स्तर पर1,,2। डॉ टीबी के सफल उपचार के लिए दवा के प्रति संवेदनशील टीबी के उपचार की तुलना में पारंपरिक रूप से लंबी और अधिक विषाक्त दूसरी पंक्ति के आहार की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, डॉ टीबी के रोगियों के पास अक्सर पालन के लिए महत्वपूर्ण पहले से मौजूद चुनौतियां होती हैं, जिसने शुरू में प्रतिरोध के उद्भव में योगदान दिया।

एचआईवी संक्रमण के विपरीत जहां वायरल भार का उपयोग उपचार की निगरानी के लिए किया जा सकता है, टीबी में उपचार प्रतिक्रिया के सरोगेट अंत बिंदुओं में देरी होती है और व्यक्तिगत स्तर4पर अविश्वसनीय होती है। रोगी पालन की निगरानी, उपचितरोगीय एंटी टीबी दवा एकाग्रता और उपचार विफलता का एक महत्वपूर्ण कारक, भी चुनौतीपूर्ण है । स्वयं की रिपोर्ट पालन याद पूर्वाग्रह और प्रदाताओंकोखुश करने की इच्छा5,6से ग्रस्त है । गोली मायने रखता है और दवा घटना निगरानी प्रणाली (MEMS) अधिक उद्देश्य7 हो सकता है, लेकिन वास्तविक दवा की खपत8,,9,,10उपाय नहीं है । बायोमैट्रिस में दवा का स्तर पालन और फार्माकोकिनेटिक डेटा दोनों प्रदान कर सकता है। इसलिए, प्लाज्मा दवा के स्तर का उपयोग आमतौर पर चिकित्सीय दवा निगरानी11,12में किया जाता है। हालांकि, दवा पालन निगरानी के संदर्भ में, प्लाज्मा का स्तर अल्पकालिक जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है और उचित पालन संदर्भ सीमा का निर्धारण करते समय महत्वपूर्ण अंतर-और अंतर-रोगी परिवर्तनशीलता द्वारा सीमित होते हैं। "सफेद कोट" प्रभाव, जहां पालन क्लिनिक या अध्ययन यात्राओं से पहले सुधार, आगे प्लाज्मा के स्तर की क्षमता को जटिल करने के लिए सटीक दवा पालन पैटर्न13प्रदान करते हैं ।

बाल एक वैकल्पिक बायोमैट्रिक्स है जो दीर्घकालिक दवा एक्सपोजर14,15को माप सकता है । कई दवाएं और अंतर्जात मेटाबोलाइट्स बालों के बढ़ने के साथ ही सिस्टमिक सर्कुलेशन से हेयर प्रोटीन मैट्रिक्स में शामिल होते हैं। चूंकि यह गतिशील प्रक्रिया बालों के विकास के दौरान जारी रहती है, इसलिए बाल मैट्रिक्स में जमा दवा की मात्रा परिसंचरण में दवा की निरंतर उपस्थिति पर निर्भर करती है, जिससे बालों को दवा के सेवन का एक उत्कृष्ट अस्थायी रीडआउट बना दिया जाता है। बायोमैट्रिक्स के रूप में बालों को रक्त की तुलना में भंडारण और शिपमेंट के लिए कोल्ड चेन की आवश्यकता के बिना आसानी से एकत्र होने का अतिरिक्त लाभ होता है। इसके अलावा, बाल गैर-बायोखतरनाक है, जो क्षेत्र में अतिरिक्त व्यवहार्यता लाभ प्रदान करता है।

बालों की दवा के स्तर लंबे समय से फोरेंसिक अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है16। पिछले दशक में, बाल एंटीरेट्रोवाइरल (एआरवी) के स्तर ने एचआईवी उपचार और रोकथाम में दवा पालन का आकलन करने में उपयोगिता का प्रदर्शन किया है, जिसके लिए हमारे समूह ने योगदान दिया । बालों में एआरवी का स्तर एचआईवी संक्रमण17, 18,,,19,20,,1821में उपचार परिणामों का सबसे मजबूत स्वतंत्र भविष्यवक्ता ओं को दिखाया गया है . यह निर्धारित करने के लिए कि क्या डॉ-टीबी रोगियों के बालों के स्तर में उपचार परिणाम की भविष्यवाणी करने में एक ही उपयोगिता होगी, हमने छोटे बालों के नमूनों में 11 डीआर-टीबी दवाओं का विश्लेषण करने के लिए एक विधि विकसित करने और मान्य करने के लिए एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग किया । परख के प्रदर्शन के प्रारंभिक आकलन के रूप में, हमने डॉ-टीबी के रोगियों के सुविधा नमूने में डीआर-टीबी दवाओं के स्तर को मापा, जो पश्चिमी केप, दक्षिण अफ्रीका22में सीधे देखी गई चिकित्सा (डॉट) प्राप्त करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी रोगियों को बाल नमूना संग्रह से पहले लिखित सूचित सहमति प्रदान की है । हमने यूनिवर्सिटी ऑफ केपटाउन और यूनिवर्सिटी ऑफ कैलिफोर्निया, सैन फ्रांसिस्को से इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड की मंजूरी हासिल की ।

1. बाल नमूना

  1. लिखित सूचित सहमति प्राप्त करें।
  2. संभव के रूप में खोपड़ी क्षेत्र से लगभग 20-30 खोपड़ी बाल किस्में कटौती करने के लिए साफ कैंची का प्रयोग करें ।
  3. दिशात्मकता को इंगित करने के लिए बालों के डिस्टल साइड के चारों ओर टेप रखें। एक एल्यूमीनियम पन्नी वर्ग में बाल नमूना गुना और कमरे के तापमान पर स्टोर। समीपस्थ अंत की अतिरिक्त हैंडलिंग से संभावित संदूषण से बचने के लिए बालों के डिस्टल अंत को लेबल करें।
  4. रोगी के नमूनों के अलावा, "खाली बाल" इकट्ठा करें: किसी ऐसे व्यक्ति से खोपड़ी बाल का नमूना जो टीबी की दवा नहीं ले चुका है। प्रत्येक 20 रोगी के नमूनों के लिए एक बड़ी राशि (>30 मिलीग्राम खाली बाल) एकत्र करें।

2. दवा निकालने

  1. लेबल बीड ट्यूब। प्रत्येक रोगी के नमूने के लिए एक ट्यूब की आवश्यकता होती है। लेबल 12 ट्यूबों "C0" से "C11", 12 अंशांकन अंक में से प्रत्येक के लिए एक । कम गुणवत्ता वाले नियंत्रण के लिए एक ट्यूब, मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक ट्यूब और उच्च गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक ट्यूब लेबल। अंत में, मैट्रिक्स ब्लैंक के लिए एक ट्यूब लेबल।
  2. बालों के नमूने युक्त एल्यूमीनियम पन्नी वर्ग खोलें। यदि बालों का नमूना 3 सेमी से अधिक लंबा है, तो समीपस्थ अंत से 3 सेमी पर बाल काट लें और विश्लेषण के लिए उस समीपस्थ हिस्से का उपयोग करें।
  3. बालों के नमूने का 2 मिलीग्राम एक बीड ट्यूब में वजन करें।
  4. 16 अतिरिक्त बीन ट्यूब में खाली बालों के 2 मिलीग्राम वजन। इनका उपयोग अंशांकन बिंदुओं, गुणवत्ता नियंत्रण और मैट्रिक्स ब्लैंक के रूप में किया जाएगा। ट्यूब रोगी के नमूनों के रूप में एक ही निष्कर्षण प्रक्रिया का पालन करेंगे, एक तरफ से चरण २.८ और २.९ में इंगित स्तरों पर दवा संदर्भ मानकों के साथ नुकीला जा रहा है ।
  5. सभी बीड ट्यूबों को समरूपता में रखें। गति 6.95 मीटर /s पर समरूपता चलाने के लिए 30 एस प्रत्येक के दो चक्रों के लिए चलाने के लिए, दो चक्रों के बीच में एक 15 एस आराम की अवधि के साथ।
  6. आंतरिक मानक मिश्रण करें और इसे नमूनों में जोड़ें।
    1. एक 50 mL वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क करने के लिए मेथनॉल के ~ 40 mL जोड़ें।
    2. एंबर ग्लास शीशियों में, मेथनॉल को सॉल्वेंट के रूप में उपयोग करते हुए टेबल 1में दिखाए गए आंतरिक मानकों के घोला जा सकता है।
      नोट: मेथनॉल बहुत अस्थिर है। वाष्पीकरण के कारण होने वाले नुकसान को रोकने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान सभी शीशियों को छाया छोड़ दें।
    3. उन घोला जा सकता है से, तालिका 1 में दिखाए गए वॉल्यूम को 50 एमएल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में जोड़ें। फिर, फ्लास्क को मेथनॉल से 50 मीटर तक भरें।
    4. कैप और वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क मिलाएं। मैट्रिक्स ब्लैंक ट्यूब को छोड़कर, प्रत्येक पल्वराइज्ड हेयर ट्यूब में मिश्रण का 500 माइक्रोन जोड़ें। मैट्रिक्स ब्लैंक ट्यूब में 500 माइक्रोन मेथनॉल जोड़ें।
  7. संदर्भ मानक घोला जा सकता है।
    1. चरण 2.7.2 में तालिका में दिखाई गई एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मेथनॉल के साथ निम्नलिखित दवाओं के साफ संदर्भ मानकों का गठन करें। निम्नलिखित सांद्रता का केवल 1 mL आवश्यक है।
    2. एक शीशी में मेथनॉल के 1768 माइक्रोन जोड़ें, और फिर 2 मिलील अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए तालिका 2 में सूचीबद्ध संदर्भ मानक की मात्रा को उसी शीशी में जोड़ें। इस शीशी "रेफरी एसटीडी मिक्स 1x" लेबल करें। भंवर.
    3. स्पाइक 100 μL से "रेफरी एसटीडी मिक्स 1x" में 900 μL मेथनॉल में एक नई शीशी में। इस शीशी "रेफरी एसटीडी मिक्स 10x" लेबल करें। भंवर.
    4. एक नई शीशी में 900 μL मेथनॉल में "रेफरी एसटीडी मिक्स 10x" से स्पाइक 100 माइक्रोन। इस शीशी "रेफरी एसटीडी मिक्स 100x" लेबल करें। भंवर.
    5. एक नई शीशी में 900 μL मेथनॉल में "रेफरी एसटीडी मिक्स 100x" से स्पाइक 100 μL। इस शीशी "रेफरी एसटीडी मिक्स 1000x" लेबल करें। भंवर.
  8. टेबल 3में वर्णित रेफरी एसटीडी मिक्स की मात्रा जोड़कर अंशांकन वक्र ट्यूबों को स्पाइक करें।
  9. क्यूसी मिक्स और स्पाइक क्वालिटी कंट्रोल ट्यूब बनाएं।
    1. "क्यूसी-ई" के माध्यम से लेबल 5 शीशियां "क्यूसी-ए" ।
    2. पांच लेबल शीशियों के लिए मेथनॉल की निम्नलिखित मात्रा जोड़ें:
      क्यूसी-ए: 990 माइक्रोन
      क्यूसी-बी: 940 माइक्रोन
      क्यूसी-सी: 950 माइक्रोन
      क्यूसी-डी: 980 माइक्रोन
      क्यूसी-ई: 950 माइक्रोन
       
    3. चरण 2.7.1 में बनाए गए 1 मिलीग्राम/एमएल दवा शेयरों का उपयोग करके, नीचे सूचीबद्ध विशिष्ट शीशियों में 10 माइक्रोन जोड़ें। बीडीक्यू और सीएलएफ स्टॉक्स के लिए, जो ०.५ मिलीग्राम/mL पर हैं, नीचे सूचीबद्ध शीशियों में 20 माइक्रोन जोड़ें ।
      क्यूसी-ए: PTH
      क्यूसी-बी: ईएमबी, सीएलएफ, बीडीक्यू, पीटीएम
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      क्यूसी-डी: PTH, ईएमबी
      क्यूसी-ई: सीएलएफ, बीडीक्यू, पीटीएम

      नोट: कुछ दवाएं कई घोला जा सकता है में मौजूद हैं।
    4. एक शीशी को "क्यूसी-ए df100" के रूप में लेबल करें। क्यूसी-ए के 10 माइक्रोन को 990 माइक्रोन मेथनॉल में पतला करना।
    5. "कम क्यूसी स्टॉक" के रूप में एक शीशी लेबल। इस शीशी में 1832 माइक्रोन मेथनॉल जोड़ें। नीचे विस्तृत क्यूसी घोला जा सकता है की मात्रा जोड़ें:
      क्यूसी-ए df100: 80 μL
      क्यूसी-बी: 8 माइक्रोन
      क्यूसी-सी: 80 माइक्रोन
       
    6. "मिड क्यूसी स्टॉक" के रूप में एक शीशी लेबल। इस शीशी में 760 माइक्रोन मेथनॉल डालें। नीचे विस्तृत क्यूसी घोला जा सकता है की मात्रा जोड़ें:
      क्यूसी-ए df100: 800 μL
      क्यूसी-बी: 40 माइक्रोन
      क्यूसी-सी: 400 माइक्रोन
       
    7. "उच्च QC स्टॉक" के रूप में एक शीशी लेबल। इस शीशी में 1376 माइक्रोन मेथनॉल डालें। नीचे विस्तृत क्यूसी घोला जा सकता है की मात्रा जोड़ें:
      क्यूसी-डी: 160 माइक्रोन
      क्यूसी-ई: 320 माइक्रोन
      एमएफएक्स, 1mg/mL स्टॉक: 16 μL
      INH, 1mg/mL स्टॉक: ३२ μL
      LFX, 1mg/mL स्टॉक: ३२ μL
      LZD, 1mg/mL स्टॉक: ३२ μL
      PZA, 1mg/mL स्टॉक: ३२ μL
       
    8. कम क्यूसी बीड ट्यूब में स्पाइक 10 μL कम QC स्टॉक।
    9. मध्य क्यूसी बीड ट्यूब में स्पाइक 10 μL मिड क्यूसी स्टॉक।
    10. उच्च क्यूसी बीड ट्यूब में स्पाइक 10 μL उच्च QC स्टॉक।
  10. सभी ट्यूबों को 2 घंटे के लिए गर्म शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। मिलाते हुए काफी धीमी गति से होना चाहिए कि पानी ट्यूबों पर छप नहीं करता है ।
  11. शेकर से ट्यूब निकालें। मकाड ट्यूबों से तरल को नई माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। इन माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूब को उसी तरह लेबल करें।
  12. पुरानी ट्यूबों में 500 माइक्रोन मेथनॉल जोड़ें। कैप और भंवर।
  13. दूसरी बार, बीड ट्यूब ों से तरल को संबंधित माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पल्वेराइज्ड बालों को ट्रांसफर करना ठीक है। यह अंततः बाहर केंद्रित किया जाएगा ।
  14. 2,800 x ग्रामपर 10 मीटर के लिए माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  15. सावधानी से तरल को हटा दें और इसे इसी लेबल के साथ नई अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें। बालों की गोली को परेशान या ट्रांसफर न करें, इसका ध्यान रखें।
  16. अपकेंद्रित्र ट्यूबों में तरल को 32 डिग्री सेल्सियस पर सूखापन में वाष्पित करें।
  17. ड्राई ट्यूबों में मोबाइल फेज ए (1% फोरमिक एसिड के साथ एचपीएलसी ग्रेड पानी) के 200 माइक्रोन जोड़कर नमूनों का पुनर्गठन करें। भंवर.
  18. 250 μL आवेषण के साथ अंबर शीशियों के लिए तरल हस्तांतरण।

3. एलसी-एमएस/एमएस तैयारी

  1. एक लीटर वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में कुछ एचपीएलसी ग्रेड पानी जोड़कर मोबाइल फेज ए (1% फोरमिक एसिड के साथ एचपीएलसी-ग्रेड पानी) का एक लीटर बनाएं। फिर उस फ्लास्क में 10 एमएल >95% फॉर्मिक एसिड जोड़ें, और फिर एचपीएलसी-ग्रेड पानी के साथ लाइन में भरें।
    1. एक लीटर वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में कुछ एसीटोनिट्रिल जोड़कर मोबाइल फेज बी (0.1% फोरमिक एसिड के साथ एसीटोनिट्रिल) का एक लीटर बनाएं। फिर उस फ्लास्क में 1 mL >95% फॉर्मिक एसिड डालें, और फिर एसीटोनिट्रिल के साथ लाइन में भरें।
  2. 2.5 माइक्रोन कण आकार और ध्रुवीय एंडकैप्ड, ईथर से जुड़े फिनाइल मोतियों के साथ 100 Å पोर आकार के साथ 2 x 100 मिमी कॉलम स्थापित करें पूरी तरह से कॉलम डिब्बे में असुरक्षित सिलिका से बना है। सुनिश्चित करें कि कॉलम में निर्माता अनुशंसित गार्ड कारतूस भी स्थापित हैं।
  3. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और डबल क्लिक हार्डवेयर विन्यास खोलें। एलसीएमएस हाइलाइट करें और सक्रिय प्रोफ़ाइलपर क्लिक करें।
    1. नई उप-परियोजनापर क्लिक करें, या, यदि अन्य उप-परियोजनाएं पहले से मौजूद हैं, तो कॉपी उप-परियोजनापर क्लिक करें। उप-परियोजना का नाम।
    2. नए दस्तावेज़पर क्लिक करें । डबल क्लिक अधिग्रहण विधि। अधिग्रहण विधि खिड़की के भीतर मास कल्पना पर क्लिक करें।
    3. एमआरएम (एमआरएम)के लिए स्कैन प्रकार ड्रॉपडाउन बदलें । सुनिश्चित करें कि ध्रुवता सकारात्मककरने के लिए तैयार है ।
    4. आयात सूची पर क्लिक करें और .csv फ़ाइल एमडीआर-टीबी एलसीएमएस विधि संक्रमण का चयन करें जो पूरक सामग्री में शामिल है।
    5. नीचे स्क्रॉल करें और अवधि को 16.751 मिनट तक सेट करें। उचित चक्र समय और चक्र ों की संख्या ऑटो आबाद होगा ।
    6. लेफ्ट साइडबार में, क्लिक करें इंटीग्रेटेड वाल्को वाल्व। सुनिश्चित करें कि चरण 0 के लिए स्थिति का नाम ए है। कुल समय (मिन) कॉलम में, पहली पंक्ति में 0.4 में टाइप करें और दूसरी पंक्ति में 13।
    7. स्थिति कॉलम में, पंक्ति एक से बी और पंक्ति दो से ए सेट करें।
    8. लेफ्ट साइडबार में, बाइनरी पंपपर क्लिक करें। तालिका 4के अनुसार ढाल और प्रवाह दर तालिका निर्धारित करें।
    9. लेफ्ट साइडबार में क्लिक करें ऑटोसैंपलर। इंजेक्शन की मात्रा को बदलकर 10 माइक्रोन करें। क्लिक करें तापमान नियंत्रण सक्षम और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट।
    10. लेफ्ट साइडबार में, कॉलम कंपार्टमेंटपर क्लिक करें। दाएं और बाएं दोनों तापमान को 50 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    11. बंद करो और विधि को बचाने के लिए।
  4. नए दस्तावेज़ पर क्लिक करके और अधिग्रहण बैचका चयन करके बैच बनाएं । एक सेट नाम में टाइप करें और ड्रॉपडाउन बार से नवनिर्मित विधि का चयन करें।
    1. स्प्रेडशीट में, एक बैच बनाएं जो इस आदेश का पालन करता है: अंशांकन वक्र, गुणवत्ता नियंत्रण, रोगी के नमूने, अंशांकन वक्र, गुणवत्ता नियंत्रण, रोगी के नमूने, अंशांकन वक्र, गुणवत्ता नियंत्रण। रन के शुरू और अंत में सॉल्वेंट ब्लैंक इंजेक्शन जोड़ें, साथ ही अंशांकन वक्र, गुणवत्ता नियंत्रण और रोगी के नमूनों से पहले और बाद में। एनालिएट कैरीओवर को कम करने के लिए कैलिब्रेशन वक्र और उच्च गुणवत्ता वाले नियंत्रण शीशी के इंजेक्शन के बाद कम से कम आठ विलायक ब्लैंक इंजेक्शन डालें।
      नोट: कॉलम उम्र के आधार पर अधिक सॉल्वेंट ब्लैंक इंजेक्शन जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. नमूना नामों से सटे कॉलम में, संबंधित शीशी के लिए उपयुक्त ऑटोसैंपलर स्थिति में टाइप करें।
    3. ऐड सेटपर क्लिक करें. पॉप-अप विंडो में, बैच में नमूनों की संख्या में टाइप करें।
    4. स्प्रेडशीट से लेकर नवनिर्मित बैच तक सैंपल के नाम और शीशी लोकेशन की कॉपी और पेस्ट करें।
    5. सबमिट टैब पर जाएं। सबमिट बटन पर क्लिक करें।
  5. मोबाइल फेज ए में सॉल्वेंट लाइन ए डालकर इक्विब्रेट सिस्टम और मोबाइल फेज बी में सॉल्वेंट लाइन बी बाइनरी पंप पर शुद्ध वाल्व खोलें।
    1. 4 mL/मिन प्रवाह दर पर 50% बी के लिए विलायक संरचना सेट करें। बाइनरी पंप चालू करें।
    2. 5 मिन के बाद, 0.3 mL/min करने के लिए प्रवाह में कमी। शुद्ध वाल्व बंद करें। किसी भी लीक के लिए जांच करें ।
    3. सॉफ्टवेयर में, शीर्ष टूलबार पर प्रेस इक्विब्रेट करें। 5 मिन के लिए समय निर्धारित करें, ओकेदबाएं।
    4. उपकरण के समान होने के बाद, खिड़की के निचले दाईं ओर मॉड्यूल हरे दिखाई देंगे। उस दबाव को स्थिर करें, और फिर स्टार्ट सैंपलपर क्लिक करके बैच शुरू करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. बैच पूरा होने के बाद क्वांटिको सॉफ्टवेयर खोलें। एक नया परिणाम तालिका बनाने के लिए छड़ी आइकन पर क्लिक करें।
    1. उपयुक्त फ़ोल्डर पर नेविगेट करने के लिए ब्राउज़ करें, और फिर डेटा फ़ाइल को हाइलाइट करें और डेटा को चयनित क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए सही ओर इशारा करने वाले तीर पर क्लिक करें। आगेक्लिक करें ।
    2. नई विधि बनाएं और नईक्लिक करें चुनें। इनपुट नई मात्रा विधि नाम और प्रेस बचाओ और फिर अगले।
    3. मध्य अंशांकन बिंदु के पहले इंजेक्शन का चयन करें। प्रेस नेक्स्ट।
    4. टिक आईएस कॉलम में आंतरिक मानकों के सभी संक्रमणों को चिह्नित करते हैं।
    5. संदर्भ मानकों के लिए क्वांटिफायर संक्रमण के लिए, आईएस नाम कॉलम में इसी का चयन करें। आगेक्लिक करें ।
    6. यह आश्वासन देने के लिए संक्रमण के माध्यम से स्क्रॉल करें कि स्वचालित रूप से चयनित प्रतिधारण समय सटीक है। सुनिश्चित करें कि गॉसियन स्मूदिंग 1.5 के लिए सेट है। अन्य सभी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के रूप में रह सकते है (यानी, शोर प्रतिशत 100%, बेसलाइन उप. विंडो 2.00 मिन, पीक बंटवारे 2 अंक)।
      नोट: यदि चाहते हैं, तो इस बिंदु पर स्वचालित एकीकरण मापदंडों को संशोधित करें। चूंकि इन मापदंडों में इंस्ट्रूमेंट सेटअप के आधार पर बदलाव होता है, इसलिए हमने यहां हमारा शामिल नहीं किया है ।
    7. बैच के लिए मात्रा विधि लागू करने के लिए खत्म क्लिक करें ।
  2. क्रोमेटोग्राम देखने के लिए टॉप लेफ्ट डिस्प्ले पीक रिव्यू बटन पर क्लिक करें। बाएं साइडबार का उपयोग करके संक्रमण के माध्यम से नेविगेट करें। हर क्वांटिफायर संक्रमण के प्रत्येक इंजेक्शन के माध्यम से स्क्रॉल करें और यदि आवश्यक हो तो मैन्युअल रूप से सही चोटी को एकीकृत करें।
    1. एक चोटी को मैन्युअल रूप से एकीकृत करने के लिए, सक्षम मैनुअल एकीकरण मोड बटन पर क्लिक करें, एक्स-या वाई-एक्सिस के साथ क्लिक और खींचकर क्रोमेटोग्राम में ज़ूम करें, और फिर चोटी को परिभाषित करते हुए एक बेसलाइन से दूसरी बेसलाइन तक एक लाइन खींचें। चित्रा 3 दो क्रोमेटोग्राम दिखाता है: एक जिसमें आईएच है, और इसलिए मैन्युअल रूप से एकीकृत किया गया है, और दूसरा जिसमें आईएनएच नहीं है।
      नोट: सभी इंजेक्शन एक ही मापदंडों का उपयोग कर एकीकृत किया जाना चाहिए। पीक चौड़ाई इन मापदंडों का पालन करने के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान कर सकती है, लेकिन कभी-कभी चोटी की चौड़ाई अलग-अलग होगी। एक चोटी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्रतिधारण समय उस एनालाइट (संदर्भ मानक चोटियों द्वारा परिभाषित) के लिए अपेक्षित प्रतिधारण समय के ± 0.15 मिनट के भीतर होना चाहिए, गुणात्मक रूप से क्वालीफायर अनुपात के लिए अपेक्षित मात्रा होने के रूप में पुष्टि की गई (जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है), और 10 से अधिक का सिग्नल-टू-शोर अनुपात होना चाहिए।
  3. नमूना प्रकार कॉलम में, अंशांकनवक्र इंजेक्शन (खाली अंशांकन वक्र इंजेक्शन के अपवाद के साथ) मानक के लिए सेट करें। गुणवत्ता नियंत्रण इंजेक्शन को गुणवत्ता नियंत्रण के लिए सेट करें। शेष इंजेक्शन को अज्ञातके रूप में छोड़ दें।
    नोट: यह सभी संक्रमणों में सेट किया जाएगा।
  4. वास्तविक एकाग्रता कॉलम में, सभी अंशांकन वक्र और गुणवत्ता नियंत्रण इंजेक्शन के लिए तालिका 5 में पाए जाने वाले सांद्रता में टाइप करें।
  5. ऊपर बाएं से दूसरे पर क्लिक करें अंशांकन वक्र बटन प्रदर्शित करता है । प्रतिगमन बटन पर क्लिक करें।
  6. 1/x के लिए भार प्रकार सेट और ठीकप्रेस ।
  7. अंशांकन वक्र और गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों को मान्य करने के लिए विश्वास दिलाता है कि बैच सफलतापूर्वक भाग गया ।
    1. प्रत्येक क्वांटिफायर संदर्भ संक्रमण (आंतरिक मानक संक्रमण नहीं) के लिए, प्रत्येक अंशांकन वक्र इंजेक्शन सटीकता (सटीकता कॉलम में) को देखें। अंशांकन अंक के कम से कम दो तिहाई 80-120% के भीतर एक सटीकता होनी चाहिए।
    2. जांच बिंदुओं के लिए अभी तक अपेक्षित सटीकता के बाहर, इंजेक्शन एक आउटलियर हो सकता है। आउटलर्स को बाहर करें यदि उनकी गणना की गई एकाग्रता उस शीशी के अन्य दो इंजेक्शन से दो मानक विचलन से अधिक दूर है। "एट पीक टू द हर क्रोमेटोग्राम के ऊपरबटन नहीं मिला।
    3. जांच लें कि अंशांकन वक्र के ऊपर प्रदर्शित आर-वैल्यू है >0.975।
    4. जांच लें कि सभी गुणवत्ता नियंत्रण इंजेक्शन 80-120% के भीतर एक सटीकता है।
  8. यदि उपरोक्त सभी शर्तें संतुष्ट हैं, तो बैच पारित हो गया है, और नमूनों की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। टूलबार में एडिट पर क्लिक करें, फिर कॉपी पूरी टेबलपर क्लिक करें । टेबल को स्प्रेडशीट में चिपका दें।
  9. प्रत्येक नमूने की रिपोर्ट एकाग्रता निर्धारित करने के लिए दो नमूना इंजेक्शन की गणना एकाग्रता का औसत लें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सभी11 डीआर-टीबी दवाओं के पुष्ट स्तरों के साथ एक क्रोमेटोग्राम का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है । विभिन्न उपकरणों और स्तंभों का उपयोग करते समय प्रत्येक एनालेइट के लिए प्रतिधारण समय बदल सकता है, इसलिए सटीक प्रतिधारण समय व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

एक विशेष दवा (isoniazid, INH) के लिए निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम (ईआईसी) अंशांकनों में से एक में (डॉ-टीबी दवा संदर्भ मानकों के साथ नुकीला खाली बाल नमूना) चित्रा 2में दिखाए गए हैं । क्वांटिफायर और क्वालीफायर संक्रमण का उपयोग दवा की उपस्थिति की गुणात्मक पुष्टि करने के लिए किया जाता है, क्योंकि क्वांटिफायर के क्षेत्र और क्वालीफायर के क्षेत्र के बीच अनुपात नमूनों में स्थिर रहता है । आंतरिक मानक की भी निगरानी की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक नमूना इंजेक्शन सामान्यीकृत हो।

प्रदर्शन के प्रयोजनों के लिए, हम पश्चिमी केप, दक्षिण अफ्रीका से डॉट शर्तों के तहत डॉ टीबी दवाओं लेने के ९६ रोगियों की कुल अध्ययन आबादी के बीच 15 बालों के नमूनों की एक सुविधा नमूने का विश्लेषण किया । तालिका 6 प्रत्येक एनालेट के लिए मापा गया सबसे कम और उच्चतम स्तर पर डीआर-टीबी दवाओं के प्रतिनिधि स्तर प्रस्तुत करता है । हालांकि 15 रोगी के नमूनों के लिए डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं, प्रत्येक विश्लेषण 15 स्तरों की सूचना नहीं थी क्योंकि प्रत्येक रोगी DR-टीबी दवाओं के एक अलग संयोजन पर है । कोई भी मरीज प्रोथिओमाइड पर नहीं था और सिर्फ एक ही मरीज प्रीटोमैनिड ले रहा था ।

Figure 1
चित्रा 1. डॉ-टीबी विधि (ईएमबी = एथमबुटोल) में 11 एनालाइट्स की चोटियों को दिखाने वाले प्रतिनिधि क्रोम्टोग्राम का एक उदाहरण; INH= isoniazid; PZA = पायराज़िनामाइड; ETH = एथिओनामाइड; पीटीएच = प्रोथिओनामाइड; एलएफएक्स = लेवोफ्लोक्सासिन; एमएफएक्स= मोक्सीफ्लोक्सासिन; LZD = linezolid; पीटीएम = प्रीटोमैनिड; BDQ = bedaquiline; सीएलएफ = क्लोफाज़िमाइन)। क्योंकि प्रत्येक एनालिएट के लिए विधि की संवेदनशीलता अलग है, INH, LZD, LFX, MFX और LZD 20 एनजी/एमजी बालों पर नुकीला थे, जबकि BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH और PTM 2 एनजी/एमजी बालों पर नुकीला थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. 20 एनजी/एमजी पर अंशांकन बिंदु 9 (C9), isoniazid (INH) के एक इंजेक्शन से दो निकाले आयन क्रोमेटोग्राम (EICs) । शीर्ष ईआईसी दोनों INH क्वांटिफायर संक्रमण (नीले, लेबल INH-2) और INH क्वालीफायर संक्रमण (लाल, INH-3 लेबल) से पता चलता है । नीचे ईआईसी INH-d4 की प्रतिक्रिया दिखाता है, आंतरिक मानक (आईएस) INH की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3. मात्रा की प्रक्रिया के स्क्रीनशॉट। शीर्ष भाग एक आंशिक नमूना सूची है जिसमें 12 अंशांकन बिंदुओं (लेबल वाले C0-C11), तीन क्यूसी स्तर ों और छह नमूनों में एक विश्लेषण (आईएनएच, isoniazid) के लिए इंजेक्शन डेटा दिखाया गया है। नीचे का बायां हिस्सा कैलिब्रेशन कर्व है, जिसमें 0.5 एनजी/एमजी-100 एनजी/एमजी से लेकर अपारदर्शी ब्लू डॉट्स कैलिब्रेशन पॉइंट्स हैं। पारदर्शी नीले वर्ग गुणवत्ता नियंत्रण बिंदु हैं। आर-वैल्यू को 1/x भार के साथ शीर्ष बाएं (0.99722) में दिखाया गया है। नीचे दाईं ओर दो क्रोमेटोग्राम आईएनएच (शीर्ष क्रोमेटोग्राम) के साथ एक नमूना और आईनएएच (नीचे क्रोमेटोग्राम) के बिना एक नमूना वर्णन करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रत्येक मिश्रण में ड्रग्स मिश्रण में प्रत्येक दवा की एकाग्रता मिश्रण की मात्रा 50mL vol. फ्लास्क में जोड़ा गया
मिक्स 1: सीएलएफ-डी 7, ईएमबी-डी4 10 μg/mL 40 माइक्रोन
मिक्स 2: एलएफएक्स-डी8, PTH-d5 10 μg/mL 10 माइक्रोन
मिक्स 3: बीडीक्यू-डी 6, एलजेडडी-डी 3, एमएफएक्स 13सी-डी3, ओपीएलसी (पीटीएम के लिए है) 10 μg/mL 20 माइक्रोन
मिक्स 4: PZA 15N-d3 10 μg/mL 200 माइक्रोन
मिक्स 5: INH-d4 10 μg/mL 100 माइक्रोन

तालिका 1. एकाग्रता और प्रत्येक आंतरिक मानक की मात्रा एक 50 mL वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में जोड़ने के लिए।

दवा स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम जोड़ा गया
बीडीक्यू 0.5 मिलीग्राम/एमएल 8 माइक्रोन
सीएलएफ 0.5 मिलीग्राम/एमएल 8 माइक्रोन
Emb 1 मिलीग्राम/mL 4 माइक्रोन
Pth 1 मिलीग्राम/mL 4 माइक्रोन
Ptm 1 मिलीग्राम/mL 4 माइक्रोन
INH 1 मिलीग्राम/mL 40 माइक्रोन
एलएफएक्स 1 मिलीग्राम/mL 40 माइक्रोन
एलजेडडी 1 मिलीग्राम/mL 40 माइक्रोन
एमएफएक्स 1 मिलीग्राम/mL 40 माइक्रोन
पीजेडा 1 मिलीग्राम/mL 40 माइक्रोन

तालिका 2। "रेफरी एसटीडी मिक्स 1" शीशी में जोड़ने के लिए प्रत्येक दवा संदर्भ मानक की मात्रा।

लेबल नाम शीशी से खींचा वॉल्यूम जोड़ा गया
C0 N/A 0 माइक्रोन
C1 रेफरी एसटीडी मिक्स df1000 5 माइक्रोन
C2 रेफरी एसटीडी मिक्स df1000 10 माइक्रोन
C3 रेफरी एसटीडी मिक्स df1000 20 माइक्रोन
C4 रेफरी एसटीडी मिक्स df100 5 माइक्रोन
C5 रेफरी एसटीडी मिक्स df100 10 माइक्रोन
C6 रेफरी एसटीडी मिक्स df100 20 माइक्रोन
C7 रेफरी एसटीडी मिक्स df10 5 माइक्रोन
C8 रेफरी एसटीडी मिक्स df10 10 माइक्रोन
C9 रेफरी एसटीडी मिक्स df10 20 माइक्रोन
C10 रेफरी एसटीडी मिक्स df1 5 माइक्रोन
C11 रेफरी एसटीडी मिक्स df1 10 माइक्रोन

तालिका 3। 12 अंशांकन अंक में जोड़ने के लिए प्रत्येक रेफरी एसटीडी मिक्स इंटरमीडिएट की राशि।

कुल समय (मिन) प्रवाह दर (μL/मिन) एक (%) B (%)
0 450 95 5
0.3 450 95 5
2.3 450 0 100
5 550 0 100
11 550 0 100
11.1 550 95 5
13 450 95 5
16.75 450 95 5

तालिका 4। प्रत्येक इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रवाह दर और मोबाइल चरण ढाल।

अंशांकन बिंदु बीडीक्यू, सीएलएफ, ईटीएच, ईएमबी, पीटीएच, पीटीएम (एनजी/एमजी) की वास्तविक एकाग्रता INH, LFX, LZD, MFX, PZA (एनजी/एमजी) की वास्तविक एकाग्रता
C0 0 0
C1 0.005 0.05
C2 0.01 0.1
C3 0.02 0.2
C4 0.05 0.5
C5 0.1 1
C6 0.2 2
C7 0.5 5
C8 1 10
C9 2 20
C10 5 50
C11 10 100

तालिका 5। प्रत्येक अंशांकन बिंदु में एनालिट्स की अंतिम एकाग्रता।

दवा LOD
(एनजी/एमजी बाल)		 एलओक्यू
(एनजी/एमजी बाल)		 ULOQ
(एनजी/एमजी बाल)		 नमूना मूल्यों (एनजी/एमजी बाल)
नमूने: यूसी-04, यूसी-08, यूसी-11, यूसी-16, यूसी-25, यूसी-36, यूसी-69, यूसी-83, यूसी-89, यूसी-90, यूसी-91, यूसी-104, यूसी-105, यूसी-108, यूसी-109
बेडाक्विलिन 0.005 0.05 10 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64
क्लोफाज़िमाइन 0.005 0.05 10 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01
एथमबुटोल 0.005 0.05 10 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76
एथिओनेमाइड 0.01 0.01 10
इसोनियाज़िड 0.05 0.5 100 & LOD,
लेवोफ्लोक्सासिन 0.1 0.5 100 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96
लाइनजोलिड 0.1 0.5 100 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22
मोक्सिफ्लोक्सासिन 0.05 0.5 100 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64
प्रीटोमैन्ड 0.005 0.05 10 0.57
प्रोथिओनेमाइड 0.002 0.01 10
पायराज़िनामाइड 0.05 1 100 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66

तालिका 6। डीओटी के तहत डीआर-टीबी की दवाएं लेने वाले 15 मरीजों में मापी गई दवाओं का प्रतिनिधि स्तर । प्रत्येक दवा के लिए विधि की पता लगाने की सीमा (एलओडी), क्वांटिफिकेशन (एलओक्यू) की निचली सीमा और क्वांटिफिकेशन (ULOQ) की ऊपरी सीमा तुलना के लिए दी जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम यहां एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके छोटे बालों के नमूनों में डीआर-टीबी के उपचार में उपयोग की जाने वाली 11 एंटी-टीबी दवाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए हमारे द्वारा विकसित और मान्य विधि के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं । बालों में इन 11 दवाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए कोई अन्य विधि पहले विकसित, मान्य और प्रकाशित नहीं किया गया है। हमारी विधि लगभग 3 सेंटीमीटर (सेमी) की लंबाई (~ 2 मिलीग्राम) में केवल 20-30 बालों की किस्में में दवाओं के उप-नैनोग्राम स्तर ों की मात्रा निर्धारित कर सकती है और पहले ही22मान्य की जा चुकी है। बालों के कम वजन का विश्लेषण का मतलब है कि अध्ययन में शामिल रोगियों को सावधानी से भाग ले सकते है और संभावित गंजा खोपड़ी को उजागर करने के डर के बिना दोहराने परीक्षण के लिए वापसी । हम पहले बालों में डॉ टीबी दवा के स्तर और डॉ उपचार परिणाम23के बीच संबंध पर डेटा प्रकाशित किया है । इसलिए, इस बहु-एनालाइट पैनल विधि का विकास और सत्यापन डॉ-टीबी चिकित्सीय दवा निगरानी के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है।

बालों को तरल बायोमैटरिस के साथ आवश्यक लोगों की तुलना में विभिन्न समरूपता तकनीकों की आवश्यकता होती है। बालों की किस्में के पल्वराइजेशन ने बालों के मैट्रिक्स में एनालिट्स को निष्कर्षण विलायक की कुशल पहुंच की अनुमति दी। इस प्रकार, हमारी विधि की एक महत्वपूर्ण विशेषता स्पंदित नमूनों का उपयोग करके बालों से दवाओं की त्वरित और आसान निष्कर्षण प्रक्रिया है। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान इनक्यूबेशन समय केवल दो घंटे है, स्पंदित बालों के बड़े सुलभ सतह क्षेत्र के कारण, और छोटे नमूना आकार (2 मिलीग्राम) के कारण कोई साफ कदम नहीं है। हालांकि, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान दवा क्षरण को सीमित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए । प्रोटोकॉल चक्रों के बीच में 45 एस कूलिंग अवधि के साथ दो चक्र स्पंदन का उपयोग करता है। यह प्रक्रिया ओवरहीटिंग से बचती है और संभावित रूप से बालों में दवाओं को अपमानजनक करती है।

दुरुपयोग की दवाओं के लिए कई बाल विश्लेषण के विपरीत, इस विधि एक धोने के कदम का उपयोग नहीं करता है । डॉ-टीबी दवाएं कैप्सूल या टैबलेट के रूप में आती हैं, बाहरी संदूषण के संभावित स्रोतों को सीमित करती हैं और विश्लेषण से पहले बालों को धोने के बाद की आवश्यकता होती है। भविष्य के अध्ययनों से बाहरी संदूषण का आकलन करने के लिए डीआर-टीबी रोगी बालों से वॉश सॉल्वेंट का विश्लेषण किया जा सकता है ।

हालांकि बाल स्पंदन कुशल दवा निष्कर्षण को बढ़ावा देता है, यह अपनी सीमाएं हैं । हमारी प्रयोगशाला में पाया गया है कि अगर बालों को मनका रूपमें पल्वराइज्ड किया जाता है और कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है, तो सप्ताह और महीनों में 11 दवाओं में से कुछ की एकाग्रता कम हो जाती है। यह वातावरण के संपर्क में आने वाले स्पंदित बालों के बड़े सतह क्षेत्र के कारण हो सकता है जो ऑक्सीकरण और अन्य गिरावट प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा दे सकता है। यदि बालों में दवाओं का स्थिरता अध्ययन वांछित है, तो बालों को कैंची के साथ और एलटी; 1 सेमी के छोटे खंडों में काटा जा सकता है, हाथ से समरूप, और फिर स्थिरता अध्ययन के दौरान हफ्तों या महीनों के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है। जब विश्लेषण के दिन इस कटे हुए बालों को स्पंदित किया जाता है, तो हमने समय के साथ कोई महत्वपूर्ण दवा क्षरण नहीं देखा है। इसलिए, वर्णित प्रोटोकॉल को करने में, हम अनुशंसा करते हैं कि बालों को उस दिन स्पंदित किया जाए जिस दिन इसे निकाला जाता है। इसी तरह, सभी दवा 10 μg/mL सांद्रता से नीचे घोला जा सकता है निष्कर्षण के दिन तैयार किया जाना चाहिए ।

मल्टी-एनालिएट विधि में प्रत्येक टीबी दवा के लिए स्थापित रैखिक गतिशील पर्वतमाला (एलओओक्यू-यूकेक्यू) की उपयुक्तता का आकलन करने के लिए पहले से प्रकाशित विधियां उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, पश्चिमी केप, दक्षिण अफ्रीका से बालों के नमूनों की सुविधा नमूना, इस विधि के रैखिक गतिशील रेंज की उपयुक्तता को इंगित करता है। एथिओमाइड, प्रीटोमैनिड और प्रोथिओनामाइड के अपवाद के साथ, इन रोगियों में हमने जो दवा के स्तर को मापा है, उसमें से 95% से अधिक प्रत्येक एनालिएट की रैखिक गतिशील रेंज के भीतर हैं। केवल एक मरीज प्रीटोमेन्ड (जिसका पता चला) ले जा रहा था, और कोई मरीज प्रोथिओमाइड नहीं ले रहा था । एथिओनेमाइड के लिए, हम परिकल्पना करते हैं कि दवा बाल मैट्रिक्स को अच्छी तरह से जमा नहीं कर सकती है, क्योंकि हमारा LOD 0.01 एनजी/एमजी बाल (या 10 स्नातकोत्तर/मिलीग्राम बाल) है और अभी तक एथिओनामाइड लेने वाले आठ रोगियों में से केवल एक का स्तर 0.02 एनजी/एमजी बाल से अधिक है। बालों में टीबी की विभिन्न दवाओं के फार्माकोकाइनेटिक्स का निर्धारण करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एथिओनेमाइड जैसी दवाओं की निगरानी के लिए एक संभावित विकल्प इसके बजाय उनके मेटाबोलाइट (एस) को लक्षित करने वाली विधि विकसित करना है। हमने डेलामांइड के लिए एक ऐसी ही टिप्पणी की है, जो एक उपन्यास डीआर-टीबी दवा है, जो शुरू में इस पैनल का हिस्सा था । डेलामांइड के मेटाबोलाइट को लक्षित करने वाली एक विधि वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में मान्य होने की प्रक्रिया में है, क्योंकि मेटाबोलाइट माता-पिता की दवा की तुलना में उच्च सांद्रता में पाया जाता है। एथिओमाइड के लिए एक ही प्रक्रिया की जा सकती है। तालिका 6 में दवा सांद्रता को एक समूह के रूप में प्रस्तुत किया जाता है क्योंकि व्यक्तिगत परिणाम और नैदानिक परिणाम इस विधि पेपर का ध्यान केंद्रित नहीं कर ते हैं। रोगियों के इस समूह का व्यक्तिगत मूल्यांकन कहीं औरप्रकाशितकिया गया है ।

प्रदर्शन अध्ययन के लिए छोटे बालों के नमूनों का योगदान रोगियों को एक पेशेंट सेटिंग में डॉट के माध्यम से दवा आहार की एक किस्म प्रशासित किया गया, और सभी आहार पेशेंट अवधि के दौरान नर्सिंग रिकॉर्ड के अनुसार प्रलेखित किया गया । हालांकि, जैसा कि डॉ-टीबी रोगियों के बीच आम है, पिछले, खराब प्रलेखित दवा आहार भी उनके पेशेंट रहने से पहले प्रशासित किया गया था । इसके चलते मरीज के बालों में ऐसी दवाओं का पता लगाया गया जो उनके पेशेंट रिकॉर्ड पर नोट नहीं थीं। इसलिए, हम विधि की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए इन नमूनों का उपयोग नहीं कर सकते थे, क्योंकि हम यह निर्धारित नहीं कर सके कि ये नमूने वास्तव में झूठे सकारात्मक थे या नहीं। इसके बजाय हमने उन मरीजों से बालों की जांच की जो डॉ टीबी की दवाएं नहीं ले रहे थे । इन नमूनों में डॉ टीबी की दवाओं का पता नहीं चला, जो यह दर्शाता है कि विधि विशिष्ट है ।

हालांकि हमारी विधि डॉ टीबी दवाओं को मापने में बालों का उपयोग करने की उपयोगिता को दर्शाता है, बाल विश्लेषण सीमाओं का अपना सेट है । क्योंकि बाल एक ठोस मैट्रिक्स है, विधि सत्यापन के दौरान दवा संदर्भ मानकों की स्पाइकिंग मूत्र और रक्त के साथ मैट्रिक्स में मानकों के पूर्ण एकीकरण के लिए अनुमति नहीं देता है। इस प्रकार, रिकवरी मूल्यांकन ठोस मैट्रिक्स पर स्पाइकिंग के बाद दवा का पता लगाने तक सीमित है, और मैट्रिक्स से वास्तविक पुनर्प्राप्ति नहीं है। इसी तरह, क्योंकि बाल एक वैकल्पिक मैट्रिक्स है जिसे अभी भी परीक्षण के लिए तलाशा जा रहा है, विधि उपयुक्तता का आकलन करने के लिए दवाओं के लिए कोई आसानी से उपलब्ध संदर्भ पर्वतमाला उपलब्ध नहीं है। बालों में दवाओं के समावेश पर अधिक फार्माकोकाइनेटिक अध्ययन पालन निगरानी में बालों की दवा के स्तर की उपयोगिता को समझने के लिए उपयोगी होंगे। अंत में, क्षेत्र साइटों पर बालों के नमूनों के उचित संग्रह की अपनी अनूठी चुनौतियां हैं। जबकि बालों के नमूनों के संग्रह और भंडारण के लिए अन्य बायोमैटरिस की तुलना में कम संसाधनों की आवश्यकता होती है, देखभाल के लिए किसी भी बाल किस्में के डिस्टल और समीपस्थ सिरों की पहचान करने के लिए लिया जाना चाहिए 2 सेमी से अधिक समय । लंबे बाल किस्में कतरा के साथ अलग दवा सांद्रता हो सकती है, समय के साथ दवा के उपयोग के आधार पर । उचित लेबलिंग किस्में के विशिष्ट खंडों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है; हमारी विधि के मामले में, खोपड़ी के निकटतम बालों के तीन सेंटीमीटर दवा पालन पर सबसे हाल के डेटा का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । उचित लेबलिंग के लिए साइटों पर प्रशिक्षण और गुणवत्ता आश्वासन प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।

संक्षेप में, हमने छोटे बालों के नमूनों में एलसी-एमएस/एमएस के माध्यम से डीआर-टीबी के लिए उपयोग की जाने वाली टीबी दवाओं का विश्लेषण करने के लिए पहला बहु-विश्लेषण पैनल विकसित किया है । संसाधन सीमित सेटिंग्स में बालों को इकट्ठा करने और भंडारण की व्यवहार्यता को देखते हुए, हमारी विधि टीबी चिकित्सीय दवा निगरानी के क्षेत्र में एक संभावित महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करती है । दवा जोखिम के वस्तुनिष्ठ उपाय जो पालन और व्यक्तिगत फार्माकोकाइनेटिक परिवर्तनशीलता दोनों को ध्यान में रखते हैं, अप्रभावी उपचार आहार का प्रारंभिक संकेत प्रदान कर सकते हैं, जिससे व्यक्तिगत उपचार के साथ-साथ डीआर-टीबी24के सामुदायिक संचरण को सीमित करने के साथ-साथ दोनों को सहायता मिल सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

इस काम को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान RO1 AI123024 (सह-PIs: जॉन मेटकाल्फ और मोनिका गांधी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Acknowledgments

लेखक प्रोफेसर कीर्टन धेदा, डॉ अली एस्मेल और केपटाउन लंग इंस्टीट्यूट के विश्वविद्यालय में Marietjie प्रीटोरियस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने अध्ययन के लिए बालों के नमूनों के संग्रह की सुविधा प्रदान की । लेखक इस अध्ययन के प्रतिभागियों के योगदान को और कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL injection vials Agilent Technologies 5182-0716
250 uL injection vial inserts Agilent Technologies 5181-8872
Bead ruptor 24 OMNI International 19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) OMNI International 19628
Bedaquiline Toronto Research Chemicals B119550
Bedaquiline-d6 Toronto Research Chemicals B119552
Clofazimine Toronto Research Chemicals C324300
Clofazimine-d7 Toronto Research Chemicals C324302
Disposable lime glass culture tubes VWR 60825-425
Ethambutol Toronto Research Chemicals E889800
Ethambutol-d4 Toronto Research Chemicals E889802
Ethionamide Toronto Research Chemicals E890420
Ethionamide-d5 ClearSynth CS-O-06597
Formic acid Sigma-Aldrich F0507-100mL
Glass bottles Corning 1395-1L
Hot Shaker Bellco Glass Inc 7746-32110
HPLC Agilent Technologies Infinity 1260
HPLC grade acetonitrile Honeywell 015-4
HPLC grade methanol Honeywell 230-1L
HPLC grade water Aqua Solutions Inc W1089-4L
Isoniazid Toronto Research Chemicals I821450
Isoniazid-d4 Toronto Research Chemicals I821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm Phenomenex 00D-4371-B0
LC guard cartridge Phenomenex AJ0-8788
LC guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000
LC-MS/MS quantitation software Sciex Multiquant 2.1
Levofloxacin Sigma-Aldrich 1362103-200MG
Levofloxacin-d8 Toronto Research Chemicals L360002
Linezolid Toronto Research Chemicals L466500
Linezolid-d3 Toronto Research Chemicals L466502
Micro centrifuge tubes E&K Scientific 695554
Moxifloxacin Toronto Research Chemicals M745000
Moxifloxacin-13C, d3 Toronto Research Chemicals M745003
MS/MS Sciex Triple Quad 5500
OPC 14714 Toronto Research Chemicals O667600
Pretomanid (PA-824) Toronto Research Chemicals P122500
Prothionamide Toronto Research Chemicals P839100
Prothionamide-d5 Toronto Research Chemicals P839102
Pyrazinamide Toronto Research Chemicals P840600
Pyrazinamide-15N, d3 Toronto Research Chemicals P840602
Septum caps for injection vials Agilent Technologies 5185-5862
Turbovap LV evaporator Biotage 103198/11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  4. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
  5. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
  6. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
  7. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
  8. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
  9. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
  10. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  11. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
  12. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
  13. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
  14. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
  15. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
  16. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
  17. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
  18. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
  19. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
  20. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
  21. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  22. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
  23. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
  24. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).

Tags

चिकित्सा अंक १५९ एलसी-एमएस/एमएस एमडीआर-टीबी दवाएं बाल विश्लेषण पालन निगरानी चिकित्सीय दवा निगरानी दवा प्रतिरोधी टीबी
छोटे बालों के नमूनों में 11 दवा प्रतिरोधी टीबी दवाओं की मात्रा के लिए मान्य एलसी-एमएस/एमएस पैनल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reckers, A., Wen, A., Aguilar, D.,… More

Reckers, A., Wen, A., Aguilar, D., Bacchetti, P., Gandhi, M., Metcalfe, J., Gerona, R. Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples. J. Vis. Exp. (159), e60861, doi:10.3791/60861 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter