Summary
Современные методы анализа приверженности пациентов сложным режимам лекарственно-туберкулезного (ДР-ТБ) могут быть неточными и ресурсоемкими. Наш метод анализирует волосы, легко собранную и хранящуюся матрицу, на концентрации 11 препаратов DR-TB. Используя LC-MS/MS, мы можем определить уровни субнанограммы наркотиков, которые могут быть использованы, чтобы лучше понять соблюдение препарата.
Abstract
Лекарственно-туберкулезный (ДР-ТБ) представляет собой растущую угрозу для общественного здравоохранения, и оценка уровней терапевтических препаратов может иметь важные клинические преимущества. Уровни плазменных препаратов являются текущей оценки золотого стандарта, но требуют флеботомии и холодной цепи, и захватить только совсем недавнее соблюдение. Наш метод использует волосы, матрицу, которая легко собирается и отражает долгосрочное соблюдение, для тестирования на 11 противотуберкулезных препаратов. Предыдущая работа нашей группы показывает, что уровень антиретровирусных препаратов в волосах связан с исходами ВИЧ. Наш метод лечения препаратов Д-БД-ТБ использует 2 мг волос (3 см, проксимальных к корню), которые измельчаются и извлекаются в метанол. Образцы анализируются с помощью одного метода LC-MS/MS, количественно опрометив111 препаратов за 16 мин. Более низкие пределы количественной оценки (ЛЛО) для 11 препаратов варьируются от 0,01 нг/мг до 1 нг/мг. Присутствие препарата подтверждается сравнением соотношений двух переходов масс-спектрометрии. Образцы количественно с использованием области соотношение препарата к deuterated, 15N-, или 13C-помечены наркотиков изотополог. Мы использовали кривую калибровки в диапазоне от 0,001-100 нг/мг. Применение метода к удобному образцу образцов волос, собранных у пациентов с ДБ-ТБ при непосредственно наблюдаемой терапии (ДОТ), показало уровень препарата в волосах в линейном динамическом диапазоне девяти из одиннадцати препаратов (изониазид, пиразинамид, этамбутол, линезолид, левофлоксацин, моксифоксикацин, клоназимин, лобэк, претоманид). Ни один пациент не был на протионамид, и измеренные уровни для этионамид были близки к его LLO (с дальнейшей работой вместо изучения пригодности метаболита этионамид для мониторинга воздействия). Подводя итог, мы описываем разработку мульти-аналитовой панели для препаратов д-р-ТБ в волосах как метод терапевтического мониторинга лекарственных средств во время лечения лекарственно-устойчивого ТБ.
Introduction
В XXI веке лекарственно-устойчивый ТБ (ДР-ТБ) является развивающейся катастрофой для и без того слабых национальных программ борьбы с туберкулезом, причем только за последние 5 лет число подтвержденных случаев заболевания удвоилось, что составляет почти треть всех случаев смерти, связанных с устойчивостью к противомикробным препаратам во всем мире1,2. Успешное лечение Д-ТБ обычно требует более длительных и более токсичных схем второй линии, чем лечение тБ, чувствительного к наркотикам. Кроме того, пациенты с DR-ТБ часто имеют значительные ранее существовавшие проблемы с соблюдением, что способствовало появлению резистентности первоначально3.
В отличие от ВИЧ-инфекции, где вирусные нагрузки могут быть использованы для мониторинга лечения, суррогатные конечные точки лечения при ТБ задерживаются и ненадежны на индивидуальном уровне4. Мониторинг приверженности пациента, важный предиктор субтерапевтической концентрации противотуберкулезных препаратов и неудачи лечения, также является сложной задачей. Самостоятельно сообщил и совпадение соблюдения страдает от отзыва предвзятости и желание угодить поставщикам5,6. Таблетки рассчитывает и лекарства системы мониторинга событий (MEMS) может быть более объективным7, но не измеряют фактическое потребление наркотиков8,9,10. Уровни лекарственных средств в биоматрисах могут обеспечить как присоединение, так и фармакокинетические данные. Таким образом, уровни плазмы наркотиков обычно используются в терапевтических мониторинга наркотиков11,12. Однако в контексте мониторинга соблюдения лекарственных средств уровни плазмы представляют собой кратковременное воздействие и ограничены значительной внутри- и межпациентной изменчивостью при определении соответствующего диапазона ссылки на присоединение. Эффекты "белого пальто", когда присоединение улучшается до посещения клиники или исследования, еще больше осложняет способность уровней плазмы обеспечивать точные модели пристыковки препарата13.
Волосы является альтернативной биоматрицы, которые могут измерять долгосрочное воздействие наркотиков14,15. Многие препараты и эндогенные метаболиты включаются в матрицу белка волос из системного кровообращения по мере роста волос. Поскольку этот динамичный процесс продолжается во время роста волос, количество препарата, отложенного в матрице волос, зависит от непрерывного присутствия препарата в обращении, что делает волосы отличным временным считыванием препарата. Волосы как биоматрицы имеет дополнительное преимущество легко собираться без необходимости холодной цепи для хранения и отгрузки по сравнению с кровью. Кроме того, волосы не являются биоопасными, что обеспечивает дополнительные преимущества осуществимости в этой области.
Уровни волос наркотиков уже давно используются в судебно-медицинской экспертизы16. За последнее десятилетие уровни антиретровирусной (АРВ) волос продемонстрировали полезность в оценке приверженности препаратам в лечении и профилактике ВИЧ, в которые внесла вклад наша группа. Уровни АРВ волос оказались самыми сильными независимыми предикторами исходов лечения при ВИЧ-инфекции17,,18,,19,,20,,21. Чтобы определить, будут ли уровень волос больных Д-БД-ТБ иметь такую же полезность в прогнозировании результатов лечения, мы использовали LC-MS/MS для разработки и проверки метода анализа 11 препаратов DR-TB в небольших образцах волос. В качестве первоначальной оценки эффективности анализ, мы измерили уровни DR-TB наркотиков в удобной выборке пациентов с DR-TB, получающих непосредственно наблюдаемую терапию (DOT) в Западной Капской провинции, южная Африка22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все пациенты предоставили письменное информированное согласие до сбора образцов волос. Мы получили одобрение Совета по институциональному обзору от Университета Кейптауна и Калифорнийского университета в Сан-Франциско.
1. Выборка волос
- Получить письменное информированное согласие.
- Используйте чистые ножницы, чтобы вырезать примерно 20-30 скальп волос пряди из затылочной области как можно ближе к коже головы, как это возможно.
- Поместите ленту вокруг дистальной стороны волос, чтобы указать направленность. Сложите образец волос в квадрат алюминиевой фольги и хранить при комнатной температуре. Этикетка дистального конца волос, чтобы избежать возможного загрязнения от дополнительной обработки проксимального конца.
- В дополнение к образцам пациентов, собирать "пустые волосы": образец волос на волосах головы от тех, кто не принимал лекарства от туберкулеза. Соберите большое количество (30 мг пустых волос на каждые 20 образцов пациента).
2. Добыча наркотиков
- Этикетка бисовые трубки. Каждый образец пациента требует одной трубки. Этикетка 12 труб от "C0" до "C11", по одному для каждой из 12 точек калибровки. Этикетка трубки для низкого контроля качества, трубка для среднего контроля качества, и трубка для контроля высокого качества. Наконец, пометьте трубку для Matrix Blank.
- Откройте квадрат алюминиевой фольги, содержащий образец волос. Если образец волос длиннее 3 см, стричь волосы на 3 см от проксимального конца и используйте эту проксимальную часть для анализа.
- Взвесить 2 мг образца волос в бисочной трубке.
- Взвесить 2 мг пустых волос в 16 дополнительных бисовых трубок. Они будут использоваться в качестве калибровочных точек, контроля качества и матрицы пустыми. Трубки будут следовать той же процедуре экстракции, что и образцы пациента, помимо того, что они были шипами со стандартами сапогев на уровнях, указанных в шагах 2.8 и 2.9.
- Поместите все бисовые трубки в гомогенизатор. Запуск гомогенизатора на скорости 6,95 м/с. Запуск в течение двух циклов по 30 с каждый, с 15-м периодом отдыха между двумя циклами.
- Сделайте внутреннюю стандартную смесь и добавьте ее в образцы.
- Добавьте 40 мл метанола в объемную колбу объемом 50 мл.
- В янтарных стеклянных флаконах сделайте смеси внутренних стандартов, показанных в таблице 1,используя метанол в качестве растворителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол очень волатильный. Оставьте все флаконы ограничены во время этого процесса, чтобы предотвратить потерю из-за испарения. - Из этих смесей добавьте объем, показанный в таблице 1, к объемной колбе объемом 50 мл. Затем заполните колбу до 50 мл метанолом.
- Крышка и смешать объемную колбу. Добавьте 500 л смеси к каждой из распыленных волосяных трубок, за исключением матричной пустой трубки. Добавьте 500 метанола в матричную пустую трубку.
- Сделать эталонные стандартные смеси.
- Составить аккуратные эталонные стандарты следующих препаратов с метанолом, чтобы получить концентрацию показано в таблице в шаге 2.7.2. Требуется только 1 мл следующих концентраций.
- Добавьте 1768 л метанола в флакон, а затем добавьте количество эталонного стандарта, перечисленного в таблице 2, к тому же флакону, чтобы получить 2 мл окончательного тома. Этикетка этот флакон "Ref Std Mix 1x". Вихрь.
- Спайк 100 Зл из "Ref Std Mix 1x" в 900 л метанола в новом флаконе. Этикетка этот флакон "Ref Std Mix 10x". Вихрь.
- Спайк 100 злотили из "Ref Std Mix 10x" в 900 л метанола в новом флаконе. Этикетка этот флакон "Ref Std Mix 100x". Вихрь.
- Спайк 100 злотили из "Ref Std Mix 100x" в 900 л метанола в новом флаконе. Этикетка этот флакон "Ref Std Mix 1000x". Вихрь.
- Спайк калибровки кривой труб, добавив количество Ref Std Mix описано в таблице 3.
- Создавайте кк-миксы и трубки контроля качества.
- Этикетка 5 флаконов "КК-А" через "КК-Е".
- Добавьте следующие количества метанола в пять помеченных флаконов:
КК-А: 990 л
КК-Б: 940 л
КК-С: 950 л
КК-Д: 980 л
КК-Е: 950 л
- Используя 1 мг/мл запасов лекарств, созданных в шаге 2.7.1, добавьте 10 кЛ к конкретным флаконам, перечисленным ниже. Для запасов БДЗ и CLF, которые находятся на уровне 0,5 мг/мл, добавьте 20 qL к перечисленным ниже флаконам.
КК-А: PTH
КК-Б: ЭМБ, КЛФ, БДЗ, ПТМ
КК-С: INH, LFX, ЛЗД, MFX, ПЗА
КК-Д: PTH, EMB
КК-Е: CLF, БДЗ, ПТМ
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые препараты присутствуют в нескольких смесей. - Этикетка флакон, как "КК-A df100". Разбавить 10 зл кв.м. кК-А в 990 л метанола.
- Этикетка флакон, как "Низкий КК акции". Добавьте в этот флакон 1832 йл метанола. Добавить количество кк смеси подробно описано ниже:
КК-A df100: 80 л
КК-Б: 8 л
КК-С: 80 л
- Этикетка флакон, как "Средний КК акции". Добавьте в этот флакон 760 метанола. Добавить количество кк смеси подробно описано ниже:
КК-A df100: 800 л
КК-Б: 40 л
КК-С: 400 л
- Этикетка флакон, как "Высокий кК акции". Добавьте в этот флакон 1376 метанола. Добавить количество кк смеси подробно описано ниже:
КК-Д: 160 л
КК-Е: 320 л
MFX, 1 мг/мл акций: 16 л
INH, 1 мг/мл бульона: 32 л
LFX, 1 мг/мл бульона: 32 л
ЛЗД, 1 мг/мл бульона: 32 л
ПЗА, 1 мг/мл бульона: 32 л
- Спайк 10 Л Низкий кК запасов в низкий кК бисочник трубки.
- Спайк 10 Л. Средний кк акций в середине КК бисочник трубки.
- Спайк 10 Л Высокий кк акций в высокой кК бисочник трубки.
- Поместите все трубки в горячий шейкер на 2 ч при 37 градусах Цельсия. Встряхивание должно быть достаточно медленным, чтобы вода не выплескивается на трубки.
- Удалите трубки из шейкера. Перенесите жидкость из бисерных трубок в новые микроцентрифугные трубки. Этикетка этих микроцентрифуговых труб таким же образом.
- Добавьте 500 метанола в старые трубки. Кепка и вихрь.
- Во второй раз перенесите жидкость из бисерных трубок в соответствующую микроцентрифуговую трубку. Это нормально для передачи измельченных волос. Это в конечном итоге будет центрифугизм.
- Центрифуга микроцентрифуговых труб оков в течение 10 мин при 2800 х г.
- Аккуратно удалите жидкость и перенесите ее в новые центрифуги с соответствующими этикетками. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить или передать волосы гранулы.
- Испаряйся жидкости в центрифуговых трубках до сухости при 32 градусах Цельсия.
- Восстановите образцы, добавив 200 кЛ подвижной фазы А (Вода класса HPLC с 1% формической кислотой) в сухие трубки. Вихрь.
- Перенесите жидкость на янтарные флаконы с 250 вставками.
3. Подготовка LC-MS/MS
- Сделайте один литр мобильной фазы А (HPLC-класса воды с 1% фомической кислоты), добавив некоторые HPLC-класса воды в однолитровой объемной колбы. Затем добавьте 10 мл из йgt;95% для модной кислоты, что колба, а затем заполнить линию с HPLC класса воды.
- Сделайте один литр мобильной фазы B (ацетонитрил с 0,1% фомической кислоты), добавив некоторые ацетонитрила в однолитровую объемную колбу. Затем добавьте 1 мл из йgt;95% formic кислоты, что колба, а затем заполнить к линии с ацетонитрилом.
- Установите 2 х 100 мм колонки с 2,5 мкм размер частицы и 100 й пор размер с полярным endcapped, эфир-связанных фениловых шариков полностью из пороса кремнезема в колонном отсеке. Убедитесь, что столбец также имеет производитель рекомендуется охранник картридж установлен.
- Откройте программное обеспечение для сбора данных и конфигурацию оборудования с двойным нажатием кнопки. Выделите LCMS и нажмите На кнопку «Активировать профиль».
- Нажмите новый подпроект, или, если другие подпроекты уже существуют, нажмите Копировать Подпроект. Назовите подпроект.
- Нажмите новый документ. Метод приобретенияс двойным нажатием кнопки . Нажмите Mass Spec в окне метода приобретения.
- Измените отсев типа сканирования на MRM (MRM). Убедитесь, что Полярность настроена на положительный.
- Нажмите список импорта и выберите файл .csv MDR-TB LCMS метод transitions.csv, который включен в дополнительные материалы.
- Прокрутите вниз и установите Продолжительность до 16.751 мин. Соответствующее время цикла и количество циклов будут автоматически заполняться.
- В левой боковой панели нажмите Интегрированный клапан Valco. Убедитесь, что имя позиции для шага 0 является A. В столбце Total Time (min) введите в первом ряду 0,4 и 13 во втором ряду.
- В столбце Position установите строку от 1 до B и строку от двух до А.
- В левой боковой панели, нажмите Binary Pump. Установите таблицу градиента и частоты потока в соответствии с таблицей 4.
- В левой боковой панели нажмите Autosampler. Изменение объема инъекций до 10 зл. Нажмите кнопку Контроль температуры включен и установить до 4 градусов по Цельсию.
- В левой боковой панели щелкните Колонка Сравнение. Установите как правую, так и левую температуру до 50 градусов по Цельсию.
- Закрыть и сохранить метод.
- Создайте пакет, нажав новый документ и выбрав пакет приобретения. Введите заданный имя и выберите вновь созданный метод из панели выпадающих.
- В электронной таблице создайте пакет, который следует этому порядку: кривая калибровки, контроль качества, образцы пациента, кривая калибровки, контроль качества, образцы пациента, кривая калибровки, контроль качества. Добавьте пустые инъекции растворителя в начале и конце бега, а также до и после кривой калибровки, контроля качества и образцов пациентов. Положите по крайней мере восемь растворителя пустые инъекции после инъекций кривой калибровки и высокое качество контроля флакон для того, чтобы уменьшить analyte переноса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Больше пустых инъекций растворителя, возможно, потребуется добавить в зависимости от возраста столбца. - В столбце, прилегающей к именам выборки, введите в соответствующем положении автосэмпера для соответствующего флакона.
- Нажмите Добавить набор. В всплывающем окне введите количество образцов в пакете.
- Копировать и вставить образец имен и флаконов из электронной таблицы в недавно созданной партии.
- Перейдите на вкладку Отправить. Нажмите кнопку Отправить.
- В электронной таблице создайте пакет, который следует этому порядку: кривая калибровки, контроль качества, образцы пациента, кривая калибровки, контроль качества, образцы пациента, кривая калибровки, контроль качества. Добавьте пустые инъекции растворителя в начале и конце бега, а также до и после кривой калибровки, контроля качества и образцов пациентов. Положите по крайней мере восемь растворителя пустые инъекции после инъекций кривой калибровки и высокое качество контроля флакон для того, чтобы уменьшить analyte переноса.
- Система равновесия путем вставки линии растворителя А в мобильную фазу А и линию растворителя B в мобильную фазу B. Откройте клапан очистки на бинарном насосе.
- Установите состав растворителя до 50% B при скорости потока 4 мл/мин. Включите бинарный насос.
- После 5 мин, снижение потока до 0,3 мл/ мин. Закройте клапан очистки. Проверьте наличие утечек.
- В программном обеспечении нажмите Equilibrate на верхней панели инструментов. Установить время, чтобы йgt;5 мин, нажмите OK.
- После того, как инструмент уравновесится, модули в правом нижнем углу окна будут выглядеть зелеными. Проверьте, что давление стабилизировалось, а затем запустите партию, нажав Start Sample.
4. Анализ данных
- После завершения пакета откройте программное обеспечение для количественной оценки. Нажмите значок палочки, чтобы создать новую таблицу результатов.
- Нажмите «Прожектор», чтобы перейти к соответствующей папке, а затем выделите файл данных и нажмите на стрелку правого указания, чтобы переместить данные в выбранную область. Нажмите далее.
- Выберите Создать новый метод и нажмите Новый. Ввуй новый метод количественной оценки имя и нажмите Сохранить, а затем далее.
- Выберите первую инъекцию средней точки калибровки. Нажмите Далее.
- Тик пометить все переходы внутренних стандартов в колонке IS.
- Для переходов к количественной оценки для эталонных стандартов выберите соответствующее ИС в колонке IS Name. Нажмите далее.
- Прокрутите переходы, чтобы гарантировать точность автоматическовыбранного времени хранения. Убедитесь, что гауссианский сглаживание установлен на 1,5. Все остальные параметры по умолчанию могут оставаться такими, как есть (т.е. процент шума 100%, Базовая Sub. Окно 2.00 мин, Пик Расщепление 2 балла).
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании измените параметры автоматической интеграции в этой точке. Поскольку эти параметры меняются на основе установки инструментов, мы не включили наши здесь. - Нажмите Finish, чтобы применить метод количественной оценки к партии.
- Нажмите в левом верхнем верхнем отображении кнопки обзора пика для просмотра хроматограмм. Перейдите через переходы с помощью левой боковой панели. Прокрутите каждую инъекцию каждого перехода квантификатора и при необходимости интегрируйте правильный пик.
- Чтобы вручную интегрировать пик, нажмите на кнопку включить ручной интеграции режиме, увеличить в хроматограмму, нажав и перетаскивая по x- или y-оси, а затем нарисовать линию от одной базовой линии к другой базовой, определяя пик. На рисунке 3 показаны две хроматограммы: одна, которая имеет INH, и, следовательно, была интегрирована вручную, и другая, которая не имеет INH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекции должны быть интегрированы с использованием тех же параметров. Пиковая ширина может служить ориентиром для придерживания этих параметров, но иногда пиковая ширина будет отличаться. Для количественной оценки пика время удержания должно быть в пределах 0,15 мин от ожидаемого времени удержания для этого аналита (как определено в эталонных максимумах стандарта), качественно подтвержденное как имеюще ожидаемое соотношение квантификатора (как показано на рисунке 2),и иметь соотношение сигнала к шуму более 10.
- Чтобы вручную интегрировать пик, нажмите на кнопку включить ручной интеграции режиме, увеличить в хроматограмму, нажав и перетаскивая по x- или y-оси, а затем нарисовать линию от одной базовой линии к другой базовой, определяя пик. На рисунке 3 показаны две хроматограммы: одна, которая имеет INH, и, следовательно, была интегрирована вручную, и другая, которая не имеет INH.
- В столбце типа образца установите инъекции кривой калибровки (за исключением инъекций кривой чистой калибровки) в Standard. Установите инъекции контроля качества для контроля качества. Оставьте оставшиеся инъекции неизвестными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет установлено во всех переходах. - В столбце Фактической Концентрации введите концентрации, обнаруженные в таблице 5 для всех кривой калибровки и инъекций контроля качества.
- Нажмите на секунду с верхнего левого отображения кнопки кривой калибровки. Нажмите кнопку Регрессии.
- Установите тип взвешивания до 1/x и нажмите OK.
- Проверка кривой калибровки и образцов контроля качества, чтобы гарантировать, что партия успешно работала.
- Для каждого переходного периода квантификатора (не внутренних стандартных переходов) посмотрите на точность впрыска кривой калибровки (в столбце Accuracy). По крайней мере две трети точек калибровки должны иметь точность в пределах 80-120%.
- Для калибровочных точек, находящихся далеко за пределами ожидаемой точности, инъекция может быть выбросом. Исключите выбросы, если их расчетная концентрация составляет более двух стандартных отклонений от двух других инъекций этого флакона. Нажав на "и пик" не найдено кнопку над каждой хроматограммы.
- Убедитесь, что R-значение отображается выше кривой калибровки является 0,975.
- Убедитесь, что все инъекции контроля качества имеют точность в пределах 80-120%.
- Если все вышеперечисленные условия будут выполнены, партия прошла, и образцы могут быть количественно. Нажмите "Оторите" в панели инструментов, а затем нажмите Копировать всю таблицу. Вставьте стол в электронную таблицу.
- Возьмите среднее значение расчетной концентрации двух инъекций образца, чтобы определить заявленную концентрацию каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Иллюстрация хроматограммы с подтвержденными уровнями всех 11 препаратов ПРОТИВТ-ТБ показана на рисунке 1. Время удержания для каждого аналита может меняться при использовании различных инструментов и столбцов, поэтому точное время удержания должно определяться индивидуально.
Извлеченные ионные хроматограммы (EICs) для одного конкретного препарата (изониазид, INH) в одном из калибраторов (пустой образец волос шипами с DR-TB наркотиков эталонных стандартов) показаны на рисунке 2. Переходы квантификатора и квалификатора используются для качественного подтверждения наличия препарата, так как соотношение между областью квантификатора и областью квалификатора остается неизменным по всем пробам. Внутренний стандарт также контролируется для обеспечения нормализации каждой инъекции образца.
Для демонстрации мы проанализировали удобную выборку из 15 образцов волос среди общей популяции 96 пациентов, принимающих препараты Д-ТБ в условиях DOT из Западной Капской провинции, южная Африка. В таблице 6 представлены репрезентативные уровни препаратов от ДК-ТБ в самых низких и самых высоких уровнях, измеренных для каждого аналитика. Хотя представлены данные по 15 образцам пациентов, в каждом анализе не было зарегистрировано 15 уровней, поскольку каждый пациент находится на разной комбинации препаратов для лечения ДК-ТБ. Ни один из пациентов не был на протионамид, и только один пациент принимал претоманид.
Рисунок 1. Иллюстрация репрезентативной хроматограммы, показывающей пики 11 аналитов в методе DR-TB (Эмбэ этамбутол; ИНХЗ изониазид; ПЗАЗ пиразинамид; ЭТЗ этионамид; ПТЗ протионамид; Левофлоксацин ЛФВЗ; МФВЗ моксифлоксацин; Линезолид «ЛЗДЗ»; ПТМЗ претоманид; БДЗ-бедакилина; ClF' clofazimine). Поскольку чувствительность метода для каждого аналитика отличается, INH, L'D, LFX, MFX и L'D были шипами на 20 нг / мг волос в то время как BD, CLF, EMB, ETH, PTH и PTM были шипами на 2 нг / мг волос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Две извлеченные ионные хроматограммы (EICs) из инъекции калибровочной точки 9 (C9), изониазид (INH) при 20 нг/мг. Верхняя часть EIC показывает как переход inH quantifier (синий, помеченный INH-2), так и переход квалификатора INH (красный, помеченный INH-3). В нижней части EIC показана реакция INH-d4, внутреннего стандарта (ИС), используемого для количественной оценки INH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Скриншоты процесса количественной оценки. Верхняя часть представляет собой частичный список выборки, показывающий данные о инъекциях для одного анализа (INH, изониазид) в 12 точках калибровки (помечены C0-C11), трех уровнях КК и шести образцах. Нижняя левая часть кривой калибровки, в диапазоне от 0,5 нг/мг -100 нг/мг. Непрозрачные синие точки калибровочные точки. Прозрачные синие квадраты являются точками контроля качества. R-значение отображается в левом верхнем верхнем (0.99722) с весом 1/x. Две хроматограммы в правом нижнем углу иллюстрируют образец с INH (верхняя хроматограмма) и образец без INH (нижняя хроматограмма). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Наркотики в каждой смеси | Концентрация каждого препарата в смеси | Объем смеси, добавленной в колбу 50мл vol. |
| Mix 1: CLF-d7, EMB-d4 | 10 мкг/мл | 40 зл. |
| Микс 2: LFX-d8, PTH-d5 | 10 мкг/мл | 10 зл |
| Смесь 3: БДЗ-d6, ЛзД-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS для PTM) | 10 мкг/мл | 20 зл |
| Смешение 4: ПЗА 15Н-д3 | 10 мкг/мл | 200 зл. |
| Смесь 5: INH-d4 | 10 мкг/мл | 100 л |
Таблица 1. Концентрация и количество каждого внутреннего стандарта, чтобы добавить к 50 мл объемной колбы.
| Наркотиков | Концентрация запасов | Добавленный объем |
| БДЗ | 0,5 мг/мл | 8 зл |
| Clf | 0,5 мг/мл | 8 зл |
| Emb | 1 мг/мл | 4 л |
| Pth | 1 мг/мл | 4 л |
| Ptm | 1 мг/мл | 4 л |
| Inh | 1 мг/мл | 40 зл. |
| Lfx | 1 мг/мл | 40 зл. |
| ЛЗД | 1 мг/мл | 40 зл. |
| Mfx | 1 мг/мл | 40 зл. |
| Pza | 1 мг/мл | 40 зл. |
Таблица 2. Количество каждого стандарта ссылки на препарат, чтобы добавить в флакон "Ref Std Mix 1".
| Название этикетки | Виал, взятый из | Добавленный объем |
| C0 | N/A | 0 зл |
| C1 | Ref Std Mix df1000 | 5 зл |
| C2 | Ref Std Mix df1000 | 10 зл |
| C3 | Ref Std Mix df1000 | 20 зл |
| C4 | Ref Std Mix df100 | 5 зл |
| C5 | Ref Std Mix df100 | 10 зл |
| C6 | Ref Std Mix df100 | 20 зл |
| C7 | Ref Std Mix df10 | 5 зл |
| C8 | Ref Std Mix df10 | 10 зл |
| C9 | Ref Std Mix df10 | 20 зл |
| C10 | Ref Std Mix df1 | 5 зл |
| C11 | Ref Std Mix df1 | 10 зл |
Таблица 3. Количество каждого Ref Std Mix промежуточное, чтобы добавить к 12 точкам калибровки.
| Общее время (мин) | Скорость потока (Л/мин) | (%) | B (%) |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
Таблица 4. Скорость потока и мобильный градиент фазы, используемый для каждой инъекции.
| Точка калибровки | Фактическая концентрация БДЗ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (нг/мг) | Фактическая концентрация INH, LFX, L-D, MFX, ПЗА (нг/мг) |
| C0 | 0 | 0 |
| C1 | 0.005 | 0.05 |
| C2 | 0.01 | 0.1 |
| C3 | 0.02 | 0.2 |
| C4 | 0.05 | 0.5 |
| C5 | 0.1 | 1 |
| C6 | 0.2 | 2 |
| C7 | 0.5 | 5 |
| C8 | 1 | 10 |
| C9 | 2 | 20 |
| C10 | 5 | 50 |
| C11 | 10 | 100 |
Таблица 5. Окончательная концентрация аналитов в каждой точке калибровки.
| Наркотиков | Лод (нг/мг волос) |
ЛЛОЗ (нг/мг волос) |
УЛОЗ (нг/мг волос) |
Значения образца (волосы нг/мг) Образцы: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109 |
| Бедаквилин | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| Клофазимин | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| Этамбутол | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| Этионамид | 0.01 | 0.01 | 10 | Злт;ЛОД, Злт;ЛОД, 0.01, 0.01, 0.01, 0.02, 0.02, 0.17 |
| Изониазид | 0.05 | 0.5 | 100 | Злт;ЛОД, Злт;ЛОД, 0,12, 0,26, 0,84, 0,94, 1,36, 2,88, 4,03, 4,04, 9,14 |
| Левофлоксацин | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| Линезолид | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| Моксифлоксацин | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| Претоманид | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| Протионамид | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| Пиразинамид | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
Таблица 6. Представительные уровни препаратов, измеренные у 15 пациентов, принимающих препараты Д-Р-ТБ в рамках DOT. Для сравнения дается предел обнаружения (LOD), нижний предел количественной оценки (ЛЛОЗ) и верхний предел количественной оценки (УЛОЗ) метода для каждого препарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы сообщаем здесь протокол для метода мы разработали и подтвердили для количественной оценки 11 противотуберкулезных препаратов, используемых в лечении DR-Tb в небольших образцах волос с помощью LC-MS/MS. Ни один другой метод количественной оценки этих 11 препаратов в волосах не был ранее разработан, проверен и опубликован. Наш метод может количественно суб-нанограмму уровня препаратов только в 20-30 прядей волос примерно 3 см (см) в длину (2 мг) и уже были проверены22. Низкий вес волос проанализированы означает, что пациенты, участвующие в исследовании могут участвовать незаметно и потенциально вернуться для повторного тестирования, не опасаясь разоблачения лысой кожи головы. Ранее мы опубликовали данные о связи между уровнем dr-TB наркотиков в волосах и исходами лечения DR23. Таким образом, разработка и проверка этого метода мульти-аналита представляет собой значительный прогресс в области мониторинга терапевтических препаратов DR-TB.
Волосы требуют различных методов гомогенизации, чем те, которые требуются с жидкими биоматиками. Распыление прядей волос позволило эффективно получить доступ к извлечению растворителя к аналитистам в матрице волос. Таким образом, одной из важных особенностей нашего метода является быстрый и легкий процесс извлечения препаратов из волос с использованием распыленных образцов. Время инкубации в процессе экстракции составляет всего два ч, из-за большой доступной площади поверхности распыленных волос, и нет очистки шаг, из-за небольшого размера образца (2 мг). Однако необходимо позаботиться о том, чтобы ограничить деградацию наркотиков в процессе извлечения. Протокол использует двухцикловую распыление, с 45-s периодом охлаждения между циклами. Этот процесс позволяет избежать перегрева и потенциально унижая наркотики в волосах.
В отличие от многих анализов волос на наркотики злоупотребления, этот метод не использует стиральную шаг. Препараты ОТ-ТБ поступают в форме капсулы или таблетки, ограничивая возможные источники внешнего загрязнения и последующую необходимость мытья волос до анализа. Будущие исследования могут проанализировать растворитель мытья из волос пациента DR-TB для оценки внешнего загрязнения.
Хотя распыление волос способствует эффективной экстракции наркотиков, он имеет свои собственные ограничения. Наша лаборатория обнаружила, что если волосы распыляются в рупор ебры и оставляют при комнатной температуре, концентрация некоторых из 11 препаратов уменьшается в течение недель и месяцев. Это может быть связано с большой площадью поверхности распыленных волос, подвергающихся воздействию атмосферы, что может способствовать окислению и другим реакциям деградации. Если необходимо провести исследование стабильности препаратов в волосах, волосы можно срезать ножницами на небольшие сегменты lt;1 см, гомогенизированные вручную, а затем оставить при комнатной температуре в течение нескольких недель или месяцев во время исследования стабильности. Когда эта стрижка распыляется в день анализа, мы не наблюдаем каких-либо значительных деградации наркотиков с течением времени. Поэтому при выполнении описанного протокола мы рекомендуем распылять волосы в день их извлечения. Аналогичным образом, все лекарственные смеси ниже 10 мкг/мл концентрации должны быть подготовлены в день извлечения.
Для оценки пригодности линейных динамических диапазонов (ЛЛО-УЛОЗ), которые мы установили для каждого лекарства от туберкулеза в мульти-аналитовом методе, не имеется никаких ранее опубликованных методов. Тем не менее, удобная выборка образцов волос из Западной Капской провинции, южная Африка, указывает на пригодность линейного динамического диапазона этого метода. За исключением этионамида, претоманида и протионамидного, более 95% уровней препарата, которые мы измеряли у этих пациентов, находятся в линейном динамическом диапазоне каждого аналитика. Только один пациент принимал претоманид (который был обнаружен), и ни один пациент не принимал протионамид. Для этионамид, мы предполагаем, что препарат не может откладывать на матрицу волос хорошо, как наши LOD 0,01 нг / мг волос (или 10 пг / мг волос), и все же только один из восьми пациентов, принимающих этионамид имеет уровни больше, чем 0,02 нг / мг волос. Для определения фармакокинетики различных противотуберкулезных препаратов в волосах проводится дальнейшее обследование. Например, потенциальной альтернативой для мониторинга наркотиков, таких как этионамид является разработка метода ориентации их метаболита (ы) вместо. Мы сделали аналогичное наблюдение для delamanid, новый DR-TB лекарства, который первоначально был частью этой группы. Метод ориентации метаболита delamanid в настоящее время находится в процессе проверки в нашей лаборатории, потому что метаболит находится в более высоких концентрациях, чем родительский препарат. Такая же процедура может быть выполнена для этионада. Концентрации препарата в таблице 6 представлены как группа, потому что индивидуальные результаты и клинические результаты не находятся в центре внимания этого метода бумаги. Индивидуальная оценка этой группы пациентов была опубликована в другом месте23.
Пациенты, способствующие небольшие образцы волос для демонстрационного исследования были введены различные схемы наркотиков через DOT в стационаре, и все схемы были задокументированы в соответствии с медсестер записей в течение стационарного периода. Однако, как это часто бывает среди пациентов с ДК-ТБ, до их пребывания в стационаре также вводились предыдущие, плохо документированные схемы лекарств. Это привело к обнаружению наркотиков в волосах пациентов, которые не были отмечены в их стационарных отчетах. Таким образом, мы не могли использовать эти образцы для определения специфики метода, так как мы не могли определить, были ли эти образцы действительно ложными срабатываниями. Вместо этого мы проверили волосы у пациентов, которые не принимали препараты от ДК-ТБ. В этих образцах не было обнаружено лекарств от ДР-ТБ, что свидетельствует о специфике метода.
Хотя наш метод демонстрирует полезность использования волос при измерении препаратов DR-TB, анализ волос имеет свой собственный набор ограничений. Поскольку волосы являются твердой матрицей, пики эталонных стандартов препарата во время проверки метода не позволяют полностью интегрировать стандарты в матрицу, как с мочой и кровью. Таким образом, оценка восстановления ограничивается обнаружением препарата после пика на твердую матрицу, а не фактическим извлечением из матрицы. Аналогичным образом, поскольку волосы являются альтернативной матрицы, которая все еще изучается для тестирования, нет легко доступных справочных диапазонов для лекарств доступны для оценки пригодности метода. Более фармакокинетические исследования по включению препаратов в волосы будут полезны для дальнейшего понимания полезности уровня волос наркотиков в мониторинге соблюдения. Наконец, надлежащая коллекция образцов волос на полевых площадках имеет свои уникальные проблемы. В то время как сбор и хранение образцов волос требует меньше ресурсов, чем другие биоматики, необходимо принять меры для выявления дистальных и проксимальных кончиков любых прядей волос длиной более 2 см. Более длинные пряди волос могут иметь различные концентрации наркотиков вдоль пряди, в зависимости от использования лекарств с течением времени. Правильная маркировка позволяет анализировать конкретные сегменты нитей; в случае нашего метода, три сантиметра волос ближе всего к коже головы был использован для определения самых последних данных о соблюдении лекарств. Надлежащая маркировка требует обучения и процедур обеспечения качества на объектах.
Таким образом, мы разработали первую многоанализную панель для анализа лекарств от туберкулеза, используемых для лечения ДБ-ТБ через LC-MS/MS в небольших образцах волос. Учитывая возможность сбора и хранения волос в условиях ограниченных ресурсов, наш метод представляет собой потенциально значительный прогресс в области мониторинга терапевтических препаратов против туберкулеза. Объективные показатели воздействия наркотиков, учитывающие как присоединение, так и индивидуальную фармакокинетическую изменчивость, могут обеспечить раннее указание на неэффективные схемы лечения, тем самым помогая как индивидуальному лечению, так и ограничивая передачу DR-TB24в сообщество.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний RO1 AI123024 (Со-ИП: Джон Меткалф и Моника Ганди).
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Кертана Дхеды, д-ра Али Эсмаила и Мариетджи Преториус из Института легких Кейптаунского университета, которые способствовали сбору образцов волос для исследования. Авторы также с благодарностью признают вклад участников этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
