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Developmental Biology

माउस एड्रेनल पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए माइक्रोवाविंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड − एक ही मेजबान प्रजातियों से अनकॉन्जुज्ड प्राइमरी एंटीबॉडी का उपयोग करना

Published: February 21, 2020 doi: 10.3791/60868
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2
1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

Summary

एक ही मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए कई अलग-अलग तरीके स्थापित किए गए हैं। यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड माउस एड्रेनल सेक्शन पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को ब्लॉक करने के लिए माइक्रोवेव-मध्यस्थता एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड के उपयोग का वर्णन करते हैं।

Abstract

किसी दिए गए प्रोटीन के सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न को दिखाने के लिए बायोमेडिकल रिसर्च में इम्यूनोस्टेनिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग कई प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबलिंग की अनुमति देता है। एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को कम करने के लिए, अप्रत्यक्ष धुंधला का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से अलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न प्रजातियों एंटीबॉडी का उपयुक्त संयोजन हमेशा उपलब्ध नहीं होता है। यहां, हम एक ही मेजबान प्रजातियों (उदाहरण के लिए, इस मामले में दोनों एंटीबॉडी खरगोश से हैं) से अवेलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस अधिवृक्क वर्गों पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए। यह विधि पहले से दाग प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर की गतिविधि को पट्टी करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण में उपयोग की जाने वाली एक ही प्रक्रिया और अभिकर्मकों का उपयोग करती है। स्लाइड एक सामान्य इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग थे जिसके बाद एक बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक बाध्यकारी कदम था। फिर, एक एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सिडेस सिग्नल विकास विधि का उपयोग फ्लोरोफोर-टायरामाइड के साथ सब्सट्रेट के रूप में किया गया था। 8 मिन के लिए एक माइक्रोवेव उबलते सोडियम साइट्रेट समाधान में विसर्जन के माध्यम से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर की इम्यूनोएक्टिविटी छीन ली गई थी। अघुलनशील फ्लोरोफोर-टायरामाइड जमाव नमूने पर बना रहा, जिसने स्लाइड को अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया। हालांकि यह विधि सबसे झूठे सकारात्मक संकेतों को समाप्त करती है, एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से कुछ पृष्ठभूमि बनी रह सकती है। यदि नमूनों को एंडोजेनस बायोटिन से समृद्ध किया जाता है, तो बरामद एंडोजेनस बायोटिन से झूठे सकारात्मक से बचने के लिए बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी को बदलने के लिए एक पेरोक्सिड्स-कॉन्जुगेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में, कंजुगेट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके सीधे धुंधला करने से जानकारीपूर्ण परिणाम प्रदान किए जा सकते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किए बिना, प्रत्यक्ष धुंधला विधि में एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से झूठे कोस्थानीयकरण संकेतों का खतरा कम होता है। हालांकि, प्राथमिक एंटीबॉडी पर संयुग्मित रिपोर्टर्स (फ्लोरोफोर, एंजाइम) या बायोटिन अपने भविष्य के उपयोग को सीमित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, अप्रत्यक्ष इम्यूनोस्टेनिंग आमतौर पर एक लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक अनकॉन्जुजेट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके मजबूत संकेत प्रदान करता है। आदर्श रूप से, एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में उपयोग किए जाने वाले अनकॉन्जुजेड प्राथमिक एंटीबॉडी को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से आना चाहिए। हालांकि, विभिन्न मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उचित संयोजन हमेशा उपलब्ध नहीं होता है।

एक अवांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के जोखिम को खत्म करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं। एक आम विधि दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी1के साथ धुंधला करने से पहले पहले प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर पर किसी भी शेष बाध्यकारी एपीटोप को ब्लॉक करने के लिए एफ (एबी) मोनोमेरिक एंटीबॉडी का उपयोग है। एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग, जो एक पश्चिमी दाग पत्र की पट्टी और पुनर्जांच के समान है, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 और फ्लोरोसेंट टायरामाइड जमाव3जैसे पता लगाने योग्य रिपोर्टर अणुओं के बयान को अलग किए बिना पहले दाग एंटीबॉडी परिसर को हटा देता है । इस विधि से अलग-अलग रंगों में रिपोर्टर अणु एक ही स्लाइड पर मल्टीप्लेक्स का रिजल्ट दिखा सकते हैं। मल्टीप्लेक्स धुंधला भी एंटीबॉडी की पहले से जमा की गई परतों को पूरी तरह से हटाने और अन्य एंटीबॉडी4,5से बाद में अधिग्रहीत छवियों के संरेखण से प्राप्त किया जा सकता है । ये विधियां सभी विश्वसनीय परिणाम देती हैं, हालांकि प्रत्येक विधि की अपनी सीमाएं होती हैं और या तो जटिल प्रक्रियाओं या एक विशेष इमेजिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध बफ़र्स के उपयोग के साथ एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग विधि के आवेदन को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही मेजबान प्रजातियों से दो अलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस अधिवृक्क वर्गों पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. पहले एंटीबॉडी के साथ धुंधला

  1. डिवैक्स और रिहाइड्रेट एफएफपीई निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक को आवंटित 5 मिन के साथ स्लाइड: जाइलीन या समकक्ष रिएजेंट्स 3x, 100% इथेनॉल 2x, 95% इथेनॉल 1x, 70% इथेनॉल 1x, 50% इथेनॉल 1x, और आसुत पानी 2x।
    नोट: स्लाइड अंतिम चरण में बढ़ते जब तक इस रिहाइड्रेशन कदम से शुरू नम रहना चाहिए ।
  2. वैकल्पिक एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए, 8 मिन के लिए उबलते सोडियम साइट्रेट समाधान (10 mM, पीएच = 6.0) के 275 mL में स्लाइड रखें। समाधान उबलते रखने के लिए, स्लाइड ्स को 14 x 9.5 x 9 सेमी3 (डब्ल्यू एक्स एल एक्स एच) पिपेट टिप बॉक्स के नीचे एक ढक्कन के साथ रखें और 8 मिन के लिए 700 डब्ल्यू माइक्रोवेव ओवन में 70% पावर पर समाधान को माइक्रोवेव करें। फिर माइक्रोवेव ओवन से पिपेट टिप बॉक्स निकालें, ढक्कन खोलें, और समाधान को कम से कम 20 किमी के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा होने दें।
  3. स्लाइड्स को पीएसटी (0.1% पॉलीसोर्बेट 20/80 के साथ फॉस्फेट-बफरेड लवलाइन) वाले कोप्लिन जार में स्थानांतरित करें। 5 मिन 3x के लिए PBST के साथ धोएं। यदि तुरंत अगले चरण में नहीं जा रहा है, तो कुछ घंटों के लिए आरटी में एक Coplin जार में PBST के साथ इस कदम पर स्लाइड स्टोर करें या 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अगर तुरंत अगले कदम पर नहीं जा रहा है ।
  4. अवरुद्ध समाधान तैयार करने के लिए अवरुद्ध अभिकर्ता के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के सामान्य सीरम का उपयोग करें। अन्य वाणिज्यिक अवरुद्ध अभिकर्ताओं का भी उपयोग किया जा सकता है। यदि इस अध्ययन में प्रस्तुत अध्ययन के लिए नियोजित सामान्य सीरम का उपयोग करते हैं, तो सामान्य गधे सीरम के 100 माइक्रोन को पीएसटी के 4.9 मिलील में जोड़ें। अवरुद्ध समाधान 3 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. अवरुद्ध करने के लिए, स्लाइड से PBST को हिलाएं और उन्हें पर्याप्त अवरुद्ध समाधान के साथ जल्दी से कवर करें। 30 मिन के लिए एक humidified कक्ष में आरटी में स्लाइड incubate ।
  6. वांछित एकाग्रता के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करने के लिए अवरुद्ध समाधान का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (दो स्लाइड के लिए 500 माइक्रोन) तैयार करें। उपयोग तक समाधान बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    1. 3एचएसडी के लिए, 30एचएसडी के 2 माइक्रोन को अवरुद्ध समाधान के 498 माइक्रोन में जोड़ें।
    2. टीएच के लिए, ब्लॉकिंग समाधान के 499 माइक्रोन में टीएच एंटीबॉडी के 0.5 माइक्रोन जोड़ें।
    3. कैटेनिन के लिए, अवरुद्ध समाधान के 499 माइक्रोन में 1 माइक्रोन एंटीबॉडी जोड़ें।
    4. 20αHSD के लिए, 20αHSD एंटीबॉडी के 1 μL को अवरुद्ध समाधान के 499 माइक्रोन में जोड़ें।
    5. CYP2F2 के लिए, ब्लॉकिंग समाधान के 498 माइक्रोन में CYP2F2 एंटीबॉडी के 2 μL जोड़ें।
  7. स्लाइड से अवरुद्ध समाधान को हिलाकर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें, और उन्हें पर्याप्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ जल्दी से कवर करें। स्लाइड्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उमस भरे चैंबर में। ऊष्मायन के दौरान स्लाइड्स को सूखने से रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के एक छोटे से टुकड़े से कवर किया जा सकता है।
  8. अगली सुबह 5 मिन 3x के लिए PBST के साथ स्लाइड्स धोएं ।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (दो स्लाइड के लिए 500 μL) अवरुद्ध समाधान का उपयोग करने के लिए वांछित एकाग्रता के लिए बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी पतला (जैसे, गधे विरोधी माउस एंटीबॉडी या गधे विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के 1 μL अवरुद्ध के 499 μL में तैयार समाधान) । उपयोग तक समाधान बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  10. स्लाइड से पीएसटीबी को हिलाकर और उन्हें पर्याप्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ जल्दी से कवर करके दूसरे एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। स्लाइड्स में इनक्यूबेट आरटी में 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष ।
    नोट: यदि एंडोजेनस बायोटिन एक चिंता का विषय है, तो बायोटिनेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी के बजाय पेरोक्सिडेस-कॉन्जुर्ब ्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग करें। 1.10 चरण में एक पेरोक्सीडेस-कॉन्जुगार्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके 1.14 चरण में कूदें।
  11. 5 मिन 3x के लिए PBST के साथ स्लाइड्स में धोएं।
  12. एस.ए.एचआरपी के 0.5 माइक्रोन को पीबीएस के 499 माइक्रोन में जोड़कर सहिजन पेरोक्सिडेस-कॉन्जुगेड स्ट्रेप्टाविडिन (एसए-एचआरपी) सॉल्यूशन (एसए-एचआरपी) सॉल्यूशन (दो स्लाइड्स के लिए 500 माइक्रोन) तैयार करें। अंतिम एकाग्रता 1 μg/mL है ।
  13. एसए-एचआरपी समाधान के साथ इनक्यूबेट। स्लाइड्स से पीएसटी को हिलाएं और स्लाइड्स को पर्याप्त एसए-एचआरपी सॉल्यूशन के साथ जल्दी से कवर करें। स्लाइड्स में पढ़ें आरटी में 0.5 घंटे के लिए उमस भरे चैंबर में।
  14. 5 मिन 3x के लिए PBST के साथ स्लाइड्स में धोएं।
  15. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोफोर-टायरामाइड को कमजोर करने वाले बफर के साथ फ्लोरोफोर-टायरामाइड को कमजोर करके तैयार करें (उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोर-टायरामाइड के 5 माइक्रोन कमजोर पड़ने के 496 माइक्रोन) में।
  16. स्लाइड्स से एसपीएसटी को हिलाकर फ्लोरोफोर-टायरामाइड के साथ सिग्नल डेवलपमेंट करें और पर्याप्त फ्लोरोफोर-टायरामाइड समाधान के साथ स्लाइड को जल्दी से कवर करें। आरटी में 1 मिन के लिए एक आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट । ऊष्मायन समय वांछित फ्लोरेसेंस तीव्रता प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। स्लाइड्स को पीएसटी से युक्त कोब्लिन जार में स्थानांतरित करके प्रतिक्रिया बंद करें। 3 मिन 2x के लिए PBST के साथ स्लाइड धोएं।
  17. इस स्तर पर परिणाम की पुष्टि करने के लिए फ्लोयोरसेंस माइक्रोस्कोप के तहत संकेतों की जल्दी जांच की जा सकती है। यदि कवरस्लिप का उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो नमूनों को नम रखने के लिए प्रत्येक खंड पर ग्लाइसेरोल: पीबीएस (1:1) की एक बूंद लागू करें। 3 मिन 2x के लिए PBST के साथ स्लाइड धोएं। स्लाइड्स में जा सकता है अगले कदम पर जाने से पहले कुछ दिनों के लिए एसपीएसटी में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है ।

2. पहले एंटीबॉडी पट्टी

  1. स्लाइड्स में रखें उबलते सोडियम साइट्रेट सॉल्यूशन (10 एमएम, पीएच = 6.0) कम से कम 8 मिन के लिए स्लाइड्स फ्लैट को 14 x 9.5 x 9 सेमी3 (डब्ल्यू एक्स एल एक्स एच) पिपेट टिप बॉक्स के नीचे ढक्कन के साथ रखकर हल को उबालकर 800 डब्ल्यू माइक्रोवेव ओवन में 700 डब्ल्यू माइक्रोवेव ओवन में 70% बिजली पर घोल को माइक्रोवावित करें। यदि एक लंबे समय तक अलग करना समय पसंद किया जाता है, तो हर समय बफर समाधान में डूबी स्लाइडों को रखने के लिए उबलते सोडियम साइट्रेट समाधान का उपयोग करके बफर को बंद करना आवश्यक हो सकता है। माइक्रोवेव ओवन से पिपेट टिप बॉक्स निकालें, ढक्कन खोलें, और समाधान को कम से कम 20 किमी के लिए आरटी पर ठंडा होने दें।
  2. स्लाइड्स को पीएसटी युक्त कोब्लिन जार में स्थानांतरित करें। 5 मिन 3x के लिए PBST के साथ धोएं। अगर तुरंत प्रदर्शन नहीं किया गया तो स्लाइड्स को कुछ घंटों के लिए आरटी पर पीएसटी के साथ कोप्लिन जार में स्टोर करें या 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।

3. दूसरे एंटीबॉडी के साथ दाग

  1. अवरुद्ध चरण से शुरू करें और चरण 1.14 के माध्यम से चरण 1.5 में समान प्रक्रियाओं का पालन करें। संकेत विकास कदम (चरण 1.15 और चरण 1.16) पर, एक अलग फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम में फ्लोरोफोर-टायरमाइड का उपयोग करें।
    नोट: मल्टीप्लेक्स धुंधला करने की अनुमति देने के लिए स्लाइड्स में कई बार इस विधि का इस्तेमाल करते हुए छीना जा सकता है। पिछले एंटीबॉडी को रिपोर्टर के रूप में फ्लोरोफोर-टायरामाइड की जरूरत नहीं होती है । एक फ्लोरोफोर-कॉन्जुरेट्ड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग पिछले प्राथमिक एंटीबॉडी से संकेत दिखाने के लिए किया जा सकता है।
  2. 2 μg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) या आरटी में 1 मिनट के लिए Hoechst समाधान के साथ इनक्यूबेट स्लाइड अगर परमाणु काउंटर धुंधला की जरूरत है । फिर 3 मिन 2x के लिए पीएसटी के साथ स्लाइड्स धोएं।

4. सिग्नल का पता लगाने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग

  1. प्रतिरक्षण के लिए उपयुक्त बढ़ते माध्यम की एक बूंद के साथ एक कवरस्लिप माउंट।
  2. इमेजिंग के लिए, प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के संकेतों का पता लगाने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। स्लाइड पर ऊतक का पता लगाने के लिए परमाणु धुंधला (DAPI) चैनल और 4x लेंस के साथ शुरू करो ।
  3. इमेजिंग के लिए 10x लेंस पर स्विच करें। एक्सपोजर समय (300 एमएस) और प्रकाश स्रोत तीव्रता (80% तीव्रता) समायोजित करें। यदि सिग्नल बहुत उज्ज्वल या बहुत अंधेरा है तो इन सेटिंग्स को समायोजित करें। मंच को आगे किए बिना प्रत्येक चैनल की तस्वीरें लें। प्रत्येक चैनल के लिए रीफोकसिंग की आवश्यकता हो सकती है। माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर या इमेजजे (imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करके प्रत्येक चैनल से छवियों को मर्ज करें।

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Representative Results

परिणाम एंटीजन पुनर्प्राप्ति कदम १.२ सहित वर्णित सभी चरणों के साथ इलाज नमूनों से प्राप्त किए गए थे । यहां इस्तेमाल किए जाने वाले सभी सेकेंडरी एंटीबॉडी बायोटिनेटेड थे । फ्लोरोफोर-टायरामाइड का उपयोग पहले और दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी से संकेतों को विकसित करने के लिए किया गया था। छवियों को एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था जो एक फ़ैट्रिक घन (हरे रंग के फ्लोरेसेंस के लिए), एक TxRED घन (Cy3 के लिए), और एक DAPI घन (DAPI के लिए) से लैस था।

माइक्रोवाविंग-मध्यस्थता अलग करना क्रॉस-रिएक्टिविटी को समाप्त करता है।
माउस एफएफपीई अधिवृक्क वर्गों को दो प्राथमिक खरगोश एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया गया था। विपठ्ठन के बिना(चित्रा 1ए-सी),टीएच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी ने 30एचएसडी (+) साइटों को उठाया और अधिवृक्क प्रांतस्था(चित्रा 1बी)में लाल संकेत दिए। अलग-अलग होने की कमी के कारण पीले रंग में देखे गए झूठे कोस्थानीयकरण संकेत(चित्रा 1सी)में देखा गया। यह क्रॉस-रिएक्टिविटी (1) एचआरपी एंजाइम से आता है जिसने पहले टायरामाइड प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित किया और (2) एंटीबॉडी प्रजातियों को क्रॉस-रिएक्टिविटी। एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी और एचआरपी को पहले इम्यूनोस्टेनिंग से हटाने के लिए, हमने 1 मिन(फिगर 1डी-एफ)और 8 मिन माइक्रोवेव-मध्यस्थता स्ट्रिपिंग(चित्रा 1जी-आई)का परीक्षण किया। दोनों उपचार गैर विशिष्ट संकेत को खत्म करने के लिए पर्याप्त थे, स्वच्छ डबल धुंधला परिणाम दे(चित्रा 1एफ, मैं)। नकारात्मक नियंत्रण प्राथमिक एंटीबॉडी(चित्रा 1जे)के साथ ऊष्मायन के अपवाद के साथ एक ही चरण के सभी पीछा किया । नकारात्मक नियंत्रण में कोई महत्वपूर्ण संकेत नहीं उठाया गया था । हमने पाया कि उबलते साइट्रेट बफर में 8 न्यूनतम अलग करना आमतौर पर अधिवृक्क ग्रंथि(चित्रा 2)में उपयोग किए जाने वाले कई एंटीबॉडी के लिए एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को खत्म करने के लिए पर्याप्त था।

सीमा - माइक्रोवेव मध्यस्थता विपठ्ठन की प्रभावकारिता एंटीबॉडी निर्भर है।
हालांकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली माइक्रोवेव-मध्यस्थता अलग करना ज्यादातर मामलों के लिए काम करता है, इस विधि की सीमाएं हैं। कुछ एंटीबॉडी के लिए, साइट्रेट बफर के साथ माइक्रोवेव-मध्यस्थता वाली स्ट्रिपिंग विधि एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को पूरी तरह से नहीं हटा सकती है। उदाहरण के लिए, माउस एंटी-टीएच एंटीबॉडी और माउस एंटी-CYP2F2 एंटीबॉडी से 8 मिन्द्र संकेतों को हटा दिया गया, लेकिन एक कमजोर झूठी सकारात्मक संकेत अभी भी पता लगाने योग्य था (चित्रा 3ई में मेडुला और चित्रा 3Kमें आंतरिक प्रांतस्था)। ध्यान दें कि 20 min करने के लिए microwaving समय की वृद्धि अभी भी पूरी तरह से एंटीबॉडी पार प्रतिक्रियाशीलता(चित्रा 3एच, कश्मीर)को दूर नहीं किया ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि पी 1 FFPE माउस एड्रेनल पर डबल इम्यूनोस्टेनिंग। एफएफपीई माउस अधिवृक्क वर्गों को खरगोशों से दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था: एंटी-3एएचएसडी (हरा = कॉर्टेक्स), एंटी-टीएच (लाल = मेडुला)। दाग के तीन समूहों में इस्तेमाल की गई तीन अलग-अलग स्ट्रिपिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं:(ए-सी)नो स्ट्रिपिंग,(डी-एफ)1 मिन स्ट्रिपिंग, और(जी-आई)8 मिन स्ट्रिपिंग। ध्यान दें कि माइक्रोवाविंग के बिना, टीएच के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी ने अभी भी 30एचएसडी संकेतों को उठाया, जबकि 1 मिन और 8 मिन माइक्रोवेव उपचारित समूहों में विशिष्ट धुंधला परिणाम प्राप्त किए गए थे। नकारात्मक नियंत्रण में कोई सकारात्मक संकेत नहीं है, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड नहीं है। स्केल बार = 100 माइक्रोन. DAPI = सेल नाभिक, नीला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि पी 21 एफएफपीई माउस एड्रेनल पर डबल इम्यूनोस्टेनिंग। एफएफपीई माउस अधिवृक्क वर्गों को निम्नलिखित क्रम में खरगोशों से दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था: विरोधी-ए-कैटेनिन (हरा = बाहरी प्रांतस्था) और फिर एंटी-20αHSD (लाल = आंतरिक प्रांतस्था)। बीच में 8 मिन स्ट्रिपिंग स्टेप किया गया । स्केल बार = 100 माइक्रोन; DAPI = सेल नाभिक, नीला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कुछ एंटीबॉडी पूरी तरह से छीन नहीं सकते हैं, जो कमजोर गैर-विशिष्ट संकेतों का कारण बन सकते हैं। एफएफपीई माउस अधिवृक्क वर्गों को चूहों से दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था: एंटी-CYP2F2 (हरा = आंतरिक प्रांतस्था) और एंटी-टीएच (लाल = मेडुला)। कोई अलग करना समूह(ए-सी)से परिणाम से पता चला है कि CYP2F2 प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रतिक्रियाओं अभी भी TH (+) क्षेत्र दाग । अधिवृक्क मेदुल्ला(सी)में एक झूठा सहस्थानीयकरण देखा गया था। हालांकि एक 8 मिन और एक 20 मिन माइक्रोवेव उपचार medulla में हरी फ्लोरेसेंस तीव्रता कम, एक नजर पृष्ठभूमि अभी भी मौजूद है(डी-I)। एंटी-CYP2F2 एंटीबॉडी एक और उदाहरण है जिसमें दिखाया गया है कि 20 मिन माइक्रोव्विंग(जे-एल)के बाद भी क्रॉस-रिएक्टिविटी को पूरी तरह से नहीं हटाया जा सकता है। ध्यान दें कि नकारात्मक नियंत्रण में कोई सकारात्मक संकेत नहीं था, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड नहीं, झूठे सकारात्मक संकेत का संकेत एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी(एम)से था। स्केल बार = 100 माइक्रोन; DAPI = सेल नाभिक, नीला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग दो या दो से अधिक एंटीजन के सेलुलर कोस्थानीयकरण की जांच करने के लिए उपयोगी है। यह व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक कोस्थानीयकरण के परिणामों को समझाने देती है जब प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न संवाददाताओं (प्रत्यक्ष धुंधला) के साथ संयुग्मित होते हैं। हालांकि, प्रत्यक्ष धुंधला आमतौर पर अप्रत्यक्ष धुंधला की तुलना में कमजोर संकेत प्रदान करता है, जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी शामिल हैं। अप्रत्यक्ष धुंधला में, एक उच्च गुणवत्ता वाले मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग परिणाम इस बात पर निर्भर करता है कि माध्यमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के बीच अंतर कर सकते हैं या नहीं। संभावित एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी के कारण, अप्रत्यक्ष धुंधला विधि का उपयोग करने वाले मल्टीप्लेक्स को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अधिक स्पष्ट रूप से देखा जाता है। कार्ल और अन्य ने एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी1को ब्लॉक करने के लिए अनकॉन्जुजेड आईजीजी एफ (एबी) टुकड़े की अधिकता का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल विकसित किया। इसी तरह की रणनीति का उपयोग "माउस-ऑन-माउस" धुंधला करने में किया जाता है जो ऊतक में किसी भी एंडोजेनस माउस इम्यूनोग्लोबुलिन का पता लगाने से एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी को रोकने के लिए एफ (एबी) मोनोमेरिक एंटी-माउस एंटीबॉडी का उपयोग करता है। हालांकि, यह अवरुद्ध विधि समय लेने वाली है और पिछले चरणों से एंटीबॉडी को पूरी तरह से ब्लॉक नहीं कर सकती है, खासकर यदि पता लगाने वाले एंटीजन उच्च बहुतायत2के हैं।

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को रोकने के लिए हीट-मध्यस्थता अलग करना एक और तरीका है। अवधारणा एक पश्चिमी दाग की पट्टी और पुनर्जांच विधि के समान है। स्लाइड्स को साइटरेट बफर में उबालने के लिए माइक्रोवेव का इस्तेमाल एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को ब्लॉक करने पर एक चिह्नित सकारात्मक प्रभाव पड़ा। लोरीमेट्रिक इम्यूनोस्टेनिंग के अनुक्रमिक दौरों के बीच दो 5 मिन माइक्रोवेव उपचार माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी2का उपयोग करके एक ही स्लाइड पर कई एंटीजन का पता लगाने की अनुमति देते हैं। थायराइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) विधि के साथ संयुक्त माइक्रोवेव उपचार, जो एचआरपी के सब्सट्रेट के रूप में फ्लोरोफोर-टायरामाइड का उपयोग करता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस डबल धुंधला3,6,7के लिए भी उपयोगी हैं। पहले और दूसरे धुंधला चक्रों के बीच माइक्रोवेव उपचार अपने फ्लोरोसेंट टायरामाइड वर्षा को धोए बिना पहले इम्यूनोकॉम्प्लेक्स की गतिविधि को रोकता है। हालांकि, एक माइक्रोवेव उपचार पूरी तरह से धुंधला8में संदूषण को रोकने में सक्षम नहीं हो सकता है । हालांकि विभिन्न प्रकार के स्ट्रिपिंग बफ़र्स का उपयोग करने वाले कुछ तरीकों से बेहतर स्ट्रिपिंग प्रभावकारिता प्रदान की जा सकती है, लेकिन लंबे ऊष्मायन समय वाले विशेष बफ़र्स की आवश्यकता होती है, या नमूनों को4,5,7,9,10,11लागू होने से पहले छवि अधिग्रहण से गुजरना पड़ता है। यहां हम एक कम जटिल प्रक्रिया के साथ एक सरल विधि और मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला में माइक्रोवेव मध्यस्थता एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए एक आम बफर प्रदर्शित करते हैं । हालांकि यह विधि सबसे क्रॉस-रिएक्टिविटी को समाप्त करती है, उपयोगकर्ताओं को 20 मिन माइक्रोवेव उपचार के बाद भी कुछ एंटीबॉडी के साथ देखे गए संभावित कमजोर झूठे कोस्थानीयकरण के बारे में पता होना चाहिए।

एंडोजेनस बायोटिन का उपयोग एड्रेनल कॉर्टेक्स12में स्टेरॉयडजेनिक कोशिकाओं के मार्कर के रूप में किया जा सकता है। स्ट्रेप्टेविडिन-कॉन्जुगेरेट्ड फ्लोरोफोर अकेले एंडोजेनस बायोटिन का पता लगाने और पूरे अधिवृक्क प्रांतस्था को रोशन करने के लिए पर्याप्त है, विशेष रूप से जमे हुए वर्गों में। क्योंकि एंडोजेनस बायोटिन आमतौर पर एफएफपीई नमूनों में अवरुद्ध होता है, एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सिडेस प्रक्रिया (यानी, एबीसी किट) का उपयोग अभी भी एफएफपीई अधिवृक्क नमूनों में लक्ष्यों को बढ़ाने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एंटीजन रिट्रीवल कदम भी एंडोजेनस बायोटिन को अनमास्क करता है और इसकी इम्यूनोएक्टिविटी13को प्रेरित करता है । क्योंकि हमारी विधि माइक्रोवेव-मध्यस्थता एंटीजन पुनर्प्राप्ति और स्ट्रेप्टाविडिन-कंजुगेड एचआरपी के उपयोग को जोड़ती है, यह संभव है कि एंडोजेनस बायोटिन झूठे सकारात्मक संकेतों को जन्म देगा, विशेष रूप से एंडोजेनस बायोटिन (जैसे, जिगर, गुर्दे, और कुछ ट्यूमर)13से समृद्ध ऊतकों में। यदि सिग्नल को बढ़ाने के लिए एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सिडेस प्रक्रिया की आवश्यकता है, तो मुफ्त एविडिन और मुफ्त बायोटिन के साथ प्रीइनक्यूबेशन जैसे एक अतिरिक्त अवरुद्ध कदम एंडोजेनस बायोटिन सिग्नल14को कम करने में मदद कर सकता है। जबकि हमारी विधि एफएफपीई माउस एड्रेनल पर कम एंडोजेनस बायोटिन पृष्ठभूमि देती है, एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सिडेस प्रक्रिया का उपयोग करते समय हमेशा प्रत्येक नमूने के साथ नकारात्मक नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक दृष्टिकोण बायोटिनेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी के बजाय एक पेरोक्सिड्स-कॉन्जुगेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग करना है।

हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि साइट्रेट बफर के साथ माइक्रोवेव उपचार मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी क्रॉस-पुनर्क्रियाकलाओं को पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं किया जा सकता है। एक कमजोर झूठी सहस्थानीयकरण संभव है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में किया जा सकता है जब विभिन्न मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उचित संयोजन उपलब्ध नहीं होता है। उपयोगकर्ताओं को शेष क्रॉस-रिएक्टिविटी के साथ-साथ बरामद एंडोजेनस बायोटिन से संभावित झूठी सकारात्मक के बारे में पता होना चाहिए। उचित नकारात्मक नियंत्रण हर समय शामिल किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर00 एचडी032636 द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse JacksonImmuno 715-066-151 1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit JacksonImmuno 711-066-152 1:500 dilution
DAPI BioLegend 422801 2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope ECHO Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin JacksonImmuno 016-030-084 1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W General Electric JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2 Santa Cruz SC-374540 1:250 dilution
Mouse anti-TH Santa Cruz SC-25269 1:1,000 dilution
Normal donkey serum JacksonImmuno 017-000-121 2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD Kerafast EB4002 1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD TransGenic KO607 1:250 dilution
Rabbit anti-TH NOVUS NB300-109 1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin Abcam ab32572 1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) JacksonImmuno 016-303-084 1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide PerkinElmer SAT704B001EA 1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide PerkinElmer SAT701001EA 1:100 dilution

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 156 मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस टायरमाइड माइक्रोवाविंग एंटीजन रिट्रीवल एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग
माउस एड्रेनल पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए माइक्रोवाविंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड − एक ही मेजबान प्रजातियों से अनकॉन्जुज्ड प्राइमरी एंटीबॉडी का उपयोग करना
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Lyu, Q., Zheng, H. S., Laprocina,… More

Lyu, Q., Zheng, H. S., Laprocina, K., Huang, C. C. J. Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals − Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species. J. Vis. Exp. (156), e60868, doi:10.3791/60868 (2020).

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