Summary
פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.
Abstract
קסנוגרפטים נגזר החולה (PDX), שנוצר כאשר רקמת הגידול המטופל נותח הוא חרט ישירות לתוך עכברים חיסוניים, להישאר יציב ביולוגית, ובכך שמירה על מולקולרי, גנטי, ותכונות היסטולוגיות, כמו גם הטרוגניות של הגידול המקורי. עם זאת, שימוש במודלים אלה כדי לבצע מספר רב של ניסויים, כולל סינון סמים, הוא אסור הן מבחינת עלות וזמן. מערכות תרבות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נתפסות באופן נרחב כפלטפורמות שבהן תאים סרטניים שומרים על שלמותם הביולוגית באמצעות אינטראקציות ביוכימיות, מורפולוגיה וארכיטקטורה. לצוות שלנו ניסיון רב בהתאגיד תאי PDX במבחנה באמצעות מטריצות תלת-מימד המורכבות מחומצה היאלורונית (HA). על מנת להפריד את תאי סטרומה פיברובלסט העכבר הקשורים PDXs, אנו משתמשים בתרבות סיבוב, שבו תאים סטרומה לדבוק על פני השטח של צלחות שטופלו בתרבות רקמות בעוד תאים סרטניים PDX נותק לצוף ולשייך עצמי לתוך אשכולות רב תאיים. גם צפים supernatant הם יחיד, לעתים קרובות תאים מתים, אשר מציגים אתגר באיסוף אשכולות PDX קיימא עבור אנקלוסציה במורד הזרם לתוך הידרוג'לים עבור תרבות תא 3D. על מנת להפריד תאים בודדים אלה מאשכולות תאים חיים, השתמשנו צנטריפוגציה הדרגתית צעד צפיפות. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר דלדול של תאים בודדים שאינם בר קיימא מהאוכלוסייה הבריאה של אשכולות תאים שישמשו לניסויים נוספים במבחנה. במחקרים שלנו, אנו משלבים את תרבויות 3D צלחות microfluidic המאפשרים עירוי מדיה במהלך התרבות. לאחר הערכת התרבויות הנובעות מכך באמצעות התבססות על הכדאיות המבוססת על תמונה פלורסנטית של תאים מטוהרים לעומת תאים לא מטוהרים, התוצאות שלנו מראות כי צעד הפרדה נוסף זה הפחית באופן משמעותי את מספר התאים שאינם מעשיים מהתרבויות שלנו.
Introduction
במהלך העשור האחרון, התחום של מחקר סרטן הפגין התלהבות מחודשת עבור xenografts נגזר החולה (PDXs) ככלי להערכת הסתמכות מסלול תא סרטניורגישות לסמים 1. מודלי PDX הנפוצים ביותר מבוססים על ידי השתלה תת עורית או אורתוטופית של תאים סרטניים אנושיים – שבר גידול, מקבץ של תאים נגזרים גידול תותק, או מדגם של תאים סרטניים מבודדים במחזור (CTCs)- לתוך מארח מכרסם. אם הגידול "לקחת" הוא מוצלח, תאי xenograft יהיה להתרבות, כלי דם, ואחרת אינטראקציה עם רקמת המארח כדי ליצור גידול, אשר ניתן לקצור בגודל אופטימלי, מחולק, מושתל מחדש לתוך מארחים אחרים. בין היתרונות הרבים שלהם כמערכת מודל, PDXs בדרך כלל לשמור על חלק ניכר של הטרוגניות של אוכלוסיית תאי הגידול הילידים ולאפשר את ההערכה של מסלולים ספציפיים לבניאדם ותגובות תא 2,,3. בהקשר vivo מאפשר אינטראקציה גידול עם כלי דם סטרומה סמוכים אחרים ומאפייני רקמות recapitulates כגון דינמיקת דיפוזיה סמים, מתח חמצן, מטריצה חוץ תאית השפעה כי ביולוגית ומכאנית להשפיע על התקדמות הגידול. היבט שלילי של PDXs הוא ההסתמכות שלהם על מארח מכרסמים, הן להרחבת הגידול ובסופו של דבר לבדיקת השערה. מכיוון PDXs רבים לא יכול להסתגל לתרבות דו מימדית מסורתית (2D) על פוליסטירן תרבות רקמות מבלי לאבד רבים מהמאפיינים הרצויים שלהם, יש כבר קרקע ביניים מינימלית עבור חוקרים בין זה מבוקר יחסית בשיטת המבחנה, ואת העלייה המשמעותית בהוצאות, מתקנים, ודרישות זמן לשימוש vivo PDX.
תיארנו מספר מודלים במבחנה המיישמים תרבות תא 3D בתוך מטריצה תומכת, ולאחרונה הרחיבו את העבודה כדי להדגים את תרבות vivo לשעבר של סרטן הערמונית מרובים (PCa)נגזר PDXs, הן לבד והן בתרבות שיתופית עם פיברובלסטים נגזר מחעצם 4,5. מטריצות הידרוג'ל מבוססות חומצה היאלורונית (HA) מספקות תמיכה הניתנת להתאמה אישית ורלוונטית ביולוגית לשני סוגי התאים, עם שליטה שנייה על מאפייני הידרוג'ל ובהירות אופטית להדמיה דרך עומק הידרוג'ל6.
רקמות גידול PDX בוגרות מהוות תערובת משתנה של תאים סרטניים אנושיים הטרוגניים סטרומה העכבר (פיברובלסטים, תאים אנדותל, וכו '). כדי ללמוד את סוג התא תרומות ספציפיות להתקדמות הגידול במבחנה, זה יכול להיות יתרון לנתק גידולים, להפריד את אוכלוסיות התא, ובאופן ניסיוני לשלב אותם באופן מאורגן לנתח מסלולים של תקשורת בין תאית. אוכלוסיות תאים מעורבים בתוך עיכול רקמות יש תאימות דיפרנציאלית עם תנאי תרבות ספציפיים. לדוגמה, הכדאיות פיברובלסט הקשורים לגידול מחייבת דבקות פני השטח או מטריצות תלת-מידור פונקציונליות עם ליגנדים אינטגריים, בעוד תאי PDX נגזר אפיתל אין בדרך כלל דרישות אלה, במקום להעדיף אינטראקציות תא. הבדלים אלה ניתן לנצל כדי להשיג הפרדה יעילה של תאי PDX מתאי סטרומה עכבר מזהמים. תרבות סיבוב של עיכול רקמות מאפשרת דבקות תא סטרומה על פני השטח של תרבות הרקמה בעוד הדבקות תא כונן תאי PDX מרחפים מעל פני השטח של התרבות מסתובבת כדי ליצור אשכולות רב-תאיים supernatant ב 24-48 שעות. המאפיינים הספציפיים של אשכולות אלה משתנים בהתאם ל-PDX (לדוגמה, אשכולות גדולים, הדוקים, כדוריים מאוד או אגרגטים קטנים ורופפים יותר הדומים לאגמים של ענבים), אך הם בדרך כלל בגדלים רלוונטיים ביולוגית (קוטר 50-250 μm), מספיקים להערכת אינטראקציות תאיות המסתמכות על אנשי קשר בין-תאיים.
אחזור גידול ועיבוד באופן בלתי נמנע גורמת במידה מסוימת של מוות בתאים משניים, בין אם בשל נזק לטווח קצר של שיבוש מכני/אנזימטי, או אי-תאימות לטווח ארוך של תת-אוכלוסיות בתנאי התרבות הנבחרים. למרות התועלת של תרבות סיבוב כהפרדה בתפזורת ראשונית, תאים מתים או גוססים מועברים באופן בלתי נמנע עם אשכולות PDX יכול להשפיע על התרבות שנוצרה. תאים מתים אלה הם לעתים קרובות תאי PDX בודדים שלא שולבו באשכול, פיברובלסטים סטרומה עכבר שלא יכול לשרוד בתנאי תרבות נבחרים, או תאים אנדותל שביר במיוחד. תאים גוססים כאלה יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוניות של "ניצולים" ויכולים להשפיע באופן משמעותי על כימות, למשל, באמצעות בדיקות ההקרנה מבוססות התדמית של פלורסנט. כדי לשפר את הבחירה של תאי PDX חיים משיטה זו, התאמנו שיטות צנטריפוגציה עם שלבי צפיפות כדי להסיר בקלות תאים מתים/ גוססים בודדים מתערובות PDX ולשמור בעיקר אשכולות רב-תאיים חיים.
כדי לשפר את המחקר של אשכולות נגזר PDX תוצאות בתרבות 3D, השתמשנו בפלטפורמת תרבות פרייז'יה מבוססת מיקרו-נוזלים, OrganoPlate (איור 1), שהיא פלטפורמת איבר-על-שבב בתפוקה גבוהה המאפשרת תרבות בו-זמנית של עד 96 תרבויות בודדות, תלת-מית-מיוד, על בסיס צלחת מיקרוטיטר 384 באר(איור 1A)7,,8. בצלחת מיקרו-נוזלת דו-מסלולית, שבב רקמה יחיד מחובר באמצעות שני ערוצים מיקרופלוידיק(איור 1B,ערוץ ג'ל: אדום, ערוץ זלב: כחול) המשתרעים על פני ארבע בארות ברציפות. שני הערוצים המיקרו-נוזלים מופרדים על ידי רכס פלסטיק קצר הנקרא Phaseguide המונע גלישה של ערוץ אחד לתוך ערוץ השכן הסמוך לו, ובו זמנית מאפשר ממשק ללא קרום בין תכולת הג'ל לערוץהזבר 9. מכיוון שתחתית הלוח המיקרוסקופי מורכבת מזכוכית ברמת מיקרוסקופ, ניתן לצפות בתרבויות בחלון התצפית דרך תחתית הצלחת עם מיקרוסקופ סטנדרטי או אוטומטי. התזתה מבוססת בצלחת microfluidic עם נדנדה לתכנות, באמצעות כוח המשיכה כדי להניע את המדיה דרך הערוצים microfluidic, בין בארות מאגר(איור 1C). זרימת העירוי-לחקות באופן הדוק יותר recapitulates microenvironment הגידול מאשר תרבות סטטית, המאפשר התאגדות של מתח גיזר והפצה משופרת של גזים וחומרים מזינים. היתרונות של שמירה על תרבות תאים סרטניים מנוון בצלחת microfluidic תוארו בעבר כתרביות סרטן השד חדורים הפגינו קיימות אופטימלית לעומת תרבות 3D סטטי של אותם תאים7.
הדו"ח הנוכחי מתאר שיטת צנטריפוגציה הדרגתית מותאמת של צפיפות לבידוד אשכולות PDX רב-תאיים חיים ומדגים את כלי הפעולה שלה בהקמת תרבויות PDX תלת-מימדיות בתוך לוחות מיקרו-נוזלים חד-תכליתיים. מכיוון שמספר גדל והולך של מעבדות מחקר מחפשות שיטות להקל על השימוש ב-PDX, אנו צופים כי הפרוטוקולים המוצגים כאן יהיו של תועלת מיידית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמת הגידול הושגה בהסכמת המטופל ועל פי פרוטוקול ועדת הביקורת המוסדית (IRB) שאושרה. Xenografts הושתלו, גדלו, ונקצרו על פי פרוטוקול מקובל לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).
הערה: כל העבודה תבוצע בקבינט בטיחות ביולוגי סטרילי כדי לשמור על עקרות. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת חומרים לעיבוד PDX
- מפסים Autoclave וידית אזמל או סכיני גילוח.
- להפשיר תמיסת אנזים ניתור ב 4 מעלות צלזיוס בלילה או בטמפרטורת החדר באותו היום כמו ניתיקות רקמות.
הערה: הפשרה ב- 37 °C אינה מומלצת, מכיוון שדרך זו יכולה להשבית אנזימי דיסוציאציה מסוימים. - להכין לפחות 100 מ"ל של תרבות PDX בינוני (תערובת הנשר שונה של Dulbecco בינוני-מינון F-12 [DMEM-F12] עם 100 U /mL פניצילין סטרפטומיצין ו 30% סרום בשר עוברי [FBS]), ולפחות 25 מ"ל של PDX עיבוד בינוני (DMEM-F12 עם 100 U /mL פניצילין סטרפטומיצין ללא FBS). לאחסן ב- 4 °C עד מוכן לשימוש.
2. דיסוציאציה PDX וטיהור ראשוני של רכיב סטרומה
- לאסוף כלים autoclaved, מסנני תא μm μm (2-3), 60 מ"מ סביב רקמות תרבות מנות (2), 6-באר רקמה תרבות צלחות, סטרילי 50 מ"ל צנטריפוגות חרצות, ו תמיסת מלח סטרילית 1x פוספט buffered (PBS). תרבות חמה בינונית עד 37 °C ולאפשר פתרון אנזים דיסוציאציה להגיע לטמפרטורת החדר.
- כאשר רקמת PDX הגיעה קוטר של 1.0-1.5 ס"מ במארח עכבר, להסיר בניתוח את הגידול מהעכבר על ידי אמצעים סטנדרטיים (למשל, תחת הרדמה מקובלת) ולאחסן על קרח בצינור 50 מ"ל עם מדיום תרבות PDX(איור 2A). לעבד את הרקמה מיד, באמצעות השלבים הבאים, כדי למקסם את הכדאיות של התא, רצוי בתוך 1-2 שעות לאחר הקציר.
- להעביר רקמת גידול לצינור סטרילי 50 מ"ל שנשקל מראש. לשטוף 6x עם 30 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר דם ומזהמים. להסיר נוזל רב ככל האפשר ולשקול את רקמת הגידול.
- להעביר רקמת הגידול לצלחת תרבות רקמות עגולה 60 מ"מ וטחינה לתוך ~ 1 מ"מ3 חתיכות באמצעות סכין גילוח סטרילי או אזמל.
- להוסיף 5 מ"ל של PDX עיבוד בינוני לאסוף slurry גידול ולעבור צינור סטרילי חדש 50 מ"ל. לשטוף את צלחת התרבות עם עוד 5 מ"ל של PDX עיבוד בינוני, אז עם תמיסת אנזים דיסוציאציה (10 מ"ל / g גידול, לפחות 5 מ"ל), הוספת כל שטיפה צינור 50 מ"ל.
- דגירה 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין. מערבבים את הצינור בעדינות באמצע זמן הדגירה.
- פיפטה למעלה ו למטה בעדינות עם פיפטה סרולוגית כדי לשבור גושים. לסנן תאים עם מסננת תא 70 μm ממוקם מעל צינור סטרילי חדש 50 מ"ל.
הערה: ייתכן שיהיה צורך ביותר ממסננת אחת. - צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות לתאי גלולה. הסר supernatant וssuspend ב- 2-3 מ"ל של תרבות PDX בינוני. לספור תאים באמצעות מד המיוציטומטר או מונה תא אוטומטי.
- השתמש בטבלה 1 כדי להעריך את המספר הנדרש של תאים המופקים מ- PDX התנתקות הדרושים להשגת צפיפות התא הרצויה לכל שבב.
הערה: הערכים בטבלה 1 מיועדים להיות נקודת התחלה. הערכים בפועל ישתנו עקב קתיות רקמות / תאיות ואובדן תאים מהקפאה / התאוששות. גידולים PDX הם אנשים אפילו בתוך סוג סרטן נתון כך ערכים אלה יש להתאים אמפירי. - מתוך המספר המחושב בשלב 2.9, לוח 1-2 x10 6 תאים ב 5 מ"ל של PDX תרבות בינוני לכל באר של צלחת תרבות רקמות 6-באר. דגירה (37°C, 5% CO2, 95% לחות) ל-48 שעות עם טלטול עדין (50-55 סל"ד) לקידום היווצרות אשכול(איור 2B). לאחר הקמת האשכול, המשך לסעיף 3 עבור צנטריפוגציה.
- Cryopreserve תאי PDX שאינם נמצאים שימוש מהניתיקה הראשונית ב- 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) או מדיום הקפאה ראשי זמין מסחרית.
הערה: תאי סטרומה עכבר Adherent ניתן גם לשחזר מפני השטח צלחת רקמה, אם תרצה, על ידי שטיפה קצרה עם תרבות בינונית והרחבה על ידי אמצעים סטנדרטיים. - לשימוש מאוחר יותר של תאים סרטניים PDX cryopreserved / סטרומה עכבר, להפשיר תאים באמבט מים 37 מעלות C במשך 2 דקות. ספירה וצלחת בצלחת תרבות רקמות 6-באר כמתואר בשלב 2.10 לפני שממשיך לסעיף 3. הגדל את מספר תאי PDX ב- ~ 20% כדי להתאים להפסדים קיימים מהקפאה.
3. הפרדת צנטריפוגציה מבוססת צנטריפוגציה הדרגתית של אשכולות הנגזרים מ- PDX מתאי יחיד
- הכן 20 מ"ל של 100% תמיסת מעבר צבע צפיפות על ידי ערבוב יסודי של 18 מ"ל של תמיסת צנטריפוגציה הדרגתית בצפיפות עם 2 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית של 10x הנקס (HBSS) בצינור חסין סטרילי של 50 מ"ל. הפוך 10 מ"ל לכל אחד של 20%, 30%, 40%, ו 55% פתרונות הדרגתיים בצפיפות על-ידי דילול פתרון זה של 100% עם HBSS סטרילי 1x ערבוב היטב.
הערה: אמצעי אחסון אלה מספיקים עבור שני מעברי צבע של 15 מ"ל בהם ניתן להשתמש כדי להפריד כ- 15 x 106 תאים כל אחד. אם הפרדת פחות מ- 15 x10 6 תאים, יש להשתמש מעבר הצבע השני כאיזון צנטריפוגציה. - הוסף 3 מ"ל של 55% תמיסת מעבר צבע צפיפות לתחתית צינור חסוני 15 מ"ל. מחזיק את הצינור בזווית, בעדינות רבה שכבה 3 מ"ל של 40% תמיסת הדרגתית צפיפות על גבי השכבה 55%, לאט מחלק את הנוזל על הצד הזוויתי של הצינור כדי למנוע ערבוב השכבות. חזור על הפעולה עם תמיסת מעבר הצבע בצפיפות של 30%.
- אספו את הסופרנטנט של תרביות סיבוב PDX עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, שטיפה בעדינות של משטח לוח. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות לתאי כדורי.
- הסר supernatant ולתחות מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של 20% צפיפות הדרגתית פתרון לפי מספר מעברי צבע הדרושים כדי להפריד את התאים. שכבה בזהירות 20% תמיסת מעבר צבע צפיפות עם תאים על החלק העליון של מעבר הצבע.s. אם משתמשים רק בצינור הדרגתי אחד לתאים, עלו על צינור מעבר הצבע של איזון עם פתרון הדרגתי בצפיפות של 20% ללא תאים.
- מכסים את הצינורות ואת הצנטריפוגה צנטריפוגה רוטור דלי נדנדה במשך 30 דקות ב 4 ° C, 2,000 x g, ו 0 בלם.
- לאחר צנטריפוגה, שברים יהיו גלויים(איור 2C). אסוף 2-3 מ"ל של שברים לתוך צינורות 15 מ"ל טריים. הוסף 3-4 אמצעי אחסון של HBSS סטרילי 1 לכל שבר והפוך לערבב ביסודיות.
- צנטריפוגה ב 1,000 x g עבור 3 דקות לתאי כדורי. הסר supernatant וssuspend את גלולת התא ב 1-2 מ"ל של עיבוד PDX בינוני.
הערה: אשכולות תאי PDX מעשיים נמצאים בדרך כלל בממשק פתרון הדרגתי בצפיפות של 40%-55%(איור 2D) עםתאים מתים/גוססים בודדים שמצטברים בממשק פתרון הדרגתי בצפיפות של 20%-40% עבור רוב ה- PDXs שנבדקו. - הסר aliquot קטן, מייצג (50-100 μL) עבור ניתוב מחדש עם אמצעי אחסון שווה של פתרון אנזים דיסוציאציה כדי להעריך את מספר התא בהשעיית התא מקובצים באשכולות. לספור תאים עם מד המיוציט או מונה תא אוטומטי.
4. הכנת הידרוג'ל וזרעת צלחת מיקרופלויד
- לשחזר פתרונות הידרוג'ל HA (ת'יול שונה HA, HA-SH; thiol-תגובתי פוליאתילן גליקול diacrylate, PEGDA) על פי הוראות היצרן.
- באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 50 μL של HBSS לכל הבארות בעמודות חלון תצפית (עמודה 3, 7, 11, 15, 19, 23) של צלחת מיקרו-נוזלים דו-מסלולית כדי לשמור על לחות תרבות ותנאי הדמיה אופטימליים.
- לחשב את הנפח של מתלה תא מסעיף 3 הדרוש עבור 50 μL של הידרוג'ל בצפיפות התא הרצויה (כלומר, 5,000 תאים / μL). עבור זריעת צלחת מיקרופלוידית אחת, aliquot את הנפח המחושב לתוך כל 4 צינורות צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל.
הערה: הידרוג'לים HA יש זמן קבוע gelation. להתאים את הנפח של פתרון ג'ל aliquots ליעילות המשתמש בחלוקת אם ג'לציה מוקדמת מתרחשת. - התאם את רמת ה-pH של פתרון HA-SH ל- 8.0 עם 1 N NaOH מיד לפני השימוש. לבצע gelation מבחן על ידי ערבוב 40 μL של HA-SH עם 10 μL של PEGDA וניטור gelation לאורך זמן. גלציה מתחילה בדרך כלל 5-8 דקות לאחר ערבוב HA-SH עם crosslinker PEGDA.
- עלי 2 דקות (200 x גרם,טמפרטורת החדר) לתאי כדורי. הסר בזהירות את תאי supernatant וssuspend בנפח המתאים של HA-SH.
הערה: הידרוג'ל הסופי הוא 4:1 HA-SH:PEGDA פתרון (על ידי אמצעי אחסון) כך תאים צריך להיות resuspend ב 40 μL של HA-SH עבור 50 μL נפח סופי. - להוסיף 10 μL של PEGDA ל aliquot אחד של תאים ב HA. מערבבים היטב והמתינו 1-3 דקות (בהתאם לזמן הג'לציה משלב 4.4) לפני זריעת הלוח המיקרו-נוזל.
הערה: מתן אפשרות לתגובת הג'לציה של התחלה לפני זריעה עוזר למזער את התא התיישבות. - הדבק טיפ לחלק 1.5 אמצעי אחסון μL לערוץ אחד חוזר פיפטה לטעון עם תאים בתמיסת הידרוג'ל HA. זכור לשמור על aliquot הידרוג'ל מעורב היטב כדי להבטיח חלוקת תאים אפילו.
- כדי לזרוע את הצלחת מיקרופלויד, ליישר קצה פיפטה ניצב לצלחת תוך הנחת בעדינות את הקצה במרכז חדירה ג'ל (עמודות 1, 5, 9, 13, 17, 21) כדי להבטיח מגע אך ללא לחץ בעת חלוקת תמיסת הידרוג'ל. עובד במהירות כדי למנוע התגבשות הידרוג'ל מוקדמת, לוותר 1.5 μL של תמיסת ג'ל לתוך כל לתוך כל צף ג'ל.
- שימו לב למצב המילוי של הערוצים המיקרוסקופיים על-ידי צפייה מראש הצלחת, מתחתית הצלחת, או לפי מיקרוסקופ, והעריכו את הטעינה, באמצעות איור 3 כמדריך (טעינה מוצלחת באות 3A, הדרכה למיקום צנרת באות 3B, הטעינה שלא נענתה באות 3C, לא מלאה עד לסיום איור 3D, גלישה באות 3E). זהה את כל ההתאמות הדרושות בטכניקה שעשויות לשפר את הצלחת המילוי לסיבוב הבא של השבבים (עיין בדיון לקבלת עצות לפתרון בעיות).
- חזור על שלבים 4.6-4.9 עם 3 aliquots הנותרים של תאים בפתרון HA. להפוך את הצלחת בעת הכנת aliquot הבא (~ 1 דקות).
הערה: זמן ההמתנה של דקה אחת והיפוך של הלוח משפרים את התפלגות תלת-מית-מיוד של התאים על-ידי הפחתת התאים בעת התרחשות הג'לציה. - לאחר שכל השבבים מלאים, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עד להשלמת הג'לציה (כ-45 דקות).
- באמצעות המדריך שסופק, ודא שנדנדת התבעבה מותקנת באינקובטור של תרבות התא עם הגדרות ההתברבות הנכונות (זווית של 14°, מרווחי זמן של 4 דקות).
- הוסף 50 μL של תרבות PDX בינוני לכל החדרים הבינוניים (עמודות 2, 6, 10, 14, 18, 22) ולבדוק אם הערוצים התמלאו כראוי על ידי היפוך הלוח. הקש בעדינות על הצלחת על משטח כדי לעודד את הנוזל למלא את הערוצים המיקרו-נוזליים.
- הוסף 50 μL של DMEM-F12 (10% FBS) עבור כל שקעים בינוניים (עמודה 4, 8, 12, 16, 20, 24). אם בועות אוויר לכודות בערוץ ההתבות, הסר על-ידי הקשה בעדינות על הלוח כנגד משטח.
- באמצעות מיקרוסקופ וטופס פריסת צלחת(איור משלים 1),שיא מילוי שבב הצלחה. אל תכלול שבבים שלא מולאו כראוי משימוש ניסיוני נוסף.
- מניחים את הצלחת על נדנדה מוטה הניתנת להטיה של 14° ומחזור של 4 דקות כדי להתחיל בהתחלה. החלף את אמצעי תרבות PDX כל 2 ימים (הראשון 50 μL ב פנימה, לאחר מכן 50 μL בשקע).
5. מכתם תאים, הדמיה, וכמת תמונה
- להכין תמיסת אסא יכולת תא המכילה שלושה צבעי פלורסנט (Hoechst 33342, אתידיום הומודימר-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
- הכן פתרונות מלאי של כל צבע כדלקמן: Hoechst 33342 ב 1.6 mM (1 מ"ג / מ"ל) במים deionized; calcein AM ב 4 mM ב DMSO anhydrous; אתידיום הומודימר-1 ב- 2 mM ב- DMSO/H2O (1:4, v/v).
הערה: הפתרונות של calcein AM ואתידיום הומודימר-1 מסופקים בערכה המצוין בטבלת החומרים. - הכן פתרון עבודה יחיד ב- HBSS או במדיום ללא אדום פנול, המכיל את כל שלושת הצבעים. מטב את ריכוז העבודה הסופי עבור כל סוג תא ומטריצה, בטווחים של 1.6-8.0 μM עבור Hoechst 33342, 0.1-10 μM עבור calcein AM ו- 0.1-10 μM עבור אתידיום הומודימר-1.
- הכן פתרונות מלאי של כל צבע כדלקמן: Hoechst 33342 ב 1.6 mM (1 מ"ג / מ"ל) במים deionized; calcein AM ב 4 mM ב DMSO anhydrous; אתידיום הומודימר-1 ב- 2 mM ב- DMSO/H2O (1:4, v/v).
- הסר את אמצעי התרבות ולהחיל את פתרון צבע הכדאיות בעבודה על שבבים מיקרופלויד הרצוי (75 μL ב פנימה, 25 μL בשקע) ולהניא בחזרה על נדנדת זלב באינקובטור תרבות התא במשך 1 שעות.
- תמונה חלונות התצפית של תרבויות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ידני או אוטומטי(טבלתחומרים) עם מסנני פלורסנט (המפורטים כאורכי גל של העירור/פליטה, ב nm) כדי לצפות בכל הגרעין (Hoechst 33342, 350/461), גרעין תא מת (אתידיום הומודימר-1, 528/617), וציטופלסמה תא חי (calcein AM, 494/517).
- ללכוד 140 μm Z-stacks עם גודל שלב של ≤1 μm באמצעות יעד אוויר 20x. שלושה שדות תצוגה נדרשים כדי למצוא את כל המיקרו-ערוץ עם כמות קטנה של חפיפה. כדי להימנע מדגום כפול, תמונה היא רק שני שדות תצוגה לכל שבב.
הערה: יש למטב את תנאי ההדמיה כדי להבטיח דגימה נכונה של NyQuist. מניסיון המחברים, מערכת הדמיה מהירה, המבוססת על דה-פרוולציה של מקור אפינפרו-פלורסנצנטי קונבנציונלי או מצב סריקת תהודה על confocal, יש צורך באופן מלא assay A-stack שלם, עם שלושה צבעי לייזר, על פני 96 שבבים על צלחת בתוך פרק זמן סביר (בערך 3.5 h עם הדמיה אוטומטית, כולל התקנה). - באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, אמור את תמונות Z-stack עבור הנתונים המיומתים הרצויים, כגון מורפולוגיה, מצב צבירה או תכונות אחרות. כדי לכמת את הכדאיות של התא, ספרו את מספר התאים המתים (אדום) ואת גרעין התא הכולל (כחול).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נדנדת זלבנית ניתנת לתכנות הוכנה באינקובטור סטנדרטי של תרבות תא עם שתי נתיבים, וצלחות מיקרו-נוזליות דו-מסלוליות הוכנו בארונות אבטחה ביולוגית סטנדרטייםלהעמסה (איור 1). גידול PDX MDA-PCA-118b הורחב vivo, נקטף כאשר הגיע לגודל מרבי, נותקו כמתואר בפרוטוקול סעיף 2 כדי ליצור השעיה slurry של תאים, בערך מצב תא יחיד(איור 2A). ההשמצות חולקו ללחות של תרבות רקמות של 6 בארות, והונחו על מסובב XY כמתואר, במשך 48 שעות. סטרומה עכבר מחובר לתחתית צלחת תרבות הרקמה, כפי שתואר בעבר, ואת תאי PDX האנושי נשאר צף במדיום, מורכב לתוך אשכולות(איור 2B). תאים בודדים שלא הווסבלו נראו גם הם בכל הפתרון.
מעבר צבע של צפיפות שלב הוקם בצינור צנטריפוגה באמצעות השיטות בפרוטוקול סעיף 3. המתלים העל-טבעיים של תאי PDX שאף בעדינות מהצלחת הרב-מנוולת, הועמסה על מעבר הצבע החורג, וצנטריפוגה כמתואר. לאחר צנטריפוגציה, רצועה מעורפלת, המכילה את אשכולות PDX, היה גלוי ליד הממשק בין שברים 2 ו- 3, ותאים בודדים זוהו בממשק בין שברים 1 ו- 2(איור 2D). שברים נאספו כמתואר, מדוללים עוד יותר ב- HBSS, וצנטריפוגה שוב כדי להסיר את פתרון מעבר הצבע של צפיפות. supernatant היה שאיפה, ואת כדורי התא כתוצאה היו resuspend ב PDX עיבוד בינוני. aliquot קטן של כל שבר מעובד הוערך על ידי מיקרוסקופ, כדי לאשר כי השבר הצפוי הכיל אשכול PDX, ושהריר הנפרד הכיל בעיקר תאים בודדים.
פתרונות הידרוג'ל HA שוחזרו כמתואר בפרוטוקול סעיף 4, ואשכולות PDX נותלו מחדש בתמיסת ההידרוג'ל. פתרונות PDX הועמסו לתוך שבבים על הלוח microfluidic והוערכו לטעינה מוצלחת (איור 3). ברוב המקרים, >90% מהשבבים נטענו בהצלחה לאחר אימון מסוים בטכניקה והתאמה של נפחי טעינה. לאחר טעינת המספר הרצוי של שבבים, דגירה עבור gelation כמתואר, PDX תרבות מדיום נוספה לצלחת microfluidic, ואת הצלחת היה תרבותי עם עירוי.
באמצעות צבעי פלורסנט והשיטות בפרוטוקול סעיף 5, ומיקרוסקופית confocal, 3D מיקרופלויד PDX תרבות הכדאיות מורפולוגיה הוערכו הן בתנאים מופרדים צנטריפוגציה הדרגתית צפיפות מופרדים(איור 4A). תמונות של לוחות אלה תועדו כערימות Z על המיקרוסקופ confocal והוערכו עבור הכדאיות של תאים בתוכנה לניתוח תמונה. ביום הראשון, תרבויות אלה שעברו את שיטת ההפרדה הציגו פי 10 פחות תאים בודדים ומתים (אדום), בהשוואה לתרבויות לא נפרדות(איור 4B). חשוב לציין, האשכולות המופרדים כללו בעיקר תאים חיים (ירוק). לא זוהה הבדל משמעותי סטטיסטית עבור התפלגות גודל האשכול(איור 4C).
תרביות נשמרו עוד יותר בצלחת מיקרופלוידיק במשך שבעה ימים(איור 5A). הדגימות הוערכו מעת לעת, תוך שימוש באותן שיטות הדמיה וכמת כאמור לעיל. המספר הכולל של תאים חיים נותר עקבי (איור 5B) ואשכולות שמרו על כ-80%קיימות (איור 5C) לאורךחיי התרבות. צפיפות התא במצב לא נפרד היא בערך שליש מהמצב המופרד מכיוון שתאים בודדים חיים במהלך ספירת תאים, אך מתים במהירות בתוך ההידרוג'ל. יש גם שונות רבה יותר בגודל האשכול ללא הפרדת מעבר הצבע של צפיפות.
איור 1: לוח מיקרו-נוזל בר-נוזל דו-מסלולי. (A)צלחת מיקרו-נוזלים דו-מסלולית היא צלחת מיקרוטיטר סטנדרטית בעלת 384 בארות עם תחתית מותאמת המורכבת מערוצים מיקרו-נוזלים המשובצים בין צלחות זכוכית. כל צלחת מורכבת מ-96 שבבי רקמות לתרבות תאי תלת-מית. (ב)כפי שצופה מהקצה העליון של הצלחת, שבב מיקרו-נוזל יחיד בן 2 נתיבים מורכב מ-4 בארות ברצף המחוברות על ידי ערוץ הג'ל (אדום) וערוץ ההזבות (כחול); שקע הג'ל, פרץ התזת, חלון תצפית ושקע התזת. (ג)פריוהול מושגת בצלחת מיקרופלוידיק עם נדנדה ניתנת לתכנות המשתמשת בכוח המשיכה כדי להניע את המדיה בין פרץ פרץ בארות שקע שהם מאגרי מדיה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בידוד אשכול PDX. (א)לנתח רקמת PDX הראשי ולנתק לתוך מתלה תא יחיד המכיל שני תאי PCa אנושיים סטרומה גידול העכבר. או cryopreserve תערובת תאים דיסוציאציה או(ב)להוסיף לתרבות סיבוב כדי לבודד תאים סרטניים ולאפשר לתאי סטרומה עכבר לדבוק צלחת תרבות הרקמה (48 שעות). (ג)השתמש בצנטריפוגציה הדרגתית של צפיפות כדי להסיר שאריות תאים בודדים מתים, ו- (D) לאסוף אשכולות PDX קיימא בממשק בין שכבות הדרגתיות צפיפות 40% ו- 55% (תיבה מקווקות אדומה). (E)לשחזר אשכולות PDX, לתוסס מחדש בתמיסת מבשר הידרוג'ל, ולחלק על הלוח עם פיפטה חוזרת. (F) חישובים לדוגמה, התואמים לטבלה 1, מדגימים את מספרי התאים הראשוניים הדרושים כדי להגיע לריכוז תאים סופי רצוי עבור כל השבבים על-פני לוח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניטור טעינת לוחות מיקרו-נוזלים. טעינת הצלחה ושגיאות, ניתן להעריך על ידי עין (בתצוגות העליון והתחתון), עם אישור על ידי מיקרוסקופ. (A) טעינה מוצלחת מזוהה על-ידי נתיב פריתוך פתוח (בהיר) בתצוגות העליון והתחתון, ותיב ג'ל כהה מעט יותר בתצוגה התחתונה. הדמיה על ידי מיקרוסקופ מאשרת כי נתיב הג'ל היה מלא לחלוטין בתאים ומקדם ג'ל, מבלי לשפוך על לתוך הנתיב הסמוך. (ב)קריקטורה המדגימה מיקום נכון של קצה צינור במהלך חלוקת ג'ל, כאשר מיקום נכון נמצא ממש מעל יציאת החוף (משמאל) ומיקום שגוי אינו מרוכז (באמצע) או הפעלת כוח על יציאת החוף (מימין). (ג)נתיבים בהירים בכל התצוגות מצביעים על טעינה שלא נענתה, מה שמצביע על כך שקצה הצינור לא הונח כראוי בתוך פרץ הג'ל. (ד)מילוי חלקי של נתיב הג'ל (לא מלא עד הסוף) מזוהה על ידי החץ האדום, אשר מראה היכן חזית תמיסת הג'ל המתקדמת הופסקה, בין אם על ידי בועת אוויר לכודה, או הפסקה מוקדמת בטעינה. החץ האדום בתצוגת המיקרוסקופ מזהה את אותו מיקום. תכולתנתיבהג'ל עלה על גדותיו של PhaseGuide, נשפכה לתוך נתיב התזת ובסופו של דבר חסמה אותו. גלישה זו גלויה בתצוגה התחתונה על ידי המראה הכהה של נתיבי ג'ל וחליבות. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: כתמים בתאים והערכת יכולת הכדאיות בצלחת המיקרו-נוזלים. (א)באמצעות כתמי פלורסנט, הכדאיות הוערכה באשכולות תאי PCa לא נפרדים ומופרדים שנזרעו בצלחת המיקרו-נוזלים (כל הגרעינים: Hoechst 33342, כחול; תאים מתים: אתידיום הומודימר-1, אדום; ותאים חיים: calcein AM, ירוק). סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב)סה"כ תאים מתים היו כמות ביום 1 של התרבות ונפרד MDA-PCa-118b תרבויות PDX הפגינו ירידה משמעותית במספר התאים המתים. (ג)כימות גודל האשכול עבור PCa PDXs, בתרבויות מופרדות ולא נפרדות, הראה עלייה קלה אך אין הבדל משמעותי סטטיסטית. פסים ופות שגיאה בלוח ב' מייצגים את ממוצע ומצב התקן של 4 תמונות לכל תנאי (שני שבבים עם 2 תמונה/שבב). כוכבית (*) מייצגת הבדלים משמעותיים סטטיסטית (p < 0.05) בהשוואה למצב הלא נפרד באמצעות מבחן t של תלמיד. עבור התיבה ואת העלילה שפם בלוח C, סמל הצלב מציין את הממוצע, ואת הקו האופקי מייצג את החציון, של 4 תמונות לכל תנאי (2 שבבים עם 2 תמונה / שבב). התיבה מכילה 50% מהנתונים בעוד השפם משתרע עד קוטר האשכול המינימלי והמקסימום עבור כל תנאי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: אפיון של MDA-PCa-118b מופרדים בצלחת מיקרופלויד. (א)אשכולות תאים סרטניים מופרדים (משמאל) ובלתי נפרדים (מימין) של תאי PCa נזרעו בצלחת המיקרו-נוזלים ונוקבו עד שבעה ימים. תרבויות היו מוכתמות עם שלושה צבעים ספציפיים עבור כל הגרעין (Hoechst 33342, כחול), תאים מתים (אתידיום הומודימר-1, אדום), ותאים חיים (calcein AM, ירוק). סרגל קנה מידה = 50 μm. (B,C) כמות של מספר תאים וכדאיות תרבות מתמונות על פני שבוע אחד של תרבות בצפיפות זריעה של 8,000 תאים / μL. ברים ותיוות שגיאה מייצגים את הממוצע ואת סטיית תקן של ארבע תמונות לכל תנאי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| צפיפות התא הרצויה הסופית בשבב יחיד (תאים/μL) | נפח טעון לכל שבב (μL) | מספר שבבים על צלחת מיקרופלוידיק | מוטיפייה לנפח נוסף | איור 2C: מספר התאים המופרדים הנדרשים עבור לוח מיקרווול מלא (שלב 3.8) | מכפיל עבור אובדן תאים (הסרת סטרומה, מוות מתא) |
איור 2B: התחלת # של תאי PDX שונים עבור פרוטוקול (שלב 2.8) |
| 2,500 | 1.5 | 96 | 1.3 | 4.7E+05 | 3 | 1.4E+06 |
| 5,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 9.4E+05 | 3 | 2.8E+06 |
| 10,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 1.9E+06 | 3 | 5.7E+06 |
| 20,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 3.7E+06 | 3 | 1.1E+07 |
טבלה 1: חומר PDX ראשוני ואחרון משוער הנדרש לטעינת צלחת מיקרו-נוזלית אחת בעלת שני נתיבים.
איור משלים 1: פריסת צלחת מיקרו-נוזלית בעלת שני נתיבים. לאחר זריעת הלוח microfluidic, להקליט הצלחה טעינת שבב בודדים (מוצלח, טעינה שלא נענתה, לא מלא עד הסוף, או גלישה) באמצעות פריסת לוח שני נתיבים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה לעיבוד ולתחכות תאים סרטניים הנגזרים מ-PDX בתפוקה גבוהה, מערכת תרבות תלת-מית-מיומת. בעוד פרוטוקול זה מנצל רקמת PCa PDX, זה יעיל באותה מידה עבור גידולים אחרים נגזר אפיתל. מאפייני הגידול משתנים בין קווי PDX בודדים גם בתוך אותה רקמה של מקור (ערמונית, שד, וכו '). קווי PDX מסוימים PCa הם פיברוטיים יותר קשה לבודד תאים קיימא מ בעוד אחרים הם תאיים יותר. גודל הגידול ציין כאן יכול להיות מגוון בתוך הנחיות IACUC כדי לספק יותר רקמות עבור גידולים בתפוקה נמוכה במיוחד. בנוסף, ניתן לאסוף שברי גידול לאחר שלב 2.7, לעכל מחדש, ועם העיכול הראשוני כדי להגדיל את התשואה. זה מועיל במיוחד עבור גידולים חוץ תאיים יותר מטריצה כבדה. סיבובים נוספים של עיכול בעבר שני בדרך כלל לגרום לכדאיות נמוכה ותשואה נמוכה ולא מומלץ.
הטיהור של אוכלוסיות נגזר PDX, כדי להסיר תאים מתים / גוססים או מזהם תאים מארחים, הוא מועיל עבור תרבות 3D מורחבת כימות של התאים הסרטניים הרצויים. השלב הראשון של הטיהור המתואר כאן – תרבות השעיה בנפח גדול יחסית של מדיה יחד עם סיבוב XY במהירויות מתונות – מקדם 1) חילוץ סלקטיבי של תאים תלויי הדבקה גבוהה, בדרך כלל פיברובלסטים סטרום עכבר, ו 2) היווצרות של אגרגטים תאים כדי לספק מגע תא-תא בעד הישרדות. היעילות של חילוץ פיברובלסטים עכבר נגזר מארח במהלך 48 h XY סיבוב שלב הוא גבוה מאוד, כפי שמתואר פונג ואח'. PCa-פיברובלסט מכוון co-תרבויות הם בהחלט אפשרי, כפי שהראינו, אבל דורשים מטריצה מכוונת (כדי לתמוך הדבקה פיברובלסט למטריקס) חלק גדול יותר של פיברובלסטים. PDX מדי פעם, בדרך כלל אלה עם מאפיינים mesenchymal יותר, יהיה לדבוק בקלות רבה יותר משטחי תרבות רקמות במהלך שלב תרבות סיבוב 48 שעות. קווי PDX צריכים להיות במעקב צמוד בפעם הראשונה פרוטוקול זה מבוצע, ו immunostained עבור HNA, כדי לזהות את חלקם של תאים אנושיים באוכלוסיות דבק ולא דבק. תרבות שאינה רקמה מטופלים צלחות יש להשתמש להיווצרות אשכול עם אלה PDXs. תאי סטרומה עכבר עדיין לדבוק בסופו של דבר על פני השטח, אבל ההפרדה לא תהיה יעילה כמו.
בעקבות תרבות הסיבוב, supernatant המכיל את האוכלוסייה שאינה דבקה מעובד באמצעות שיטת צנטריפוגציה הדרגתית צפיפות המתוארת. ניתן לפשט את הפרוטוקול המדווח כאן כדי לא לכלול לפחות שלב צפיפות אחד (לדוגמה, באמצעות פתרונות 20%, 40% ו- 55% בלבד), אך יש להשתמש בכל הארבעה בעת יצירת שיטה זו עם כל PDX חדש. אשכולות רב-תאיים מופרדים בקלות מתאי אדם בשיטה זו, ושומרים במידה רבה על הפנוטיפ המקובץ באשכולות שלהם ומאפיינים אחרים. האוכלוסייה של תאים בודדים שנמחקו מייצגת (א) תאים שמתו/גוססים לפני שלב הסיבוב של 48 שעות, ולכן מעולם לא השתלבו באשכול, או (ב) תאים שנותרו בחיים לאחר סיבוב של 48 שעות, אך עדיין לא השתלבו באשכולות. חשוב לציין כי קבוצה (ב) עשויה לכלול תאים שחוקרים מסוימים מוצאים רצויים; לדוגמה, כמה דיווחים תיארו תרביות תאים ראשיים המכילים תאי גזע / צוצר מוקדם, או תאים עמידים לתרופות, אשר צפים בתוך supernatant כמו תאים בודדים דבקים גרוע מעלאוכלוסייה חסיד אחרת 10. רלוונטי מחקרי סרטן, במחזור תאים סרטניים (CTCs), תאים ייזום גידול (TICs), או סוגי תאים אחרים קידום גרורות דומים יכול להיות חלק מאוכלוסיית תא יחיד זה. לכן, חוקרים המשתמשים בפרוטוקול שלנו צריכים לנתח בזהירות את אוכלוסיית התאים הבודדים שהושלכו כדי להבטיח שכל התאים בעלי עניין לא אבדו. בידיים שלנו, הרוב המכריע של תאים בודדים אלה הם או חלק קטן של תאים סרטניים כי הם מתים / גוססים בשל פרוטוקול פירוק רקמות הראשוני, או פיברובלסטים מכרסמים שכבר ממשיכים דרך anoikis.
מומלץ מאוד לתרגל את הטכניקה של זריעת צלחת microfluidic עם תאים יקרים פחות כדי להבטיח הצלחה בעת עבודה עם חומר PDX מוגבל ויקר. שים לב למיקום הטיפים במהלך החלוקה, מכיוון שטכניקה לא תקינה עלולה לגרום לגלישה של 1) אם הלחץ מוחל במהלך הטעינה, או 2) ערוצים ריקים או מלאים חלקית אם הקצה אינו ממורכז מעל יציאת החירום. ג'לציה מוקדמת תגרום גם לערוצים לא להתמלא עד הסוף. אם זה קורה, להקטין את זמן ההמתנה בין תוספת של crosslinker PEGDA חלוקת פתרון הג'ל, או לעבוד עם aliquots קטן יותר של פתרון ג'ל בכל פעם. אמצעי האחסון המשמשים בפרוטוקול זה ממוטבים היטב להצלחה עם הידרוג'לים HA. שימוש בפתרונות צמיגיים יותר כגון Matrigel במערכת זו דורש עלייה בנפח חלוקת ~ 2 μL למילוי נכון של ערוצים microfluidic. שים לב גם כי הבחירה של 50 μL מותאים בשלב 4.3, הכנת ארבעה כדורי תא באותו שלב, ואת resspensions חוזר בשלב 4.10 הם מכוונים; למרות שהם מניבים יותר חומר מהנדרש, הם גם מספקים עודף חשבון כדי לתת דין וחשבון על הפסדים מהפיפטה החוזרת.
יש לצוין כי כל PDX עשוי להיות מורפולוגיה ייחודית התפלגות גודל בתוך מודל תרבות 3D זה. במובן אחד, זה צפוי, בשל מגוון של מחלות חולים, היסטוריית רקמות, פרמטרים מטריקס, וגורמים רבים אחרים. הערכה נרחבת של קווי סרטן הערמונית מרובים במטריגל הדגימה את הגיוון הפוטנציאלי הזה11. עם זאת, החוקרים עשויים להיות מופתעים למצוא וריאציה רחבה בפרמטרים לעיל. בכתב יד כהכנה, אנו מציגים מבט רחב על כמה PDXs על פלטפורמת תרבות זו; התאים שומרים על תגובה עקבית בתוך כל סוג PDX, אך יכולים להשתנות באופן משמעותי בין דגימות, וכתוצאה מכך אשכולות שהם, לדוגמה, גדולים עם צפיפות תאים גבוהה לכל אשכול, או קטנים יותר, עם חיבורים בין-תאיים רופפים יותר. ההתנהגות הספציפית של כל PDX צריכה להיות מוערכת על ידי חוקרים על פני ניסויים מרובים, כדי לאשר מורפולוגיה צפויה ואופיינית. חוקרים יכולים לצפות מדגימות לעקוב אחר ההתנהגויות הכלליות המתוארות בעיתון זה.
לסיכום, הפרוטוקול המוצג מציע לחוקרים שיטה חדשה להשתמש PDXs ex vivo בפלטפורמה המאפשרת כוונון עדין של תנאי תרבות והתאגדות של רמזים סביבתיים רלוונטיים 3D כגון מטריצה חוץ תאית ספציפית רקמה (ECM) וזרימת פריה, המאפשר הישרדות תאים מורחבת על פני מספר ימים או שבועות. אפיון מפורט של תרבויות אלה הושג על ידי הכתמים וניתוחים מורפולוגיים שהוצגו כאן. בנוסף, במידת הצורך, ניתן להגיש תרביות למאמרים מבוססי קוראי לוחות, תיוג חיסוני, או לשמש להכנת ליסנטים המאפשרים אפיון מולקולרי נוסף. למרות שפרסמנו בעבר כמה אלמנטים של תרבות PDX 3D בתוך הידרוג'לים, יישום זה של טיהור רב שלבי הוא חדש, קל להעסיק במעבדה סטנדרטית, והצליח לשמור על תרבויות ייצוגיות בכדאיות גבוהה. פלטפורמת OrganoPlate, בזני הדו-מסלוליים והשלושה נתיבים שלה, מציעה מורכבות נוספת באמצעות מודל התזת רקמות, והזדמנות מרכזית להשתמש אפילו פחות תאים לכל ניסוי. בהשוואה למודלים הקודמים שלנו, הפלטפורמה microfluidic הפחיתה את דרישות התא על ידי גורם של ~ 30, לכל ניסוי, שהוא יתרון עצום, בהתחשב בזמינות נדירה של רקמת גידול PDX ברוב המעבדות. המערכת המיקרו-נוזלית מאפשרת הדמיה מורחבת, חיסון והדמיה זמינה, על-פני אוכלוסיית תאים גדולה מספיק (n = כ-2,000-4,000 תאים לכל חלון הדמיה) כדי לאפשר כימות פנוטיפ בהקשר של ארגון מרחבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המכון הלאומי לסרטן SBIR שלב I (HHSN26120700015C) ו P01CA098912.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
