Summary
Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.
Abstract
Gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), generati quando il tessuto tumorale del paziente reinsediato viene innestato direttamente in topi immunocompromessi, rimangono biologicamente stabili, preservando così le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche, nonché l'eterogeneità del tumore originale. Tuttavia, l'uso di questi modelli per eseguire una moltitudine di esperimenti, incluso lo screening farmacologico, è proibitivo sia in termini di costi che di tempo. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono ampiamente visti come piattaforme in cui le cellule tumorali mantengono la loro integrità biologica attraverso interazioni biochimiche, morfologia e architettura. Il nostro team ha una vasta esperienza nella coltivazione di cellule PDX in vitro utilizzando matrici 3D composte da acido ialuronico (HA). Al fine di separare le cellule stromali dei fibroblasti di topo associate ai PDX, usiamo la coltura di rotazione, dove le cellule stromali aderiscono alla superficie delle placche trattate con coltura tissutale mentre le cellule tumorali PDX dissociate galleggiano e si associano in ammassi multicellulari. Fluttuanti anche nel supernatante sono singole, spesso cellule morte, che presentano una sfida nella raccolta di cluster PDX vitali per l'incapsulamento a valle in idrogel per la coltura cellulare 3D. Per separare queste singole cellule dagli ammassi di cellule vive, abbiamo impiegato la centrifugazione gradiente del passo di densità. Il protocollo qui descritto consente l'esaurimento di singole cellule non vitali dalla popolazione sana di cluster cellulari che saranno utilizzati per ulteriori sperimentazioni in vitro. Nei nostri studi, incorporiamo le colture 3D in piastre microfluidiche che consentono la perfusione dei supporti durante la coltura. Dopo aver valutato le colture risultanti utilizzando un saggio di vitalità fluorescente basato su immagini di cellule purificate rispetto a quelle non purificate, i nostri risultati mostrano che questo ulteriore passaggio di separazione ha ridotto sostanzialmente il numero di cellule non vitali dalle nostre colture.
Introduction
Nell'ultimo decennio, il campo della ricerca sul cancro ha dimostrato un rinnovato entusiasmo per gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) come strumento per valutare la dipendenza dal percorso delle cellule tumorali e la suscettibilità ai farmaci1. I modelli PDX più comuni sono stabiliti dall'impianto sottocutaneo o ortotopico delle cellule tumorali umane - un frammento tumorale, un ammasso di cellule dissociate derivate dal tumore o un campione di cellule tumorali circolanti isolate (CTC) - in un ospite di roditori. Se il tumore "take" ha successo, le cellule xenograft proliferano, vascolarizzano e altrimenti interagiscono con il tessuto ospite per creare un tumore, che può essere raccolto a una dimensione ottimale, suddiviso e reimpiantato in altri ospiti. Tra i loro numerosi vantaggi come sistema modello, i PDX in genere mantengono una parte sostanziale dell'eterogeneità della popolazione di cellule tumorali native e consentono la valutazione delle vie specifiche dell'uomo e delle rispostecellulari 2,,3. Il contesto in vivo consente l'interazione tumorale con la vascuola e altri stroma adiacenti e ricapitola caratteristiche tissutali come la dinamica di diffusione del farmaco, la tensione dell'ossigeno e l'influenza della matrice extracellulare che influenzano biologicamente e meccanicamente la progressione tumorale. Un aspetto negativo dei PDX è la loro dipendenza da un ospite di roditori, sia per l'espansione del tumore che, in ultima analisi, per il test delle ipotesi. Poiché molti PDX non possono adattarsi alla tradizionale coltura bidimensionale (2D) sul polistirolo di coltura tissutale senza perdere molte delle loro caratteristiche desiderabili, c'è stata una minima via di mezzo per i ricercatori tra questo metodo in vitro relativamente controllato e il significativo aumento delle spese, delle strutture e dei requisiti di tempo per l'uso in vivo di PDX.
Abbiamo descritto più modelli in vitro che implementano la coltura cellulare 3D all'interno di una matrice di supporto, e recentemente ampliato quel lavoro per dimostrare la coltura ex vivo di PDX derivati dal cancro alla prostata multipla (PCa), sia da soli che in co-coltura con fibroblasti derivati dal midolloosseo 4,,5. Le matrici idrogel a base di acido ialuronico (HA) forniscono un supporto personalizzabile e biologicamente rilevante per entrambi i tipi di cellule, con facile controllo sulle caratteristiche dell'idrogel e chiarezza ottica per l'imaging attraverso la profondità dell'idrogel6.
I tessuti tumorali PDX maturi comprendono una miscela variabile di cellule tumorali umane eterogenee e stroma del topo (fibroblasti, cellule endoteliali, ecc.). Per studiare i contributi specifici di tipo cellulare alla progressione tumorale in vitro, può essere vantaggioso dissociare i tumori, separare le popolazioni cellulari e incorporarle sperimentalmente in modo organizzato per sezionare percorsi di comunicazione intercellulare. Le popolazioni di cellule miste all'interno dei digestati tissutali hanno compatibilità differenziale con specifiche condizioni di coltura. Ad esempio, la vitalità dei fibroblasti associati al tumore richiede aderenza alla superficie o matrici 3D funzionalizzate con ligandi integrini, mentre le cellule PDX derivate dall'epiteliale in genere non hanno questi requisiti, favorendo invece le interazioni cellula-cellula. Queste differenze possono essere sfruttate per ottenere un'efficace separazione delle cellule PDX dalla contaminazione delle cellule stromali del topo. La coltura di rotazione dei digestati tissutali consente l'aderenza delle cellule stromali alla superficie di coltura tissutale mentre le aderenze cellulare-cellulari guidano le cellule PDX che galleggiano sopra la superficie di coltura rotante per formare ammassi multicellulari nel supernatante in 24−48 h. Le caratteristiche specifiche di questi ammassi variano con il PDX (ad esempio, ammassi grandi, stretti, altamente sferici o aggregati più piccoli e più sciolti simili a grappoli d'uva), ma sono tipicamente di dimensioni biologicamente rilevanti (50−250 μm di diametro), sufficienti per valutare le interazioni cellulari che si basano su contatti intercellulari.
Il recupero e l'elaborazione del tumore si trae inevitabilmente da un certo grado di morte cellulare collaterale, a causa di danni a breve termine dovuti a interruzioni meccaniche / enzimatiche o incompatibilità a lungo termine delle sottopopolazioni con le condizioni di coltura scelte. Nonostante l'utilità della coltura di rotazione come separazione iniziale di massa, le cellule morte o morenti vengono inevitabilmente trasferite con i cluster PDX e possono influenzare la coltura risultante. Queste cellule morte sono spesso singole cellule PDX che non sono state integrate in un ammasso, fibroblasti stromali del topo che non possono sopravvivere in condizioni di coltura selezionate, o cellule endoteliali particolarmente fragili. Tali cellule morenti possono influenzare i risultati sperimentali dei "sopravvissuti" e possono avere un impatto sostanziale sulla quantificazione, ad esempio attraverso test di screening di fattibilità fluorescenti basati su immagini. Per migliorare la selezione di cellule PDX vive da questo metodo, abbiamo adattato i metodi di centrifugazione con passaggi di densità per rimuovere facilmente singole cellule morte / morenti dalle miscele PDX e trattenere prevalentemente cluster multicellulari vivi.
Per migliorare lo studio dei cluster derivati da PDX risultanti in coltura 3D, abbiamo utilizzato una piattaforma di coltura perfusione basata sulla microfluidica, organoplate (Figura 1), che è una piattaforma organ-on-a-chip ad alta produttività che consente una coltura simultanea fino a 96 singole colture 3D perfuse su una base di piastre a microtitro a 384 pozzi(Figura 1A)7,8. Nella piastra microfluidica a 2 corsie, un singolo chip tissutale è collegato da due canali microfluidici(Figura 1B,canale gel: rosso, canale di perfusione: blu) che si estendono su quattro pozzi di fila. I due canali microfluidici sono separati da una breve cresta di plastica chiamata Phaseguide che impedisce l'overflow di un canale nel suo canale adiacente vicino, e allo stesso tempo consente un'interfaccia priva di membrana tra il contenuto del gel e il canale di perfusione9. Poiché il fondo della piastra microfluidico è composto da vetro di grado microscopio, le colture possono essere visualizzate nella finestra di osservazione attraverso il fondo della piastra con un microscopio standard o automatizzato. La perfusione è stabilita nella piastra microfluidica con un rocker programmabile, utilizzando la gravità per guidare i mezzi attraverso i canali microfluidici, tra i pozzi del serbatoio (Figura 1C). Il flusso di perfusione imita più da vicino il microambiente tumorale rispetto alla coltura statica, consentendo l'incorporazione dello stress da taglio e una maggiore distribuzione di gas e sostanze nutritive. I benefici del mantenimento di una coltura cellulare tumorale perfusa nella piastra microfluidica sono stati precedentemente descritti come colture perfuse di cancro al seno che mostravano una vitalità ottimale rispetto a una coltura 3D statica delle stessecellule 7.
Il presente rapporto descrive un metodo di centrifugazione del gradiente di densità adattato per isolare i cluster PDX multicellulari vivi e dimostra la sua utilità nella creazione di colture PDX 3D all'interno di piastre microfluidiche perfusabili. Poiché un numero crescente di laboratori di ricerca sta cercando metodi per facilitare l'uso del PDX, prevediamo che i protocolli qui presentati saranno di utilità immediata.
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Protocol
Il tessuto tumorale è stato ottenuto con il consenso del paziente e secondo un protocollo approvato dell'Institutional Review Board (IRB). Gli xenografti sono stati impiantati, coltivati e raccolti secondo un protocollo accettato institutional animal care and use committee (IACUC).
NOTA: Tutto il lavoro deve essere eseguito in un armadio di sicurezza biologico sterile per mantenere la sterilità. Tutti i passaggi devono essere condotti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
1. Preparazione dei materiali per la lavorazione PDX
- Impugnatura autoclave e manico bisturi o lamette da barba.
- Scongelare la soluzione enzimatica di dissociazione a 4 °C durante la notte o a temperatura ambiente lo stesso giorno della dissociazione tissutale.
NOTA: Lo scongelamento a 37 °C non è consigliato, in quanto ciò può inattivare alcuni enzimi di dissociazione. - Preparare almeno 100 mL di terreno di coltura PDX (miscela di nutrienti medi Eagle modificata di Dulbecco F-12 [DMEM-F12] con penicillina e streptomicina 100 U/mL e 30% siero bovino fetale [FBS]) e almeno 25 mL di mezzo di lavorazione PDX (DMEM-F12 con penicillina e streptomicina 100 U/mL e senza FBS). Conservare a 4 °C fino a quando non è pronto per l'uso.
2. Dissociazione PDX e purificazione iniziale della componente stromale
- Raccogliere utensili autoclavati, filtri cellulari da 70 μm (2−3), piatti di coltura tissutale rotonda da 60 mm (2), piastre di coltura tissutale a 6 pozzole, tubi sterili di centrifuga conica da 50 ml e soluzione salina sterile tamponata da fosfati (PBS). Coltura calda media a 37 °C e lasciare che la soluzione enzimatica di dissociazione venga a temperatura ambiente.
- Quando il tessuto PDX ha raggiunto un diametro di 1,0−1,5 cm in un ospite del topo, rimuovere chirurgicamente il tumore dal topo con mezzi standard (ad esempio, in anestesia accettata) e conservare sul ghiaccio in un tubo da 50 ml con mezzo di coltura PDX(Figura 2A). Elaborare il tessuto prontamente, attraverso i passaggi sottostanti, per massimizzare la vitalità cellulare, preferibilmente entro 1−2 ore dalla raccolta.
- Trasferire il tessuto tumorale in un tubo conico sterile pre-pesato da 50 ml. Risciacquare 6x con 30 mL di PBS sterile per rimuovere sangue e contaminanti. Rimuovere il più liquido possibile e pesare il tessuto tumorale.
- Trasferire il tessuto tumorale in un piatto rotondo di coltura tissutale da 60 mm e tritare in ~ 1 mm3 pezzi usando una lama di rasoio sterile o bisturi.
- Aggiungere 5 ml di mezzo di lavorazione PDX per raccogliere liquami tumorali e trasferirli in un nuovo tubo sterile da 50 ml. Risciacquare il piatto di coltura con altri 5 ml di mezzo di lavorazione PDX, quindi con soluzione enzimatica di dissociazione (tumore 10 mL / g, almeno 5 ml), aggiungendo tutti i risciacqui al tubo da 50 ml.
- Incubare 20 min a 37 °C con tremori delicati. Ruotare delicatamente il tubo a metà del tempo di incubazione.
- Pipetta su e giù delicatamente con una pipetta sierologica per rompere i grumi. Celle filtranti con filtro cellulare da 70 μm posizionate su un nuovo tubo sterile da 50 ml.
NOTA: Può essere necessario più di un colino. - Centrifuga a 200 x g per 5 min a celle a pellet. Rimuovere il supernatante e il resuspend in 2−3 mL di mezzo di coltura PDX. Contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato.
- Utilizzare la tabella 1 per stimare il numero richiesto di cellule dissociate derivate da PDX necessarie per ottenere la densità cellulare desiderata per chip.
NOTA: I valori della tabella 1 sono destinati ad essere un punto di partenza. I valori effettivi varieranno a causa della vitalità/cellularità dei tessuti e della perdita cellulare dovuta al congelamento / recupero. I tumori PDX sono individui anche all'interno di un dato tipo di cancro, quindi questi valori dovrebbero essere regolati empiricamente. - Del numero calcolato nel passaggio 2.9, piastra 1−2 x 106 cellule in 5 mL di mezzo di coltura PDX per pozzo di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzi. Incubare (37 °C, 5% CO2, 95% di umidità) per 48 ore con scuotimento delicato (50−55 giri/min) per promuovere la formazione di cluster(Figura 2B). Dopo che il cluster si è formato, procedere alla sezione 3 per la centrifugazione.
- Crioconservare le cellule PDX inutilizzate dalla dissociazione iniziale in FBS 50% + 40% DMEM-F12 + 10% di solfossido di dimetile (DMSO) o un mezzo di congelamento cellulare primario disponibile in commercio.
NOTA: Le cellule stromali del topo aderenti possono anche essere recuperate dalla superficie della piastra tissutale, se lo si desidera, risciacquando brevemente con il mezzo di coltura ed espandendosi con mezzi standard. - Per un uso successivo di cellule tumorali PDX crioconservate / stroma del topo, scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti. Contare e placcare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzole come descritto al passaggio 2.10 prima di procedere alla sezione 3. Aumentare il numero di cellule PDX di ~20% per adattarsi alle perdite di vitalità dovute alla crioconservazione.
3. Separazione basata sulla centrifugazione del gradiente di densità dei cluster derivati da PDX da singole celle
- Preparare 20 ml di soluzione gradiente di densità al 100% mescolando accuratamente 18 ml di soluzione di centrifugazione del gradiente di densità con 2 ml di soluzione salina bilanciata sterile da 10x Hanks (HBSS) in un tubo conico sterile da 50 ml. Crea soluzioni di gradiente di densità 10 mL ciascuna del 20%, 30%, 40% e 55% di densità diluendo questa soluzione al 100% con HBSS sterile 1x e mescolando bene.
NOTA: Questi volumi sono sufficienti per due gradienti da 15 mL che possono essere utilizzati per separare ~15 x 106 celle ciascuno. Se si separano meno di ~15 x 106 celle, il secondo gradiente deve essere usato come equilibrio per la centrifugazione. - Aggiungere 3 ml di soluzione gradiente di densità del 55% sul fondo di un tubo conico da 15 ml. Tenendo il tubo ad angolo, strato molto delicatamente 3 mL di soluzione gradiente di densità del 40% sopra lo strato del 55%, erogando lentamente il liquido sul lato angolato del tubo per evitare di mescolare gli strati. Ripetere con la soluzione gradiente di densità del 30%.
- Raccogliere il supernatante delle colture di rotazione PDX con una pipetta sierologica da 5 mL, risciacquando delicatamente la superficie della piastra. Centrifuga a 200 x g per 2 min a celle a pellet.
- Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 3 mL di soluzione gradiente di densità del 20% in base al numero di gradienti necessari per separare le celle. Sovrapporre con cura la soluzione gradiente di densità del 20% con le celle nella parte superiore dei gradienti. Se si utilizza un solo tubo sfumato per le celle, in cima al tubo gradiente di bilanciamento con una soluzione gradiente di densità del 20% priva di celle.
- Limitare i tubi e la centrifuga in una centrifuga del rotore a benna oscillante per 30 minuti a 4 °C, 2.000 x ge 0 freno.
- Dopo la centrifugazione, le frazioni saranno visibili (Figura 2C). Raccogliere 2−3 ml di frazioni in tubi freschi da 15 ml. Aggiungere 3−4 volumi di HBSS sterile 1x ad ogni frazione e invertire per mescolare accuratamente.
- Centrifuga a 1.000 x g per 3 min a celle a pellet. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 1−2 mL di mezzo di lavorazione PDX.
NOTA: I cluster di celle PDX vitali si trovano in genere all'interfaccia della soluzione gradiente di densità 40−55%(Figura 2D) con singole cellule morte/morenti che si accumulano all'interfaccia della soluzione gradiente di densità 20−40% per la maggior parte dei PDX testati. - Rimuovere una piccola aliquota rappresentativa (50−100 μL) per la ria dissociazione con un volume uguale di soluzione enzimatica di dissociazione per valutare il numero di cellule nella sospensione cellulare raggruppata. Contare le celle con un emocitometro o un contatore di celle automatizzato.
4. Preparazione dell'idrogel e semina delle piastre microfluidiche
- Ricostituire le soluzioni idrogel HA (HA modificato dal tiolo, HA-SH; diacrilato di glicole polietilenglicole tiolo-reattivo, PEGDA) secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 μL di HBSS a tutti i pozzi nelle colonne della finestra di osservazione (colonna 3, 7, 11, 15, 19, 23) di una piastra microfluidale a 2 corsie per mantenere l'umidità della coltura e le condizioni ottimali di imaging.
- Calcolare il volume della sospensione cellulare dalla sezione 3 necessaria per 50 μL di idrogel alla densità cellulare desiderata (cioè 5.000 cellule/μL). Per la semina di una piastra microfluidale, aliquotare il volume calcolato in ciascuno dei 4 tubi sterili di centrifuga da 1,5 ml.
NOTA: Gli idrogel ha un tempo fisso per la gelazione. Regolare il volume delle aliquote della soluzione di gel per l'efficienza dell'utente durante l'erogazione in caso di gelazione prematura. - Regolare il pH della soluzione HA-SH su 8.0 con 1 N NaOH immediatamente prima dell'uso. Eseguire una gelazione di prova mescolando 40 μL di HA-SH con 10 μL di PEGDA e monitorando la gelazione nel tempo. La gelazione inizia tipicamente 5−8 minuti dopo aver miscelato HA-SH con il reticolare PEGDA.
- Aliquote di sospensione delle celle di centrifuga per 2 min (200 x g,temperatura ambiente) a celle a pellet. Rimuovere con cura le cellule supernatanti e resuspend nel volume appropriato di HA-SH.
NOTA: L'idrogel finale è una soluzione HA-SH:PEGDA 4:1 (in volume), quindi le cellule devono essere rimospate in 40 μL di HA-SH per un volume finale di 50 μL. - Aggiungere 10 μL di PEGDA a un'aliquota di cellule in HA. Mescolare bene e attendere 1−3 min (a seconda del tempo di gelazione dal passo 4.4) prima di seminare la piastra microfluidico.
NOTA: Consentire la reazione di gelazione dell'inizio prima della semina aiuta a ridurre al minimo la sedimentazione cellulare. - Apporre una punta per l'erogazione di volumi da 1,5 μL a una pipetta ripetuta a canale singolo e caricare con celle in soluzione di idrogel HA. Ricordarsi di mantenere l'aliquota dell'idrogel ben miscelata per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
- Per seminare la piastra microfluidica, allineare la punta della pipetta perpendicolarmente alla piastra mentre si posiziona delicatamente la punta al centro dell'ingresso del gel (colonne 1, 5, 9, 13, 17, 21) per garantire il contatto ma nessuna pressione durante l'erogazione della soluzione di idrogel. Lavorando rapidamente per prevenire la solidificazione prematura dell'idrogel, erogare 1,5 μL di soluzione di gel in ogni ingresso di gel.
- Osservare lo stato di riempimento dei canali microfluidici visualizzando dalla parte superiore della piastra, dal fondo della piastra o al microscopio e valutare il carico, utilizzando la figura 3 come guida (caricamento riuscito nella figura 3A, guida al posizionamento del tubo nella figura 3B, caricamento mancato nella figura 3C, non riempito per terminare nella figura 3D, overflow nella figura 3E). Identificare eventuali regolazioni necessarie nella tecnica che possono migliorare il successo del riempimento per la prossima tornata di chip (vedere la discussione per i suggerimenti per la risoluzione dei problemi).
- Ripetere i passaggi 4.6−4.9 con le restanti 3 aliquote di cellule in soluzione HA. Invertire il piatto mentre si prepara l'aliquota successiva (~ 1 min).
NOTA: Il tempo di attesa di 1 minuto e l'inversione della piastra migliorano la distribuzione 3D delle cellule riducendo la sedimentazione cellulare man mano che si verifica la gelazione. - Dopo aver riempito tutti i trucioli, incubare la piastra a 37 °C in un'incubatrice umidificata fino al completamento della gelazione (~ 45 min).
- Utilizzando il manuale fornito, assicurarsi che il rocker perfusione sia installato nell'incubatore di coltura cellulare con le corrette impostazioni di perfusione (angolo di 14°, intervalli di 4 minuti).
- Aggiungere 50 μL di mezzo di coltura PDX a tutte le entrate medie (colonne 2, 6, 10, 14, 18, 22) e verificare se i canali sono stati riempiti correttamente capovolgendo la piastra. Toccare delicatamente la piastra contro una superficie per incoraggiare il liquido a riempire i canali microfluidici.
- Aggiungere 50 μL di DMEM-F12 (10% FBS) per tutte le uscite medie (colonna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Se nel canale di perfusione sono intrappolate bolle d'aria, rimuovere toccando delicatamente la piastra contro una superficie.
- Utilizzando un modulo di layout al microscopio e a piastre (Figura supplementare 1), registrare il successo del riempimento dei truciolo. Escludere i trucioli riempiti in modo improprio da ulteriori usi sperimentali.
- Posizionare la piastra su un rocker basculante impostato su un'inclinazione di 14 ° e un ciclo di 4 minuti per iniziare la perfusione. Sostituire il mezzo di coltura PDX ogni 2 giorni (prima 50 μL in ingresso, quindi 50 μL in uscita).
5. Colorazione cellulare, imaging e quantificazione delle immagini
- Preparare una soluzione di dosaggio di vitalità cellulare contenente tre coloranti fluorescenti (Hoechst 33342, etidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
- Preparare le soluzioni stock di ogni colorante come segue: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/mL) in acqua deionizzata; calceina AM a 4 mM in DMSO anidro; etidio omodimero-1 a 2 mM in DMSO/H2O (1:4, v/v).
NOTA: Le soluzioni stock calcein AM ed ethidium homodimer-1 sono fornite nel kit indicato in Table of Materials. - Preparare un'unica soluzione di lavoro in HBSS o fenolo senza rosso, contenente tutti e tre i coloranti. Ottimizzare la concentrazione di lavoro finale per ogni tipo di cella e matrice, all'interno degli intervalli di 1,6−8,0 μM per Hoechst 33342, 0,1−10 μM per la calceina AM e 0,1−10 μM per l'omodimero di etidio-1.
- Preparare le soluzioni stock di ogni colorante come segue: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/mL) in acqua deionizzata; calceina AM a 4 mM in DMSO anidro; etidio omodimero-1 a 2 mM in DMSO/H2O (1:4, v/v).
- Rimuovere il mezzo di coltura e applicare la soluzione di colorante di vitalità di lavoro ai trucioli microfluidici desiderati (75 μL in ingresso, 25 μL in uscita) e riposizionare sul rocker perfusione nell'incubatore di coltura cellulare per 1 h.
- Immagini le finestre di osservazione delle colture macchiate utilizzando un microscopio confocale manuale o automatizzato(Tabella dei materiali)con filtri fluorescenti (elencati come lunghezze d'onda di eccitazione/emissione, in nm) per osservare tutti i nuclei (Hoechst 33342, 350/461), nuclei cellulari morti (etidium homodimer-1, 528/617) e citoplasma cellulare vivo (calceina AM, 494/517).
- Cattura pile Z da 140 μm con una dimensione del passo di ≤1 μm usando un obiettivo di aria 20x. Sono necessari tre campi di visualizzazione per visualizzare l'intero microcanale con una piccola quantità di sovrapposizione. Per evitare il doppio campionamento, immagini solo due campi di visualizzazione per chip.
NOTA: Le condizioni di imaging devono essere ottimizzate per garantire un corretto campionamento NyQuist. Nell'esperienza degli autori, un sistema di imaging veloce, basato sulla deconvoluzione di una sorgente di epifluorescenza convenzionale o sulla modalità di scansione della risonanza su un confocale, è necessario per saggiare completamente una pila Z completa, con tre colori laser, su 96 chip su una piastra entro un ragionevole lasso di tempo (circa 3,5 ore con imaging automatico, inclusa la configurazione). - Utilizzando il software di analisi delle immagini, dite le immagini dello stack Z per i dati quantificati desiderati, come morfologia, stato di aggregazione o altre funzionalità. Per quantificare la vitalità delle cellule, contare il numero di globuli morti (rosso) e nuclei cellulari totali (blu).
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Representative Results
Un rocker perfusione programmabile è stato preparato in un incubatore standard di coltura cellulare jackato ad acqua e piastre microfluidiche a due corsie sono state preparate in un armadio standard di biosicurezza per il carico(figura 1). Un tumore PDX MDA-PCA-118b è stato espanso in vivo, raccolto quando aveva raggiunto una dimensione massima e dissociato come descritto nella sezione 2 del protocollo per creare una sospensione liquama delle cellule, a circa uno stato a singola cellula (Figura 2A). Il liquame è stato dispensato in piastre di coltura tissutale a 6 pozzi e posto su un rotatore XY come descritto, per 48 ore. Stroma del topo attaccato al fondo della piastra di coltura tissutale, come è stato descritto in precedenza, e le cellule PDX umane sono rimaste galleggianti nel mezzo, assemblate in grappoli (Figura 2B). Le singole celle non assali erano visibili anche in tutta la soluzione.
Un gradiente di densità del gradino è stato stabilito in un tubo di centrifuga utilizzando i metodi della sezione 3 del protocollo. La sospensione supernatante delle cellule PDX è stata aspirata delicatamente dalla piastra multiwell, caricata sul gradiente del gradino e centrifugata come descritto. Dopo la centrifugazione, una banda nebbiosa, contenente i cluster PDX, era visibile vicino all'interfaccia tra le frazioni 2 e 3, e singole celle sono state identificate all'interfaccia tra le frazioni 1 e 2 (Figura 2D). Le frazioni sono state raccolte come descritto, diluite ulteriormente in HBSS e centrifugate di nuovo per rimuovere la soluzione gradiente di densità. Il supernatante è stato aspirato e i pellet di cellule risultanti sono stati rimescolati nel mezzo di lavorazione PDX. Una piccola aliquota di ogni frazione elaborata è stata valutata al microscopio, per confermare che la frazione prevista conteneva cluster PDX e che la frazione separata conteneva principalmente singole cellule.
Le soluzioni di idrogel HA sono state ricostituita come descritto nella sezione 4 del protocollo e i cluster PDX sono stati rimostrati nella soluzione di idrogel. Le soluzioni PDX sono state caricate in trucioli sulla piastra microfluidico e valutate per un carico riuscito (Figura 3). Nella maggior parte dei casi, >90% dei chip sono stati caricati correttamente dopo qualche pratica con la tecnica e la regolazione dei volumi di caricamento. Dopo aver caricato il numero desiderato di trucioli e aver incubato per la gelazione come descritto, il mezzo di coltura PDX è stato aggiunto alla piastra microfluidica e la piastra è stata coltivata con perfusione.
Utilizzando coloranti fluorescenti e i metodi della sezione 5 del protocollo e microscopia confocale, la vitalità e la morfologia della coltura PDX microfluidiche 3D sono state valutate sia in condizioni separate che in condizioni separate da centrifugazione del gradiente di densità(figura 4A). Le immagini di queste lastre sono state registrate come z-stack al microscopio confocale e valutate per la fattibilità cellulare nel software di analisi delle immagini. Il primo giorno, le colture che hanno subito il metodo di separazione presentavano 10 volte meno singoli, globuli morti (rosso), rispetto alle colture non separate(figura 4B). È importante sottolineare che gli ammassi separati consistevano principalmente in cellule vive (verdi). Non è stata individuata alcuna differenza statisticamente significativa per la distribuzione delle dimensioni del cluster(figura 4C).
Le colture sono state ulteriormente mantenute nella piastra microfluidale per sette giorni(figura 5A). I campioni sono stati valutati periodicamente, utilizzando gli stessi metodi di imaging e quantificazione di cui sopra. Il numero totale di cellule vive è rimasto costante (figura 5B) e i cluster hanno mantenuto una vitalità di ~80% (figura 5C) per tutta la durata della coltura. La densità cellulare in condizioni non separate è circa un terzo della condizione separata perché le singole cellule sono vive durante il conteggio delle cellule, ma muoiono rapidamente all'interno dell'idrogel. C'è anche una maggiore variabilità nelle dimensioni dell'ammasso senza la separazione del gradiente di densità.
Figura 1: La piastra microfluidica perfusabile a 2 corsie. (A) La piastra microfluidica a 2 corsie è una piastra microtitere standard a 384 po' con fondo modificato costituito da canali microfluidici incastonati tra piastre di vetro. Ogni piastra è composta da 96 trucioli di tessuto per la coltura cellulare 3D. (B) Visto dalla parte superiore della piastra, un singolo chip microfluidico a 2 corsie è costituito da 4 pozzi di fila collegati dal canale gel (rosso) e dal canale di perfusione (blu); l'ingresso del gel, l'ingresso perfusione, la finestra di osservazione e l'uscita perfusione. (C) La perfusione si ottiene nella piastra microfluidica con un rocker programmabile che utilizza la gravità per guidare i mezzi tra i pozzi di ingresso e di uscita della perfusione che sono serbatoi di supporti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento del cluster PDX. (A) Sezionare il tessuto primario PDX e dissociarsi in una sospensione a singola cellula contenente sia cellule PCa umane che stroma tumorale del topo. O crioconservare la miscela cellulare dissociata o (B) aggiungere alla coltura di rotazione per reclustere le cellule tumorali e consentire alle cellule stromali del topo di aderire alla piastra di coltura tissutale (48 h). (C) Utilizzare la centrifugazione del gradiente di densità per rimuovere le singole celle morte residue e (D) raccogliere cluster PDX vitali nell'interfaccia tra strati gradiente di densità 40% e 55% (scatola tratteggiata rossa). (E) Recuperare i grappoli PDX, rimescolare in soluzione precursore dell'idrogel e erogare sulla piastra con una pipetta ripetuta. (F) I calcoli di esempio, corrispondenti alla tabella 1, dimostrano i numeri di cella iniziali necessari per raggiungere una concentrazione cellulare finale desiderata per tutti i trucioli su una piastra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Monitoraggio del carico delle lastre microfluidiche. Caricamento di successo ed errori, può essere valutato a occhio (nelle viste superiore e inferiore), con conferma al microscopio. (A) Il caricamento riuscito è identificato da una corsia di perfusione aperta (luminosa) nelle viste superiore e inferiore e da una corsia di gel leggermente più scura nella vista inferiore. La visualizzazione al microscopio conferma che la corsia di gel è stata riempita completamente con cellule e precursore del gel, senza riversarsi nella corsia adiacente. (B) Cartone animato che dimostra il corretto posizionamento della punta della pipetta durante l'erogazione del gel, con un posizionamento corretto appena sopra la porta di ingresso (sinistra) e un posizionamento errato fuori centro (al centro) o la forza di applicazione alla porta di ingresso (a destra). (C) Le corsie luminose in tutte le viste indicano un carico mancato, suggerendo che la punta della pipetta non sia stata posizionata correttamente all'interno dell'ingresso del gel. (D) Un riempimento parziale della corsia di gel (non riempito fino alla fine) è identificato dalla freccia rossa, che mostra dove il fronte della soluzione di gel in avanzamento è stato interrotto, da una bolla d'aria intrappolata o da una pausa prematura nel caricamento. La freccia rossa nella vista microscopio identifica la stessa posizione. (E) Il contenuto della corsia di gel traboccava della PhaseGuide, riversandosi nella corsia di perfusione e bloccandola. Questo overflow è visibile nella vista inferiore dall'aspetto scuro delle corsie gel e perfusione. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione cellulare e valutazione della vitalità nella piastra microfluidica. (A) Utilizzando macchie fluorescenti, la vitalità è stata valutata in grappoli di cellule PCa non separati e separati seminati nella piastra microfluidale (tutti i nuclei: Hoechst 33342, blu; cellule morte: omodimero di etidio-1, rosso e cellule vive: calceina AM, verde). Barra di scala = 50 μm. (B) Le cellule morte totali sono state quantificate il primo giorno della coltura e le colture PDX MDA-PCa-118b separate hanno dimostrato una significativa diminuzione del numero di cellule morte. (C) La quantificazione delle dimensioni dei cluster per i PCa PDX, in colture separate e non separate, ha mostrato un leggero aumento, ma nessuna differenza statisticamente significativa. Le barre e le barre di errore nel pannello B rappresentano la deviazione media e standard di 4 immagini per condizione (2 chip con 2 immagini/chip). L'asterisco (*) rappresenta differenze statisticamente significative (p < 0,05) rispetto alla condizione non epata che utilizza il test t di uno studente. Per il grafico a scatola e baffi nel pannello C, l'icona a croce indica la media, e la linea orizzontale rappresenta la mediana, di 4 immagini per condizione (2 chip con 2 immagine /chip). La scatola contiene il 50% dei dati mentre i baffi si estendono al diametro minimo e massimo del cluster per ogni condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Caratterizzazione di MDA-PCa-118b separati nella piastra microfluidale. (A) I cluster di cellule tumorali PCa separati (a sinistra) e non separati (a destra) sono stati seminati nella piastra microfluidale e perfusi per un massimo di sette giorni. Le colture erano macchiate da tre coloranti specifici per tutti i nuclei (Hoechst 33342, blu), cellule morte (etidium homodimer-1, rosso) e cellule vive (calceina AM, verde). Barra di scala = 50 μm. (B,C) Quantificazione del numero di cellule e vitalità della coltura dalle immagini in una settimana di coltura a una densità di semina di 8.000 cellule/μL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Densità cellulare finale desiderata in chip singolo (cellule/μL) | Volume caricato per chip (μL) | Numero di trucioli su piastra microfluidico | Mutiplier per volume extra | Figura 2C: Numero di celle separate necessarie per una piastra di microwell completa (fase 3.8) | Moltiplicatore per perdite cellulari (rimozione stroma, morte cellulare) |
Figura 2B: Numero iniziale di celle PDX dissociate per il protocollo (passaggio 2.8) |
| 2,500 | 1.5 | 96 | 1.3 | 4.7E+05 | 3 | 1.4E+06 |
| 5,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 9.4E+05 | 3 | 2.8E+06 |
| 10,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 1.9E+06 | 3 | 5.7E+06 |
| 20,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 3.7E+06 | 3 | 1.1E+07 |
Tabella 1: Materiale PDX iniziale e finale approssimativo necessario per caricare una singola piastra microfluidica a 2 corsie.
Figura supplementare 1: Il layout della piastra microfluidale a 2 corsie. Dopo aver seminato la piastra microfluidica, registrare il successo del caricamento del singolo chip (carico riuscito, mancato caricamento, non riempito fino alla fine o overflow) utilizzando il layout della piastra a 2 corsie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo un metodo per elaborare e coltivare cellule tumorali vitali derivate da PDX in un sistema di coltura 3D ad alta produttività e perfuso. Mentre questo protocollo utilizza tessuto PCa PDX, è ugualmente efficace per altri tumori derivati epiteliali. Le caratteristiche tumorali variano tra le singole linee PDX anche all'interno dello stesso tessuto di origine (prostata, seno, ecc.). Alcune linee PCa PDX sono più fibrotiche e difficili da isolare le cellule vitali mentre altre sono più cellulari. La dimensione tumorale qui notata può essere variata all'interno delle linee guida IACUC per fornire più tessuto per tumori particolarmente a basso rendimento. Inoltre, i frammenti tumorali possono essere raccolti dopo il passaggio 2.7, ri-digeriti e raggruppati con la digestione iniziale per aumentare la resa. Questo è particolarmente utile per tumori più extracellulari pesanti a matrice. Ulteriori cicli di digestione oltre i due in genere si traducono in bassa vitalità e bassa resa e non sono raccomandati.
La purificazione delle popolazioni derivate dalla PDX, per rimuovere le cellule morte / morenti o contaminare le cellule ospiti, è benefica per la coltura 3D estesa e la quantificazione delle cellule tumorali desiderate. Il primo passo della purificazione qui descritto - coltura di sospensione in un volume relativamente grande di mezzi insieme alla rotazione XY a velocità moderate - promuove 1) l'estrazione selettiva di cellule altamente dipendenti dall'adesione, tipicamente fibroblasti stromali del topo, e 2) la formazione di aggregati cellulari per fornire il contatto cellula-cellula pro-sopravvivenza. L'efficienza dell'estrazione di fibroblasti di topo derivati dall'ospite durante la fase di rotazione XY di 48 ore è molto elevata, come descritto in Fong etal. Le co-colture intenzionali di fibroblasti PCa sono certamente fattibili, come abbiamo dimostrato, ma richiedono una matrice sintonizzata (per supportare l'adesione dei fibroblasti alla matrice) e una maggiore proporzione di fibroblasti. L'occasionale PDX, di solito quelli con caratteristiche più mesenchimali, aderirà più facilmente alle superfici di coltura tissutale durante la fase di coltura di rotazione di 48 ore. Le linee PDX devono essere attentamente monitorate la prima volta che questo protocollo viene eseguito e immunosostinato per l'HNA, per identificare la proporzione di cellule umane nelle popolazioni aderenti e non aderenti. Le piastre trattate con coltura non tissutale devono essere utilizzate per la formazione di cluster con questi PDX. Le cellule stromali del topo aderirono comunque alla superficie, ma la separazione non sarà così efficiente.
Seguendo le impostazioni cultura di rotazione, il supernatante contenente la popolazione non aderente viene elaborato attraverso il metodo di centrifugazione del gradiente di densità descritto. Il protocollo qui riportato può essere semplificato per escludere almeno un passaggio di densità (ad esempio, utilizzando solo le soluzioni 20%, 40% e 55%), ma tutti e quattro dovrebbero essere utilizzati quando si stabilisce questo metodo con ogni nuovo PDX. I cluster multicellulari sono facilmente separati dalle singole cellule con questo metodo e mantengono in gran parte il loro fenotipo raggruppato e altre caratteristiche. La popolazione a singola cellula scartata rappresenta (a) cellule morte/morenti prima del passaggio di rotazione di 48 ore, e quindi mai integrate in un cluster, o (b) cellule che sono rimaste vive dopo la rotazione di 48 ore, ma che non si sono ancora integrate in cluster. È importante notare che il gruppo (b) può includere cellule che alcuni ricercatori ritengono desiderabili; ad esempio, alcuni rapporti hanno descritto colture cellulari primarie contenenti cellule staminali/progenitrici precoci, o cellule resistenti ai farmaci, che galleggiano all'interno di supernatanti come singole cellule scarsamente aderenti al di sopra di una popolazionealtrimenti aderente 10. Rilevante per studi sul cancro, cellule tumorali circolanti (CTC), cellule che avviano il tumore (TEC) o altri tipi di cellule simili che promuovono la metastasi potrebbero far parte di questa popolazione di cellule singole. Pertanto, gli investigatori che utilizzano il nostro protocollo dovrebbero analizzare attentamente la popolazione di singole cellule scartata per garantire che eventuali cellule di interesse non siano state perse. Nelle nostre mani, la stragrande maggioranza di queste singole cellule sono o una piccola frazione di cellule tumorali che sono morte / morenti a causa del protocollo iniziale di dissociazione dei tessuti, o fibroblasti di roditori che stanno già procedendo attraverso l'anoikis.
Si consiglia vivamente di praticare la tecnica di semina della piastra microfluidico con celle meno preziose per garantire il successo quando si lavora con materiale PDX limitato e prezioso. Tenere presente il posizionamento della punta durante l'erogazione, poiché è probabile che una tecnica impropria si traduca in 1) overflow se la pressione viene applicata durante il caricamento o 2) canali vuoti o parzialmente riempiti se la punta non è centrata sulla porta di ingresso. La gelazione prematura causerà anche il riempimento dei canali fino alla fine. In questo caso, ridurre il tempo di attesa tra l'aggiunta del retino PEGDA e l'erogazione della soluzione in gel, oppure lavorare con aliquote più piccole di soluzione di gel alla volta. I volumi di erogazione utilizzati in questo protocollo sono ben ottimizzati per il successo con gli idrogel HA. L'uso di soluzioni più viscose come Matrigel in questo sistema richiede un aumento del volume di erogazione a ~ 2 μL per un corretto riempimento dei canali microfluidici. Si noti inoltre che la scelta di incrementi di 50 μL nel passaggio 4.3, la preparazione di quattro pellet di cellule in questo stesso passaggio e le resopensioni ripetute nel passaggio 4.10 sono deliberate; sebbene producano più materiale del necessario, forniscono anche un'esage per tenere conto delle perdite dalla pipetta ripetuta.
Va notato che è probabile che ogni PDX abbia una morfologia e una distribuzione delle dimensioni uniche all'interno di questo modello di coltura 3D. In un certo senso, questo è previsto, a causa della diversità delle malattie del paziente, della storia dei tessuti, dei parametri della matrice e di molti altri fattori. Una valutazione espansiva di più linee di cancro alla prostata in Matrigel ha dimostrato questa potenzialediversità 11. Tuttavia, gli investigatori potrebbero essere sorpresi di trovare un'ampia variazione nei parametri di cui sopra. In un manoscritto in preparazione, presentiamo uno sguardo ampio a diversi PDX su questa piattaforma culturale; le celle mantengono una risposta coerente all'interno di ogni tipo PDX, ma possono variare sostanzialmente tra i campioni, con conseguente cluster che sono, ad esempio, grandi con alta densità cellulare per cluster, o più piccoli, con connessioni intercellulari più sciolte. Il comportamento specifico di ogni PDX deve essere valutato dagli investigatori su più prove, per confermare una morfologia prevedibile e caratteristica. Gli investigatori possono aspettarsi che i campioni seguano i comportamenti generali delineati in questo documento.
In sintesi, il protocollo presentato offre ai ricercatori un nuovo metodo per l'utilizzo di PDX ex vivo in una piattaforma che consente la messa a punto delle condizioni di coltura e l'incorporazione di segnali ambientali 3D pertinenti come la matrice extracellulare specifica del tessuto (ECM) e il flusso di perfusione, consentendo una maggiore sopravvivenza cellulare per diversi giorni o settimane. La caratterizzazione dettagliata di queste colture è stata ottenuta mediante la colorazione e le analisi morfologiche qui dimostrate. Inoltre, se necessario, le colture possono essere sottoposte a saggi basati su lettore di lastre, etichettatura immunofluorescente o utilizzate per la preparazione di lysati che consentano un'ulteriore caratterizzazione molecolare. Sebbene abbiamo pubblicato in precedenza alcuni elementi della coltura 3D PDX all'interno degli idrogel, questa applicazione della purificazione multistep è nuova, facile da impiegare in un laboratorio standard e riuscita a mantenere colture rappresentative ad alta vitalità. La piattaforma OrganoPlate, nelle sue varietà a 2 e 3 corsie, offre ulteriore complessità attraverso il suo modello di perfusione tissutale e un'opportunità chiave per utilizzare ancora meno cellule per esperimento. Rispetto ai nostri modelli precedenti, la piattaforma microfluidico ha ridotto il fabbisogno cellulare di un fattore di ~ 30, per esperimento, il che è un enorme vantaggio, data la scarsa disponibilità di tessuto tumorale PDX nella maggior parte dei laboratori. Il sistema microfluidico consente l'imaging esteso, l'immunostaining e l'imaging facile, attraverso una popolazione cellulare abbastanza grande (n = ~2.000−4.000 cellule per finestra di imaging) per consentire la quantificazione del fenotipo nel contesto dell'organizzazione spaziale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
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