Summary
Dieses Protokoll zeigt Methoden, um eine erweiterte In-vitro-Kultur von patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) zu ermöglichen. Ein Schritt verbessert die Gesamtlebensfähigkeit von mehrzelligen Clusterkulturen in 3D-Hydrogelen durch die einfache Entfernung nicht lebensfähiger Einzelzellen. Ein sekundärer Schritt veranschaulicht Best Practices für PDX-Kultur in einer durchsetzten mikrofluidischen Plattform.
Abstract
Patienten-abgeleitete Xenografts (PDX), die entstehen, wenn resektiertes Tumorgewebe des Patienten direkt in immungeschwächte Mäuse eingepfropft wird, bleiben biologisch stabil, wodurch molekulare, genetische und histologische Merkmale sowie Heterogenität des ursprünglichen Tumors erhalten bleiben. Die Verwendung dieser Modelle zur Durchführung einer Vielzahl von Experimenten, einschließlich des Drogenscreenings, ist jedoch sowohl in Bezug auf die Kosten als auch auf die Zeit unerschwinglich. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme werden weithin als Plattformen betrachtet, in denen Krebszellen ihre biologische Integrität durch biochemische Wechselwirkungen, Morphologie und Architektur behalten. Unser Team verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Kultivierung von PDX-Zellen in vitro mit 3D-Matrizen aus Hyaluronsäure (HA). Um mit PDXs assoziierte Maus-Fibroblasten-Stromalzellen zu trennen, verwenden wir Rotationskultur, bei der Stromalzellen an der Oberfläche von gewebekulturbehandelten Platten haften, während dissoziierte PDX-Tumorzellen schweben und sich selbst zu multizellulären Clustern verbinden. Ebenfalls im Überstand schweben einzelne, oft abgestorbene Zellen, die eine Herausforderung darstellen, lebensfähige PDX-Cluster für die nachgeschaltete Verkapselung in Hydrogele für die 3D-Zellkultur zu sammeln. Um diese Einzelzellen von lebenden Zellclustern zu trennen, haben wir die Zentrifuge des Dichteschrittgradienten eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erschöpfung nicht lebensfähiger Einzelzellen aus der gesunden Population von Zellclustern, die für weitere In-vitro-Experimente verwendet werden. In unseren Studien integrieren wir die 3D-Kulturen in mikrofluidische Platten, die eine Mediendurchblutung während der Kultur ermöglichen. Nach der Bewertung der resultierenden Kulturen unter Verwendung eines fluoreszierenden bildbasierten Lebensfähigkeits-Assays von gereinigten versus nicht gereinigten Zellen zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser zusätzliche Trennungsschritt die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen aus unseren Kulturen erheblich reduziert hat.
Introduction
In den letzten zehn Jahren hat der Bereich der Krebsforschung eine erneute Begeisterung für patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) als Instrument zur Beurteilung der Abhängigkeit von Krebszellsignalen und der Arzneimittelanfälligkeit1gezeigt. Die gängigsten PDX-Modelle werden durch subkutane oder orthotopische Implantation menschlicher Tumorzellen – ein Tumorfragment, ein Cluster dissoziierter Tumorzellen oder eine Probe isolierter zirkulierender Tumorzellen (CTCs) – in einen Nagetierwirt etabliert. Wenn der Tumor "nehmen" erfolgreich ist, vermehren sich die Xenograft-Zellen, vermehren sich und interagieren auf andere Weise mit dem Wirtsgewebe, um einen Tumor zu erzeugen, der in einer optimalen Größe geerntet, unterteilt und wieder in andere Wirte eingepflanzt werden kann. Unter ihren vielen Vorteilen als Modellsystem behalten PDXs in der Regel einen wesentlichen Teil der Heterogenität der nativen Tumorzellpopulation bei und ermöglichen die Beurteilung von humanspezifischen Bahnen und Zellreaktionen2,3. Der in vivo-Kontext ermöglicht die Tumorinteraktion mit vaskulaturundig und anderen angrenzenden Stroma und rekapituliert Gewebeeigenschaften wie Arzneimitteldiffusionsdynamik, Sauerstoffspannung und extrazelluläre Matrixbeeinflussen, die die Tumorprogression biologisch und mechanisch beeinflussen. Ein negativer Aspekt von PDXs ist ihre Abhängigkeit von einem Nagetier-Wirt, sowohl für die Tumorexpansion als auch letztlich für Hypothesentests. Da sich viele PDX nicht an die traditionelle zweidimensionale (2D) Kultur auf Gewebekultur-Polystyrol anpassen können, ohne viele ihrer wünschenswerten Eigenschaften zu verlieren, gibt es für Forscher einen minimalen Mittelweg zwischen dieser relativ kontrollierten In-vitro-Methode und dem signifikanten Anstieg der Kosten, Einrichtungen und Zeitanforderungen für die In-vivo-PDX-Nutzung.
Wir haben mehrere In-vitro-Modelle beschrieben, die 3D-Zellkultur innerhalb einer unterstützenden Matrix implementieren, und vor kurzem erweitert, dass arbeite, um die Ex-vivo-Kultur von multiplem Prostatakrebs (PCa)-abgeleiteten PDXs zu demonstrieren, sowohl allein als auch in Co-Kultur mit Knochenmark-abgeleiteten Fibroblasten4,5. Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogelmatrizen bieten anpassbare und biologisch relevante Unterstützung für beide Zelltypen, mit leichter Kontrolle über Hydrogeleigenschaften und optischer Klarheit für die Bildgebung durch die Hydrogeltiefe6.
Reife PDX-Tumorgewebe bestehen aus einer variablen Mischung aus heterogenen menschlichen Krebszellen und Mausstroma (Fibroblasten, Endothelzellen usw.). Um zelltypspezifische Beiträge zur Tumorprogression in vitro zu untersuchen, kann es vorteilhaft sein, Tumore zu dissoziieren, die Zellpopulationen zu trennen und experimentell in organisierter Weise zu integrieren, um Wege der interzellulären Kommunikation zu sezieren. Die gemischten Zellpopulationen in Gewebeverdauungen haben eine Differentialverträglichkeit mit bestimmten Kulturbedingungen. Beispielsweise erfordert die tumorassoziierte Fibroblasten-Lebensfähigkeit entweder die Oberflächenhaftung oder 3D-Matrizen, die mit Integrin-Liganden funktionalisiert sind, während epitheliale abgeleitete PDX-Zellen in der Regel nicht diese Anforderungen haben, sondern Zell-Zell-Wechselwirkungen bevorzugen. Diese Unterschiede können genutzt werden, um eine effektive Trennung von PDX-Zellen von kontaminierenden Mausstromalzellen zu erreichen. Die Rotationskultur von Gewebeverdauten ermöglicht die Anhaftung von Stromalzellen an der Gewebekulturoberfläche, während Zellzellverklebungen PDX-Zellen, die über der rotierenden Kulturoberfläche schweben, dazu bewegen, in 24 bis 48 h mehrzellige Cluster im Überstand zu bilden. Die spezifischen Eigenschaften dieser Cluster variieren mit dem PDX (z. B. große, enge, stark sphärische Cluster oder kleinere, lockerere Aggregate, die Traubentrauben ähneln), sind aber typischerweise biologisch relevant (Durchmesser 50 bis 250 m), ausreichend für die Beurteilung zellulärer Wechselwirkungen, die auf interzellulären Kontakten beruhen.
Tumor-Retrieval und -Verarbeitung führt unweigerlich zu einem gewissen Grad an Kollateralzelltod, entweder aufgrund kurzfristiger Schäden durch mechanische/enzymatische Störungen oder aufgrund langfristiger Inkompatibilität von Subpopulationen mit den gewählten Kulturbedingungen. Trotz der Nützlichkeit der Rotationskultur als anfängliche Massentrennung werden tot- oder sterbende Zellen unweigerlich mit den PDX-Clustern übertragen und können die resultierende Kultur beeinflussen. Bei diesen abgestorbenen Zellen handelt es sich oft um einzelne PDX-Zellen, die nicht in einen Cluster integriert waren, mausstromaler Fibroblasten, die unter ausgewählten Kulturbedingungen nicht überleben können, oder besonders fragile Endothelzellen. Solche sterbenden Zellen können experimentelle Ergebnisse von "Überlebenden" beeinflussen und die Quantifizierung wesentlich beeinflussen, z. B. durch fluoreszierende bildbasierte Durchführbarkeits-Screening-Assays. Um die Auswahl lebender PDX-Zellen aus dieser Methode zu verbessern, haben wir Zentrifugationsmethoden mit Dichteschritten angepasst, um einzelne abgestorbene/sterbende Zellen einfach aus PDX-Mischungen zu entfernen und überwiegend lebende mehrzellige Cluster zu behalten.
Um die Untersuchung von resultierenden PDX-abgeleiteten Clustern in der 3D-Kultur zu verbessern, haben wir eine mikrofluidics-basierte Perfusionskulturplattform verwendet, die OrganoPlate (Abbildung 1), die eine Hochdurchsatz-Organ-on-a-Chip-Plattform ist, die eine gleichzeitige Kultur von bis zu 96 einzelnen perfundierten 3D-Kulturen auf einer 384-well Mikrotiter-Plattenbasis ermöglicht (Abbildung 1A)7,8. In der 2-spurigen mikrofluidischen Platte wird ein einzelner Gewebechip durch zwei mikrofluidische Kanäle(Abbildung 1B, Gelkanal: rot, Perfusionskanal: blau) verbunden, die vier Brunnen hintereinander umfassen. Die beiden mikrofluidischen Kanäle sind durch einen kurzen Kunststoffrücken, den sogenannten Phaseguide, getrennt, der das Überlaufen eines Kanals in den angrenzenden Nachbarkanal verhindert und gleichzeitig eine membranfreie Schnittstelle zwischen dem Inhalt des Gels und dem Perfusionskanal9ermöglicht. Da der Boden der mikrofluidischen Platte aus mikroskopischem Glas besteht, können die Kulturen im Beobachtungsfenster durch den Boden der Platte mit einem Standard- oder automatisierten Mikroskop betrachtet werden. Perfusion wird in der mikrofluidischen Platte mit einer programmierbaren Wippe etabliert, mit Schwerkraft, um Medien durch die mikrofluidischen Kanäle zu treiben, zwischen Reservoirbrunnen (Abbildung 1C). Die Perfusions-Flow-Mimik rekapituliert die Tumormikroumgebung genauer als die statische Kultur, was die Einbeziehung von Scherspannung und eine verbesserte Verteilung von Gasen und Nährstoffen ermöglicht. Die Vorteile der Aufrechterhaltung einer durchbluteten Krebszellkultur in der mikrofluidischen Platte wurden zuvor als durchfundierte Brustkrebskulturen beschrieben, die eine optimale Lebensfähigkeit im Vergleich zu einer statischen 3D-Kultur der gleichen Zellen aufwiesen7.
Der vorliegende Bericht beschreibt eine angepasste Methode zur Zentrifugierung des Dichtegradienten zur Isolierung von lebenden mehrzelligen PDX-Clustern und demonstriert deren Nutzen bei der Etablierung von 3D-PDX-Kulturen innerhalb durchdringender mikrofluidischer Platten. Da immer mehr Forschungslaboratorien nach Methoden suchen, um die Verwendung von PDX zu erleichtern, gehen wir davon aus, dass die hier vorgestellten Protokolle sofort von Nutzen sein werden.
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Protocol
Tumorgewebe wurde mit Zustimmung des Patienten und gemäß einem genehmigten Institutional Review Board (IRB) Protokoll erhalten. Xenografts wurden gemäß einem akzeptierten Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) implantiert, angebaut und geerntet.
HINWEIS: Alle Arbeiten sind in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank durchzuführen, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
1. Herstellung von Materialien für die PDX-Verarbeitung
- Autoklavzangen und Skalpellgriff oder Rasierklingen.
- Enzymlösung bei 4 °C über Nacht oder bei Raumtemperatur am selben Tag wie Gewebedissoziation auftauen.
HINWEIS: Das Auftauen bei 37 °C ist nicht ratsam, da dies einige Dissoziationsenzyme inaktivieren kann. - Bereiten Sie mindestens 100 ml PDX-Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Mittelnährstoffgemisch F-12 [DMEM-F12] mit 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und 30% fetales Rinderserum [FBS]) und mindestens 25 ml PDX-Verarbeitungsmedium (DMEM-F12 mit 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und ohne FBS). Bei 4 °C lagern, bis sie einsatzbereit sind.
2. PDX-Dissoziation und Erstreinigung der Stromalkomponente
- Sammeln Sie autoklavierte Utensilien, 70 m Zellsiebe (2x3), 60 mm runde Gewebekulturschalen (2), 6-Well-Gewebekulturplatten, sterile 50 ml konische Zentrifugenröhren und sterile 1x phosphatgepufferte Kochchen (PBS). Wärmekultur medium bis 37 °C und ermöglichen Dissoziationsenzymlösung auf Raumtemperatur zu kommen.
- Wenn PDX-Gewebe in einem Mauswirt einen Durchmesser von 1,0 x 1,5 cm erreicht hat, entfernen Sie den Tumor mit Standardmitteln (z.B. unter akzeptierter Anästhesie) operativ von der Maus und lagern Sie auf Eis in einem 50 ml-Rohr mit PDX-Kulturmedium(Abbildung 2A). Verarbeiten Sie das Gewebe umgehend, über die folgenden Schritte, um die Zelllebensfähigkeit zu maximieren, vorzugsweise innerhalb von 1 x 2 h nach der Ernte.
- Übertragen Sie Tumorgewebe in ein vorgewogenes steriles 50 ml konisches Rohr. Spülen Sie 6x mit 30 ml sterilem PBS, um Blut und Verunreinigungen zu entfernen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und wiegen Sie das Tumorgewebe.
- Übertragen Sie Tumorgewebe in eine 60 mm runde Gewebekulturschale und hacken Sie mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell in 1 mm3 Stück.
- Fügen Sie 5 ml PDX-Verarbeitungsmedium hinzu, um Tumorschlämme zu sammeln und in ein neues steriles 50 ml-Rohr zu übertragen. Spülen Sie die Kulturschale mit weiteren 5 ml PDX-Verarbeitungsmedium, dann mit Dissoziationsenzymlösung (10 ml/g Tumor, mindestens 5 ml), wobei alle Spülungen in das 50 ml-Rohr hinzugefügt werden.
- 20 min bei 37 °C mit sanftem Schütteln bebrüten. Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig auf halbem Weg durch die Inkubationszeit.
- Pipette sanft mit einer serologischen Pipette auf und ab, um Klumpen aufzubrechen. Filterzellen mit einem 70 m Zellsieb, das über ein neues steriles 50 ml-Rohr gelegt wird.
HINWEIS: Es kann mehrere Sieb erforderlich sein. - Zentrifuge bei 200 x g für 5 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie überstand und resuspendieren in 2 x 3 ml PDX-Kulturmedium. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
- Verwenden Sie Tabelle 1, um die erforderliche Anzahl von dissoziierten PDX-abgeleiteten Zellen zu schätzen, die erforderlich sind, um die gewünschte Zelldichte pro Chip zu erreichen.
HINWEIS: Die Werte in Tabelle 1 sollen ein Ausgangspunkt sein. Die tatsächlichen Werte variieren aufgrund der Gewebelebensfähigkeit/Zelllichkeit und des Zellverlusts durch Einfrieren/Recovery. PDX-Tumoren sind Individuen sogar innerhalb eines bestimmten Krebstyps, daher sollten diese Werte empirisch angepasst werden. - Von der zahl berechnet in Schritt 2.9, Platte 1-2 x 106 Zellen in 5 ml PDX Kulturmedium pro Brunnen einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren (37 °C, 5%CO2,95% Luftfeuchtigkeit) für 48 h mit sanftem Schütteln (50-55 Rpm) zur Förderung der Clusterbildung(Abbildung 2B). Nachdem sich der Cluster gebildet hat, fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Zentrifugierung fort.
- Kryokonservieren Sie nicht verwendete PDX-Zellen aus der anfänglichen Dissoziation in 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einem kommerziell erhältlichen Primärzellgefriermedium.
HINWEIS: Anhaftende Mausstromalzellen können auf Wunsch auch von der Gewebeplattenoberfläche zurückgewonnen werden, indem sie kurz mit Kulturmedium spülen und sich standardmäßig ausdehnen. - Für die spätere Verwendung von kryokonservierten PDX-Tumorzellen/Mausstroma, Tauen Zellen in einem 37 °C Wasserbad für 2 min. Anzahl und Platte in einer 6-Well-Gewebekulturplatte, wie in Schritt 2.10 beschrieben, bevor sie zu Abschnitt 3 übergehen. Erhöhen Sie die Anzahl der PDX-Zellen um 20 %, um Lebensfähigkeitsverluste durch Kryokonservierung zu bewältigen.
3. Dichtegradientzentrifugationsbasierte Trennung von PDX-abgeleiteten Clustern von einzelnen Zellen
- Bereiten Sie 20 ml 100% Dichtegradientenlösung vor, indem Sie 18 ml Dichtegradientenzentrifugationslösung mit 2 ml steriler 10x Hanks' balanced salt solution (HBSS) in einem sterilen 50 ml konischen Rohr gründlich mischen. Machen Sie 10 ml von je 20%, 30%, 40% und 55% Dichte Gradientenlösungen, indem Sie diese 100% Lösung mit sterilen 1x HBSS verdünnen und gut mischen.
ANMERKUNG: Diese Volumina sind ausreichend für zwei 15 ml Gradienten, die verwendet werden können, um jeweils 15 x 106 Zellen zu trennen. Wenn weniger als 15 x 106 Zellen getrennt werden, sollte der zweite Gradient als Balance für die Zentrifugation verwendet werden. - Fügen Sie 3 ml mit 55% Dichtegradientenlösung an den Boden eines 15 ml konischen Rohres. Halten Sie das Rohr in einem Winkel, sehr vorsichtigSchicht 3 ml 40% Dichte Gradient lösung auf der Oberseite der 55% Schicht, langsam die Flüssigkeit auf die abgewinkelte Seite des Rohres, um das Mischen der Schichten zu vermeiden. Wiederholen Sie dies mit der 30%igen Gradientenlösung.
- Sammeln Sie den Überstand von PDX-Rotationskulturen mit einer 5 ml serologischen Pipette, die Plattenoberfläche sanft spült. Zentrifuge bei 200 x g für 2 min zu Pelletzellen.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 3 ml mit 20 % Dichtegradientenlösung entsprechend der Anzahl der Gradienten wieder auf, die zum Trennen der Zellen erforderlich sind. Schichtung einer 20%igen Dichtegradientenlösung mit Zellen auf der Oberseite des/der Gradienten(s). Wenn Sie nur ein Gradientenrohr für Zellen verwenden, überfordern Sie das BalanceGradientenrohr mit einer zellfreien 20%igen Dichtegradientenlösung.
- Kappen Sie die Rohre und zentrifugen in einer Schwenkschaufel-Rotorzentrifuge für 30 min bei 4 °C, 2.000 x gund 0 Bremse.
- Nach der Zentrifugation sind Brüche sichtbar (Abbildung 2C). Sammeln Sie 2 x 3 ml Fraktionen in frische 15 ml Rohre. Fügen Sie 3 x 4 Volumen sterilen 1x HBSS zu jeder Fraktion hinzu und invertieren Sie es gründlich.
- Zentrifuge bei 1.000 x g für 3 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 x 2 ml PDX-Verarbeitungsmedium wieder auf.
HINWEIS: Lebensfähige PDX-Zellcluster finden sich in der Regel an der 40-55%-Dichtegradientenlösungsschnittstelle (Abbildung 2D) mit einzelnen abgestorbenen/sterbenden Zellen, die sich bei den meisten getesteten PDXs an der 20-40%igen Dichtegradientenlösungsschnittstelle ansammeln. - Entfernen Sie ein kleines, repräsentatives Aliquot (50-100 L) zur wiederdissoziation mit einem gleichen Volumen der Dissoziationsenzymlösung, um die Zellzahl in der geclusterten Zellsuspension zu bewerten. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
4. Hydrogelzubereitung und mikrofluidische Plattenaussaat
- Rekonstituieren HA Hydrogel-Lösungen (thiol-modifizierte HA, HA-SH; Thiol-reaktives Polyethylenglykoldiakrylat, PEGDA) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Mit einer Mehrkanalpipette fügen Sie 50 L HBSS zu allen Brunnen in Beobachtungsfenstersäulen (Spalte 3, 7, 11, 15, 19, 23) einer 2-spurigen mikrofluidischen Platte hinzu, um die Kulturfeuchtigkeit und optimale Bildgebungsbedingungen aufrechtzuerhalten.
- Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension aus Abschnitt 3, der für 50 l Hydrogel bei der gewünschten Zelldichte benötigt wird (d. h. 5.000 Zellen/L). Für die Aussaat einer mikrofluidischen Platte wird das berechnete Volumen in jeweils 4 sterile 1,5 ml Zentrifugenrohre einfließen lassen.
HINWEIS: HA-Hydrogele haben eine feste Zeit bis zur Gelation. Passen Sie das Volumen der Gellösung aliquots für die Benutzereffizienz bei der Abgabe, wenn vorzeitige Gelation auftritt. - Stellen Sie den pH-Wert der HA-SH-Lösung unmittelbar vor der Anwendung auf 8,0 mit 1 N NaOH ein. Führen Sie eine Testgelation durch, indem Sie 40 l HA-SH mit 10 l PEGDA mischen und die Gelation im Laufe der Zeit überwachen. Die Gelation beginnt in der Regel 5-8 min nach dem Mischen von HA-SH mit dem PEGDA-Verklinker.
- Zentrifugenzellsuspension aliquots für 2 min (200 x g, Raumtemperatur) zu Pelletzellen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie die Zellen im entsprechenden Volumen von HA-SH wieder auf.
ANMERKUNG: Das Endhydrogel ist eine 4:1 HA-SH:PEGDA-Lösung (nach Volumen), so dass Zellen in 40 l HA-SH für ein Endvolumen von 50 l resuspendiert werden sollten. - Fügen Sie 10 L PEGDA zu einem Aliquot von Zellen in HA hinzu. Gut mischen und 1 bis 3 min (je nach Gelationszeit ab Schritt 4.4) abwarten, bevor sie die mikrofluidische Platte säen.
HINWEIS: Das Zulassen der Gelationsreaktion des Beginns vor der Aussaat hilft, die Zellabsetzung zu minimieren. - Befestigen Sie eine Spitze für die Abgabe von 1,5 L-Volumen auf eine einkanalige, sich wiederholende Pipette und Lastmitzellen mit Zellen in HA-Hydrogellösung. Denken Sie daran, das Hydrogel aliquot gut gemischt zu halten, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten.
- Um die mikrofluidische Platte auszusäen, richten Sie die Pipettespitze senkrecht zur Platte aus, während Sie die Spitze vorsichtig in die Mitte des Geleinlasses legen (Säulen 1, 5, 9, 13, 17, 21), um kontaktzufinden, aber keinen Druck bei der Abgabe der Hydrogellösung zu gewährleisten. Arbeiten Sie schnell, um eine vorzeitige Hydrogelerstarrung zu verhindern, geben Sie 1,5 l Gellösung in jeden Geleinlass.
- Beobachten Sie den Füllstatus der mikrofluidischen Kanäle, indem Sie von der Oberseite der Platte, unten der Platte oder durch das Mikroskop betrachten, und bewerten Sie die Belastung anhand von Abbildung 3 als Leitfaden (erfolgreiche Belastung in Abbildung 3A, Pipet-Positionierungsführung in Abbildung 3B, verpasste Belastung in Abbildung 3C, nicht gefüllt bis zum Ende in Abbildung 3D, Überlauf in Abbildung 3E). Identifizieren Sie alle erforderlichen Anpassungen in der Technik, die den Füllerfolg für die nächste Chipsrunde verbessern können (siehe Diskussion für Tipps zur Fehlerbehebung).
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.9 mit den verbleibenden 3 Aliquots von Zellen in HA-Lösung. Invertieren Sie die Platte während der Vorbereitung der nächsten Aliquot (ca. 1 min).
HINWEIS: Die 1 min Wartezeit und Die Umkehrung der Platte verbessern die 3D-Verteilung der Zellen, indem sie die Zellabsetzung reduzieren, wenn die Gelation auftritt. - Nachdem alle Chips gefüllt sind, inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator, bis die Gelation abgeschlossen ist (ca. 45 min).
- Stellen Sie mit dem mitgelieferten Handbuch sicher, dass die Perfusionswippe im Zellkultur-Inkubator mit den richtigen Perfusionseinstellungen (14° Winkel, 4 min Intervalle) installiert ist.
- Fügen Sie 50 L PDX-Kulturmedium zu allen mittleren Einlässen hinzu (Spalten 2, 6, 10, 14, 18, 22) und überprüfen Sie, ob die Kanäle ordnungsgemäß gefüllt sind, indem Sie die Platte umdrehen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte an einer Oberfläche, um die Flüssigkeit zu ermutigen, die mikrofluidischen Kanäle zu füllen.
- Fügen Sie 50 l DMEM-F12 (10% FBS) für alle mittleren Auslässe hinzu (Spalte 4, 8, 12, 16, 20, 24). Wenn Luftblasen im Perfusionskanal gefangen sind, entfernen Sie, indem Sie die Platte vorsichtig gegen eine Oberfläche tippen.
- Mit hilfe eines Mikroskops und Plattenlayout-Formular (Ergänzungsabbildung 1), Rekord Chip Füllung Erfolg. Nicht ordnungsgemäß gefüllte Chips von der weiteren experimentellen Verwendung ausschließen.
- Legen Sie die Platte auf eine Kippwippe, die auf eine Neigung von 14° und einen Zyklus von 4 min eingestellt ist, um mit der Durchblutung zu beginnen. Ersetzen Sie das PDX-Kulturmedium alle 2 Tage (zuerst 50 l im Einlass, dann 50 l im Ausgang).
5. Zellfärbung, Bildgebung und Bildquantifizierung
- Bereiten Sie eine Zelllebensfähigkeits-Assay-Lösung vor, die drei fluoreszierende Farbstoffe enthält (Hoechst 33342, Ethidium homodimer-1, Calceinacetoxymethyl [AM]).
- Bereiten Sie Die Lagerlösungen für jeden Farbstoff wie folgt vor: Hoechst 33342 bei 1,6 mM (1 mg/ml) in entionisiertem Wasser; Calcein AM bei 4 mM in wasserfreiem DMSO; ethidium homodimer-1 bei 2 mM in DMSO/H2 O(1:4, v/v).
HINWEIS: Die Lagercalcein AM und Ethidium homodimer-1 Lösungen sind in der angegebenen Kit in Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt. - Bereiten Sie eine einzige Arbeitslösung in HBSS oder phenolrot-freiem Medium vor, das alle drei Farbstoffe enthält. Optimieren Sie die Endarbeitskonzentration für jeden Zelltyp und jede Matrix im Bereich von 1,6 x 8,0 m für Hoechst 33342, 0,1 x 10 m für Calcein AM und 0,1 x 10 m für Ethidium homodimer-1.
- Bereiten Sie Die Lagerlösungen für jeden Farbstoff wie folgt vor: Hoechst 33342 bei 1,6 mM (1 mg/ml) in entionisiertem Wasser; Calcein AM bei 4 mM in wasserfreiem DMSO; ethidium homodimer-1 bei 2 mM in DMSO/H2 O(1:4, v/v).
- Entfernen Sie das Kulturmedium und wenden Sie die Schmelzbarkeits-Farbstofflösung auf die gewünschten mikrofluidischen Chips (75 l im Einlass, 25 l im Ausgang) an und legen Sie sie für 1 h wieder auf die Perfusionswippe im Zellkultur-Inkubator.
- Die Beobachtungsfenster der gebeizten Kulturen mit einem manuellen oder automatisierten konfokalen Mikroskop (Materialtabelle) mit Leuchtstofffiltern (gelistet als Anregungs-/Emissionswellenlängen, in nm) alle Kerne (Hoechst 33342, 350/461), tote Zellkerne (Ethidium homodimer-1, 528/617) und lebende Zellzytoplasma (Calcein AM, 494/517).
- Erfassen Sie 140-m-Z-Stacks mit einer Schrittgröße von ≤1 m mit einem 20-fachen Luftobjektiv. Drei Sichtfelder sind erforderlich, um den gesamten Mikrokanal mit einer kleinen Überlappung abzubilden. Um doppelstichprobenartig zu vermeiden, bildn enden nur zwei Sichtfelder pro Chip.
HINWEIS: Die Bildbedingungen sollten optimiert werden, um eine ordnungsgemäße NyQuist-Probenahme zu gewährleisten. Erfahrungsgemäß ist ein schnelles Bildgebungssystem, das entweder auf der Dekonvolution einer konventionellen Epifluoreszenzquelle oder auf dem Resonanzscanmodus auf einem Konfokal basiert, notwendig, um einen vollständigen Z-Stack mit drei Laserfarben über 96 Chips auf einer Platte innerhalb einer angemessenen Zeit (etwa 3,5 h mit automatisierter Bildgebung, einschließlich Setup) vollständig zu prüfen. - Mit Hilfe von Bildanalysesoftware können Sie die Z-Stack-Bilder für die gewünschten quantifizierten Daten wie Morphologie, Aggregationszustand oder andere Features testen. Um die Zelllebensfähigkeit zu quantifizieren, zählen Sie die Anzahl der abgestorbenen Zellen (rot) und der gesamten Zellkerne (blau).
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Representative Results
In einem Standard-Inkubator für wassergeknickte Zellkulturen wurde eine programmierbare Perfusionswippe und in einem Standard-Biosicherheitsschrank zweispurige mikrofluidische Platten für die Beladung vorbereitet (Abbildung 1). Ein MDA-PCA-118b PDX-Tumor wurde in vivo erweitert, geerntet, wenn er eine maximale Größe erreicht hatte, und sich wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben distanziert, um eine Güllesuspension von Zellen zu erzeugen, in etwa einem einzelzelligen Zustand(Abbildung 2A). Die Gülle wurde in 6-Well-Gewebekulturplatten abgegeben und wie beschrieben auf einen XY-Rotator gelegt, für 48 h. Mausstroma, die an der Unterseite der Gewebekulturplatte befestigt ist, wie zuvor beschrieben, und die menschlichen PDX-Zellen blieben im Medium schwebend, zu Clustern zusammengesetzt (Abbildung 2B). Unmontierte Einzelzellen waren auch in der gesamten Lösung sichtbar.
In einem Zentrifugenrohr wurde ein Schrittdichtegradient mit den Methoden im Protokollabschnitt 3 ermittelt. Die überstande Suspension von PDX-Zellen wurde sanft von der Multiwell-Platte angesaugt, auf den Schrittgradienten geladen und wie beschrieben zentrifugiert. Nach der Zentrifugation war ein trübes Band, das die PDX-Cluster enthielt, in der Nähe der Schnittstelle zwischen den Brüchen 2 und 3 sichtbar, und einzelne Zellen wurden an der Schnittstelle zwischen den Brüchen 1 und 2 identifiziert (Abbildung 2D). Die Fraktionen wurden wie beschrieben gesammelt, in HBSS weiter verdünnt und wieder zentrifugiert, um die Dichtegradientenlösung zu entfernen. Der Überstand wurde angesaugt, und die resultierenden Zellpellets wurden im PDX-Verarbeitungsmedium resuspendiert. Ein kleiner Aliquot jeder verarbeiteten Fraktion wurde mit dem Mikroskop bewertet, um zu bestätigen, dass der erwartete Anteil EINEN PDX-Cluster enthielt und dass der separate Anteil hauptsächlich einzelne Zellen enthielt.
HA-Hydrogellösungen wurden wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben rekonstituiert und PDX-Cluster in der Hydrogellösung resuspendiert. PDX-Lösungen wurden in Chips auf der mikrofluidischen Platte geladen und auf eine erfolgreiche Beladung geprüft (Abbildung 3). In den meisten Fällen wurden >90% der Chips nach einiger Übung mit der Technik und Der Anpassung der Ladevolumina erfolgreich geladen. Nach dem Laden der gewünschten Anzahl von Chips und der Bebrütetierung für die Gelation, wie beschrieben, PDX Kulturmedium wurde auf die mikrofluidische Platte hinzugefügt, und die Platte wurde mit Perfusion kultiviert.
Mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen und den Methoden in Protokollabschnitt 5 und konfokaler Mikroskopie wurden die Lebensfähigkeit und Morphologie der 3D-Mikrofluidien-PDX-Kultur sowohl in ungetrennten als auch in dichtegradienten zentrifugationsgetrennten Bedingungen bewertet (Abbildung 4A). Bilder dieser Platten wurden als Z-Stacks auf dem konfokalen Mikroskop aufgezeichnet und in Bildanalysesoftware auf Zelllebensfähigkeit untersucht. Am ersten Tag zeigten die Kulturen, die der Trennungsmethode unterzogen wurden, zehnfach weniger einzelne, abgestorbene Zellen (rot) im Vergleich zu nicht getrennten Kulturen (Abbildung 4B). Wichtig ist, dass die getrennten Cluster hauptsächlich aus lebenden Zellen (grün) bestanden. Für die Clustergrößenverteilung wurde kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt (Abbildung 4C).
Die Kulturen wurden sieben Tage lang in der mikrofluidischen Platte gepflegt (Abbildung 5A). Die Proben wurden regelmäßig mit den gleichen Bildgebungs- und Quantifizierungsmethoden wie oben bewertet. Die Gesamtzahl der lebenden Zellen blieb konsistent (Abbildung 5B) und die Cluster behielten über die gesamte Lebensdauer der Kultur eine Lebensfähigkeit von 80 % bei (Abbildung 5C). Die Zelldichte im nicht getrennten Zustand beträgt etwa ein Drittel des abgetrennten Zustands, da einzelne Zellen während der Zellzählung am Leben sind, aber schnell im Hydrogel absterben. Es gibt auch mehr Variabilität in der Clustergröße ohne die Dichtegradiententrennung.
Abbildung 1: Die 2-spurige perfusable mikrofluidische Platte. (A) Die 2-spurige mikrofluidische Platte ist eine standardmäßige 384-Well-Mikrotiterplatte mit einem modifizierten Boden, der aus mikrofluidischen Kanälen besteht, die zwischen Glasplatten eingebettet sind. Jede Platte besteht aus 96 Gewebechips für die 3D-Zellkultur. (B) Von oben auf der Platte betrachtet, besteht ein einziger 2-spuriger mikrofluidischer Chip aus 4 Bohrbrunnen in einer Reihe, die durch den Gelkanal (rot) und den Perfusionskanal (blau) verbunden sind; der Geleinlass, der Perfusionseinlass, das Beobachtungsfenster und der Perfusionsauslass. (C) Perfusion wird in der mikrofluidischen Platte mit einer programmierbaren Wippe erreicht, die die Schwerkraft verwendet, um Medien zwischen Perfusionseinlass und Auslassbrunnen zu treiben, die Medienbehälter sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: PDX-Clusterisolation. (A) Sezieren Sie primäres PDX-Gewebe und dissoziieren Sie sich in eine einzellige Suspension, die sowohl menschliche PCa-Zellen als auch Maustumorstroma enthält. Entweder kryopreserve dissoziierte Zellmischung oder (B) zur Rotationskultur hinzufügen, um Tumorzellen neu zu bündeln und ermöglichen Maus stromal Zellen an der Gewebekulturplatte haften (48 h). (C) Verwenden Sie dichte Gradientzentrifugation, um restliche abgestorbene Einzelzellen zu entfernen, und (D) sammeln Sie lebensfähige PDX-Cluster an der Schnittstelle zwischen dichtegradientenschichten 40% und 55% (rot gestricheltes Feld). (E) PDX-Cluster wiederherstellen, in Hydrogel-Vorläuferlösung wieder aufsetzen und mit einer sich wiederholenden Pipette auf die Platte geben. (F) Beispielberechnungen, die Tabelle 1entsprechen, zeigen die erforderlichen Anfangszellennummern, die erforderlich sind, um eine endgültige gewünschte Zellkonzentration für alle Späne über eine Platte zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Überwachung der Belastung mikrofluidischer Platten. Das Laden von Erfolg und Fehlern kann mit einem Auge (in der oberen und unteren Ansicht) mit Bestätigung durch Mikroskop beurteilt werden. (A) Erfolgreiches Laden wird durch eine offene (helle) Perfusionsspur in der oberen und unteren Ansicht und eine etwas dunklere Gelspur in der unteren Ansicht identifiziert. Die Visualisierung per Mikroskop bestätigt, dass die Gelspur vollständig mit Zellen und Gelvorläufer gefüllt war, ohne in die angrenzende Spur zu überschwappen. (B) Cartoon, der die korrekte Pipettenspitzenplatzierung während der Geldosierung demonstriert, wobei die korrekte Platzierung direkt über dem Einlassanschluss (links) liegt und die falsche Platzierung zentriert ist (Mitte) oder Kraft auf den Einlassanschluss (rechts) angewendet wird. (C) Helle Bahnen in allen Ansichten deuten auf eine verpasste Belastung hin, was darauf hindeutet, dass die Pipettenspitze nicht korrekt innerhalb des Geleinlasses platziert wurde. (D) Eine teilweise Füllung der Gelspur (nicht bis zum Ende gefüllt) wird durch den roten Pfeil identifiziert, der anzeigt, wo die vorrückende Gellösung vorne unterbrochen wurde, entweder durch eine eingeschlossene Luftblase oder eine vorzeitige Belastungspause. Der rote Pfeil in der Mikroskopansicht identifiziert die gleiche Position. (E) Der Inhalt der Gelspur überlief den PhaseGuide, verschüttete in die Perfusionsspur und blockierte ihn schließlich. Dieser Überlauf ist in der unteren Ansicht durch das dunkle Erscheinungsbild von Gel- und Perfusionsspuren sichtbar. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zellfärbung und Verträglichkeitsprüfung in der mikrofluidischen Platte. (A) Anhand fluoreszierender Flecken wurde die Lebensfähigkeit in nicht getrennten und getrennten PCa-Zellclustern bewertet, die in der mikrofluidischen Platte ausgesät sind (alle Kerne: Hoechst 33342, blau; abgestorbene Zellen: Ethidium homodimer-1, rot; und lebende Zellen: calcein AM, grün). Skala bar = 50 m. (B) Insgesamt wurden abgestorbene Zellen am ersten Tag der Kultur quantifiziert und getrennte MDA-PCa-118b PDX-Kulturen zeigten eine signifikante Abnahme der Anzahl abgestorbener Zellen. (C) Die Quantifizierung der Clustergröße für PCa PDXs in getrennten und nicht getrennten Kulturen zeigte einen leichten Anstieg, aber keinen statistisch signifikanten Unterschied. Balken und Fehlerbalken in Panel B stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von 4 Bildern pro Zustand (2 Chips mit 2 Bild/Chip) dar. Sternchen (*) stellt statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) im Vergleich zur nicht getrennten Bedingung dar, die im T-Test eines Schülers verwendet wird. Für das Box- und Whisker-Plot im Panel C zeigt das Kreuzsymbol den Mittelwert an, und die horizontale Linie stellt den Median von 4 Bildern pro Bedingung (2 Chips mit 2 Bildern/Chip) dar. Die Box enthält 50 % der Daten, während sich die Schnurrhaare auf den minimalen und maximalen Clusterdurchmesser für jede Bedingung erstrecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Charakterisierung des getrennten MDA-PCa-118b in der mikrofluidischen Platte. (A) Getrennte (links) und ungetrennte (rechte) PCa-Krebszellcluster wurden in der mikrofluidischen Platte ausgesät und bis zu sieben Tage lang durchblutet. Kulturen wurden mit drei Farbstoffen gefärbt, die für alle Kerne (Hoechst 33342, blau), abgestorbene Zellen (Ethidium homodimer-1, rot) und lebende Zellen (Calcein AM, grün) spezifisch sind. Skala bar = 50 m . (B,C) Quantitation der Anzahl der Zellen und Kulturlebensfähigkeit von Bildern über eine Woche Kultur bei einer Saatdichte von 8.000 Zellen/ l. Balken und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von vier Bildern pro Bedingung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Endgültige gewünschte Zelldichte im Einzelchip (Zellen/L) | Pro Chip geladenes Volumen (L) | Anzahl der Chips auf mikrofluidischer Platte | Mutiplier für zusätzliches Volumen | Abbildung 2C: Anzahl der getrennten Zellen, die für eine vollständige Mikrowellplatte erforderlich sind (Schritt 3.8) | Multiplikator für Zellverluste (Stroma-Entfernung, Zelltod) |
Abbildung 2B: Starten von dissoziierten PDX-Zellen für Protokoll (Schritt 2.8) |
| 2,500 | 1.5 | 96 | 1.3 | 4.7E+05 | 3 | 1.4E+06 |
| 5,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 9.4E+05 | 3 | 2.8E+06 |
| 10,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 1.9E+06 | 3 | 5.7E+06 |
| 20,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 3.7E+06 | 3 | 1.1E+07 |
Tabelle 1: Ungefähres anfangses und endgültiges PDX-Material, das zum Laden einer einzigen 2-spurigen mikrofluidischen Platte erforderlich ist.
Ergänzende Abbildung 1: Das 2-spurige mikrofluidische Plattenlayout. Zeichnen Sie nach dem Aussaat der mikrofluidischen Platte den individuellen Spanladeerfolg (erfolgreich, verpasste Beladung, nicht bis zum Ende gefüllt oder überlaufen) mit dem 2-spurigen Plattenlayout auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Verarbeitung und Kultivierung lebensfähiger PDX-abgeleiteter Tumorzellen in einem durchdrungenen 3D-Kultursystem mit hohem Durchsatz. Während dieses Protokoll PCa PDX Gewebe verwendet, Es ist ebenso wirksam für andere epitheliale-abgeleitete Tumoren. Die Tumoreigenschaften variieren zwischen den einzelnen PDX-Linien sogar innerhalb desselben Ursprungsgewebes (Prostata, Brust usw.). Einige PCa PDX-Linien sind eher fibrotisch und schwierig, lebensfähige Zellen zu isolieren, während andere zellularer sind. Die hier festgestellte Tumorgröße kann innerhalb der IACUC-Richtlinien variiert werden, um mehr Gewebe für besonders ertragsarme Tumoren bereitzustellen. Zusätzlich können Tumorfragmente nach Schritt 2.7 gesammelt, wieder verdaut und mit der ersten Verdauung gebündelt werden, um die Ausbeute zu erhöhen. Dies ist besonders hilfreich für mehr extrazelluläre Matrix-schwere Tumoren. Zusätzliche Verdauungsrunden nach zwei führen in der Regel zu geringer Lebensfähigkeit und geringer Ausbeute und werden nicht empfohlen.
Die Reinigung von PDX-abgeleiteten Populationen, um abgestorbene/sterbende Zellen zu entfernen oder Wirtszellen zu kontaminieren, ist vorteilhaft für die erweiterte 3D-Kultur und Quantifizierung der gewünschten Krebszellen. Der erste Schritt der hier beschriebenen Reinigung – Suspensionskultur in einem relativ großen Medienvolumen zusammen mit XY-Rotation bei moderaten Geschwindigkeiten – fördert 1) die selektive Extraktion von stark adhäsionabhängigen Zellen, typischerweise mausstromalen Fibroblasten, und 2) die Bildung von Zellaggregaten zur Versorgung von Pro-Survival-Zell-Zellkontakten. Die Effizienz der Extraktion von von Hosts abgeleiteten Maus-Fibroblasten während des 48 h XY-Rotationsschritts ist sehr hoch, wie in Fong et al.5beschrieben. Absichtliche PCa-Fibroblasten-Kokulturen sind sicherlich machbar, wie wir gezeigt haben, erfordern aber eine abgestimmte Matrix (zur Unterstützung der Fibroblastenhaftung auf Matrix) und einen größeren Anteil an Fibroblasten. Die gelegentliche PDX, in der Regel diejenigen mit mehr mesenchymalen Eigenschaften, wird leichter auf GewebekulturOberflächen während der 48-Stunden-Rotationskultur Schritt haften. PDX-Linien sollten genau überwacht werden, wenn dieses Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird, und immunstainiert für HNA, um den Anteil der menschlichen Zellen in den anhaftenden und nicht-anhaftenden Populationen zu identifizieren. Nicht-Gewebekultur behandelte Platten sollten für die Clusterbildung mit diesen PDXs verwendet werden. Mausstromalzellen haften immer noch irgendwann an der Oberfläche, aber die Trennung wird nicht so effizient sein.
Nach der Rotationskultur wird der Überstand, der die nicht anhantibe Population enthält, durch die beschriebene Dichtegradientenzentrifugationsmethode verarbeitet. Das hier beschriebene Protokoll kann vereinfacht werden, um mindestens einen Dichteschritt auszuschließen (z. B. mit nur den Lösungen 20%, 40% und 55%), aber alle vier sollten bei der Festlegung dieser Methode mit jedem neuen PDX verwendet werden. Multizelluläre Cluster lassen sich durch diese Methode leicht von einzelnen Zellen trennen und behalten weitgehend ihren gruppierten Phänotyp und andere Merkmale bei. Die verworfene einzellige Population stellt entweder (a) Zellen dar, die vor dem 48-h-Rotationsschritt tot/sterbend waren und daher nie in einen Cluster integriert wurden, oder (b) Zellen, die nach der 48-Stunden-Drehung am Leben blieben, sich aber immer noch nicht in Cluster integriert enden. Es ist wichtig zu beachten, dass Gruppe (b) Zellen enthalten kann, die einige Forscher für wünschenswert halten; z.B. haben einige Berichte primäre Zellkulturen beschrieben, die frühe Stamm-/Vorläuferzellen oder medikamentenresistente Zellen enthalten, die innerhalb des Überstandes als schlecht anhaftende Einzelzellen über einer ansonsten haftenden Population10schweben. Relevant für Krebsstudien könnten zirkulierende Tumorzellen (CTCs), Tumor-initiierende Zellen (TICs) oder andere ähnliche metastasierende Zelltypen Teil dieser Einzelzellpopulation sein. Daher sollten Die Ermittler, die unser Protokoll verwenden, die ausrangierte Einzelzellpopulation sorgfältig analysieren, um sicherzustellen, dass keine von Interesse interessierten Zellen verloren gegangen sind. In unseren Händen sind die überwiegenden Meisten dieser Einzelzellen entweder ein kleiner Bruchteil der Krebszellen, die aufgrund des anfänglichen Gewebedissoziationsprotokolls tot/sterben, oder Nagetier-Fibroblasten, die bereits durch Anoikis vorankommen.
Es wird dringend empfohlen, die Technik der Aussaat der mikrofluidischen Platte mit weniger wertvollen Zellen zu üben, um den Erfolg bei der Arbeit mit begrenztem und wertvollem PDX-Material zu gewährleisten. Beachten Sie die Spitzenplatzierung während der Dosierung, da unsachgemäße Technik wahrscheinlich zu 1) Überlauf führt, wenn während des Ladens Druck ausgeübt wird, oder 2) leere oder teilweise gefüllte Kanäle, wenn die Spitze nicht über dem Einlassanschluss zentriert ist. Vorzeitige Gelation führt auch dazu, dass Kanäle nicht bis zum Ende gefüllt werden. Wenn dies der Fall ist, verringern Sie die Wartezeit zwischen dem Hinzufügen des PEGDA-Verknüpfss und dem Dosieren der Gellösung, oder arbeiten Sie mit kleineren Aliquots der Gellösung zu einem Zeitpunkt. Die in diesem Protokoll verwendeten Dosiervolumina sind für den Erfolg mit HA-Hydrogelen gut optimiert. Die Verwendung von viskoseren Lösungen wie Matrigel in diesem System erfordert eine Erhöhung des Dosiervolumens auf 2 ,L für die ordnungsgemäße Befüllung der mikrofluidischen Kanäle. Beachten Sie auch, dass die Wahl von 50 L-Schritten in Schritt 4.3, die Herstellung von vier Zellpellets in diesem Schritt und die Wiederholungsresuspensionen in Schritt 4.10 absichtlich sind; obwohl sie mehr Material als nötig liefern, liefern sie auch Überschreitungen, um Verluste aus der sich wiederholenden Pipette zu berücksichtigen.
Es sollte beachtet werden, dass jeder PDX wahrscheinlich eine eindeutige Morphologie und Größenverteilung innerhalb dieses 3D-Kulturmodells hat. In gewissem Sinne wird dies aufgrund der Vielfalt der Patientenkrankheit, der Gewebegeschichte, der Matrixparameter und vieler anderer Faktoren erwartet. Eine umfassende Bewertung mehrerer Prostatakrebslinien in Matrigel zeigte diese potenzielle Vielfalt11. Dennoch können die Ermittler überrascht sein, eine große Variation in den oben genannten Parametern zu finden. In einem Manuskript in Vorbereitung präsentieren wir einen breiten Blick auf mehrere PDXs auf dieser Kulturplattform; Die Zellen behalten eine konsistente Antwort innerhalb jedes PDX-Typs bei, können jedoch je nach Proben erheblich variieren, was zu Clustern führt, die z. B. groß mit hoher Zelldichte pro Cluster oder kleiner mit lockereren interzellulären Verbindungen sind. Das spezifische Verhalten jedes PDX sollte von den Forschern in mehreren Studien bewertet werden, um eine vorhersagbare und charakteristische Morphologie zu bestätigen. Die Ermittler können davon ausgehen, dass die Proben den in diesem Papier beschriebenen allgemeinen Verhaltensweisen folgen.
Zusammenfassend bietet das vorgestellte Protokoll Forschern eine neue Methode für den Einsatz von PDXs ex vivo in einer Plattform, die die Feinabstimmung von Kulturbedingungen und die Einbeziehung relevanter 3D-Umwelthinweise wie gewebespezifische extrazelluläre Matrix (ECM) und Perfusionsfluss ermöglicht, die ein längeres Zellüberleben über mehrere Tage oder Wochen ermöglicht. Eine detaillierte Charakterisierung dieser Kulturen wurde durch die hier gezeigten Färbe- und Morphologieanalysen erreicht. Darüber hinaus können Kulturen bei Bedarf auf Plattenleser-basierte Assays, immunfluoreszierende Kennzeichnungen oder zur Herstellung von Lysaten verwendet werden, was eine weitere molekulare Charakterisierung ermöglicht. Obwohl wir zuvor einige Elemente der PDX 3D-Kultur innerhalb von Hydrogelen veröffentlicht haben, ist diese Anwendung der mehrstufigen Reinigung neu, einfach in einem Standardlabor zu verwenden und erfolgreich bei der Beibehaltung hochlebensfähiger repräsentativer Kulturen. Die OrganoPlate-Plattform bietet in ihren zweispurigen und dreispurigen Varianten durch ihr Modell der Gewebeperfusion weitere Komplexität und eine wichtige Möglichkeit, noch weniger Zellen pro Experiment zu verwenden. Im Vergleich zu unseren Vorgängermodellen reduzierte die mikrofluidische Plattform den Zellbedarf um den Faktor 30 pro Experiment, was angesichts der knappen Verfügbarkeit von PDX-Tumorgewebe in den meisten Laboratorien ein enormer Vorteil ist. Das mikrofluidische System ermöglicht eine erweiterte Bildgebung, Immunfärbung und einfache Bildgebung über eine Zellpopulation, die groß genug ist (n = 2.000 bis 4.000 Zellen pro Bildgebungsfenster), um die Quantifizierung des Phänotyps im Rahmen der räumlichen Organisation zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von national Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) und P01CA098912 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
