Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Summary

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Abstract

Les xénogreffes d’origine patiente (PDX), générées lors de la résécation du tissu tumoral du patient, sont greffées directement en souris immunocompromisées, demeurent biologiquement stables, préservant ainsi les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques, ainsi que l’hétérogénéité de la tumeur originale. Toutefois, l’utilisation de ces modèles pour effectuer une multitude d’expériences, y compris le dépistage des drogues, est prohibitif tant en termes de coût que de temps. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont largement considérés comme des plates-formes dans lesquelles les cellules cancéreuses conservent leur intégrité biologique grâce aux interactions biochimiques, à la morphologie et à l’architecture. Notre équipe a une vaste expérience de la culture des cellules PDX in vitro à l’aide de matrices 3D composées d’acide hyaluronique (HA). Afin de séparer les cellules stromal fibroblastes de souris associées aux PDX, nous utilisons la culture de rotation, où les cellules stromal adhèrent à la surface des plaques traitées par culture tissulaire tandis que les cellules tumorales DISSOCIées pdx flottent et s’associent en grappes multicellulaires. Les cellules simples, souvent mortes, qui présentent un défi dans la collecte de clusters PDX viables pour l’encapsulation en aval dans les hydrogels pour la culture cellulaire 3D, flottent également dans le surnatant. Afin de séparer ces cellules simples des grappes cellulaires vivantes, nous avons utilisé la centrifugation de gradient d’étape de densité. Le protocole décrit ici permet l’épuisement des cellules célibataires non viables de la population saine des grappes cellulaires qui seront utilisées pour d’autres expérimentations in vitro. Dans nos études, nous intégrons les cultures 3D dans des plaques microfluidiques qui permettent la perfusion des médias pendant la culture. Après avoir évalué les cultures qui en résultent à l’aide d’un test de viabilité basé sur l’image fluorescente des cellules purifiées par rapport aux cellules non purifiées, nos résultats montrent que cette étape de séparation supplémentaire a considérablement réduit le nombre de cellules non viables de nos cultures.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, le domaine de la recherche sur le cancer a démontré un regain d’enthousiasme pour les xénogreffes dérivées du patient (PDX) comme outil d’évaluation de la dépendance aux voies cancéreuses et de la susceptibilité^{aux médicaments 1}. Les modèles PDX les plus courants sont établis par implantation sous-cutanée ou orthotopique de cellules tumorales humaines — un fragment tumoral, un groupe de cellules dérivées de tumeurs dissociées ou un échantillon de cellules tumorales circulantes isolées (CTC) — dans un hôte de rongeurs. Si la tumeur « prendre » est un succès, les cellules xénogreffe proliférera, vasculariser, et autrement interagir avec le tissu hôte pour créer une tumeur, qui peut être récolté à une taille optimale, subdivisé, et ré-implanté dans d’autres hôtes. Parmi leurs nombreux avantages en tant que système modèle, les PDX conservent généralement une partie substantielle de l’hétérogénéité de la population de cellules tumorales indigènes et permettent l’évaluation des voies et des réponses cellulaires spécifiques à^{l’homme 2,3}. Le contexte in vivo permet l’interaction de tumeur avec la vascularisation et d’autres stroma adjacents et récapitule des caractéristiques de tissu telles que la dynamique de diffusion de drogue, la tension d’oxygène, et l’influence extracellulaire de matrice qui influencent biologiquement et mécaniquement la progression de tumeur. Un aspect négatif des PDXs est leur dépendance sur un hôte de rongeur, à la fois pour l’expansion de tumeur et finalement pour l’essai d’hypothèse. Étant donné que de nombreux PDX ne peuvent pas s’adapter à la culture bidimensionnelle traditionnelle (2D) sur le polystyrène de culture tissulaire sans perdre bon nombre de leurs caractéristiques souhaitables, il y a eu un juste milieu minimal pour les chercheurs entre cette méthode in vitro relativement contrôlée et l’augmentation significative des dépenses, des installations et des besoins en temps pour l’utilisation in vivo PDX.

Nous avons décrit plusieurs modèles in vitro qui mettent en œuvre la culture cellulaire 3D au sein d’une matrice de soutien, et avons récemment élargi ce travail pour démontrer la culture ex vivo des PDX dérivés du cancer de la prostate multiple (PCa), seuls et en co-culture avec des fibroblastes dérivés de la^{moelle osseuse 4,5}. Les matrices hydrogel à base d’acide hyaluronique (HA) fournissent un soutien personnalisable et biologiquement pertinent pour les deux types de cellules, avec un contrôle facile sur les caractéristiques hydrogel et la clarté optique pour l’imagerie à travers la profondeur hydrogel⁶.

Les tissus tumoraux PDX matures comprennent un mélange variable de cellules cancéreuses humaines hétérogènes et de stroma de souris (fibroblastes, cellules endothéliales, etc.). Pour étudier les contributions spécifiques de type cellulaire à la progression tumorale in vitro, il peut être avantageux de dissocier les tumeurs, de séparer les populations cellulaires et de les incorporer expérimentalement de manière organisée pour disséquer les voies de communication intercellulaire. Les populations mixtes de cellules dans les digestates tissulaires ont une compatibilité différentielle avec des conditions de culture spécifiques. Par exemple, la viabilité fibroblaste associée à la tumeur nécessite soit une adhérence de surface, soit des matrices 3D fonctionnalisées avec des ligands d’intégrine, tandis que les cellules PDX épithéliales n’ont généralement pas ces exigences, favorisant plutôt les interactions cellule-cellule. Ces différences peuvent être exploitées pour assurer une séparation efficace des cellules PDX des cellules stromales de la souris contaminantes. La culture de rotation des digestates tissulaires permet l’adhérence des cellules stromales à la surface de la culture tissulaire tandis que les adhérences cellule-cellule conduisent les cellules PDX flottant au-dessus de la surface de culture rotative pour former des grappes multicellulaires dans le supernatant à 24−48 h. Les caractéristiques spécifiques de ces grappes varient selon le PDX (p. ex., de grandes grappes serrées, hautement sphériques ou des agrégats plus petits et plus lâches ressemblant à des grappes de raisin), mais sont généralement de tailles biologiquement pertinentes (50−250 μm de diamètre), suffisantes pour évaluer les interactions cellulaires qui reposent sur des contacts intercellulaires.

La récupération et le traitement des tumeurs entraîne inévitablement un certain degré de mort collatérale des cellules, soit en raison de dommages à court terme causés par des perturbations mécaniques/enzymatiques, soit d’une incompatibilité à long terme des sous-populations avec les conditions de culture choisies. Malgré l’utilité de la culture de rotation comme séparation initiale en vrac, les cellules mortes ou mourantes sont inévitablement transférées avec les clusters PDX et peuvent influencer la culture qui en résulte. Ces cellules mortes sont souvent des cellules PDX individuelles qui n’ont pas été intégrées dans un cluster, des fibroblastes stromaux de souris qui ne peuvent survivre dans des conditions de culture sélectionnées, ou des cellules endothéliales particulièrement fragiles. Ces cellules mourantes peuvent influencer les résultats expérimentaux des « survivants » et avoir un impact important sur la quantification, par exemple par le biais d’analyses de dépistage de la viabilité basées sur l’image fluorescente. Pour améliorer la sélection des cellules PDX vivantes de cette méthode, nous avons adapté les méthodes de centrifugation avec des étapes de densité pour éliminer facilement les cellules mortes/mourantes individuelles des mélanges PDX et conserver principalement des clusters multicellulaires vivants.

Afin d’améliorer l’étude des grappes dérivées de PDX en culture 3D, nous avons utilisé une plate-forme de culture de perfusion basée sur les microfluidiques, l’OrganoPlate (Figure 1), qui est une plate-forme de culture de perfusion à haut débit qui permet une culture simultanée de jusqu’à 96 cultures individuelles perfusées et 3D sur une base de plaques de microtiter de 384 puits(figure 1A)^7,8. Dans la plaque microfluidique à deux voies, une seule puce tissulaire est reliée par deux canaux microfluidiques(figure 1B,canal gel : rouge, canal de perfusion : bleu) qui s’étendent sur quatre puits d’affilée. Les deux canaux microfluidiques sont séparés par une courte crête en plastique appelée Phaseguide qui empêche le débordement d’un canal dans son canal voisin adjacent, et permet simultanément une interface sans membrane entre le contenu du gel et le canal de perfusion⁹. Parce que le fond de la plaque microfluidique est composé de verre de qualité microscope, les cultures peuvent être visualisées dans la fenêtre d’observation à travers le fond de la plaque avec un microscope standard ou automatisé. La perfusion est établie dans la plaque microfluidique avec un rocker programmable, utilisant la gravité pour conduire les médias à travers les canaux microfluidiques, entre les puits du réservoir (figure 1C). Le flow-mimic de perfusion récapitule plus étroitement le microenvironnement de tumeur que la culture statique, permettant l’incorporation du stress de cisaillement et la distribution accrue des gaz et des éléments nutritifs. Les avantages du maintien d’une culture perfusée de cellules cancéreuses dans la plaque microfluidique ont été précédemment décrits comme cultures perfusées de cancer du sein ont montré la viabilité optimale par rapport à une culture statique de 3D des mêmes cellules^7.

Le présent rapport décrit une méthode adaptée de centrifugation du gradient de densité pour isoler les clusters PDX multicellulaires vivants et démontre son utilité dans l’établissement de cultures 3D PDX dans des plaques microfluidiques perfusables. Étant donné qu’un nombre croissant de laboratoires de recherche cherchent des méthodes pour faciliter l’utilisation du PDX, nous prévoyons que les protocoles présentés ici seront d’une utilité immédiate.

Protocol

Le tissu tumoral a été obtenu avec le consentement du patient et selon un protocole approuvé de la Commission d’examen institutionnel (CISR). Les xénogreffes ont été implantées, cultivées et récoltées selon un protocole accepté du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

REMARQUE : Tous les travaux doivent être effectués dans un cabinet de sécurité biologique stérile pour maintenir la stérilité. Toutes les étapes doivent être effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Préparation des matériaux pour le traitement PDX

1. Forceps autoclave et poignée de scalpel ou lames de rasoir.
2. Décongeler la solution enzymatique de dissociation à 4 °C pendant la nuit ou à température ambiante le même jour que la dissociation des tissus.
   REMARQUE : La décongélation à 37 °C n’est pas conseillée, car cela peut inactiver certaines enzymes de dissociation.
3. Préparer au moins 100 mL de milieu de culture PDX (mélange moyen-nutriment Eagle modifié F-12 [DMEM-F12] avec 100 U/mL de pénicilline et de streptocotomycine et 30% sérum bovin fœtal [FBS]), et au moins 25 mL de milieu de traitement PDX (DMEM-F12 avec 100 U/mL de pénicilline et streptocotomycine et pas de FBS). Conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.

2. Dissociation pdx et purification initiale de composant stromal

1. Recueillir des ustensiles autoclavés, des passoires cellulaires de 70 μm (2−3), des plats ronds de culture tissulaire de 60 mm (2), des plaques de culture tissulaire de 6 puits, des tubes stériles de centrifugeuse conique de 50 mL et un salin stérile de 1 x tamponné au phosphate (PBS). Culture chaude moyenne à 37 °C et permettre à la solution enzymatique de dissociation d’arriver à température ambiante.
2. Lorsque le tissu PDX a atteint un diamètre de 1,0−1,5 cm chez un hôte de souris, retirez chirurgicalement la tumeur de la souris par des moyens standard (p. ex., sous anesthésie acceptée) et conservez-le sur la glace dans un tube de 50 mL avec milieu de culture PDX(figure 2A). Traiter le tissu rapidement, par les étapes ci-dessous, pour maximiser la viabilité cellulaire, de préférence dans les 1−2 h après la récolte.
3. Transférer le tissu tumoral dans un tube conique stérile pré-pesé de 50 mL. Rincer 6x avec 30 mL de PBS stérile pour éliminer le sang et les contaminants. Enlever autant de liquide que possible et peser le tissu tumoral.
4. Transférer le tissu tumoral dans un plat rond de culture tissulaire de 60 mm et hacher en ~1 mm³ morceaux à l’aide d’une lame de rasoir stérile ou d’un scalpel.
5. Ajouter 5 mL de milieu de traitement PDX pour recueillir le lisier tumoral et transférer dans un nouveau tube stérile de 50 mL. Rincer le plat de culture avec un autre 5 mL de milieu de traitement PDX, puis avec la solution enzymatique de dissociation (tumeur de 10 mL/g, au moins 5 mL), en ajoutant tous les rinçages au tube de 50 mL.
6. Incuber 20 min à 37 °C avec des secousses douces. Faites tourbillonner doucement le tube à mi-temps du temps d’incubation.
7. Pipette de haut en bas doucement avec une pipette sérologique pour briser les touffes. Filtrer les cellules avec une passoire cellulaire de 70 μm placée sur un nouveau tube stérile de 50 mL.
   REMARQUE : Plus d’une passoire peut être nécessaire.
8. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant et resuspendez dans 2−3 mL de milieu de culture PDX. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
9. Utilisez le tableau 1 pour estimer le nombre requis de cellules dissociées dérivées du PDX nécessaires pour atteindre la densité cellulaire souhaitée par puce.
   REMARQUE : Les valeurs du tableau 1 sont destinées à être un point de départ. Les valeurs réelles varieront en raison de la viabilité/cellularité des tissus et de la perte cellulaire due au gel ou à la récupération. Les tumeurs PDX sont des individus, même dans un type de cancer donné de sorte que ces valeurs devraient être ajustées empiriquement.
10. Sur le nombre calculé à l’étape 2.9, plaque 1−2 x 10⁶ cellules dans 5 mL de milieu de culture PDX par puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits. Incuber (37 °C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité) pendant 48 h avec des secousses douces (50−55 rpm) pour favoriser la formation des grappes (figure 2B). Après la formation de l’amas, passez à l’article 3 pour la centrifugation.
11. Cryopreserve cellules PDX inutilisées de la dissociation initiale dans 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% sulfure de diméthyle (DMSO) ou un milieu de congélation cellulaire primaire disponible dans le commerce.
    REMARQUE : Les cellules stromales de souris adhérentes peuvent également être récupérées de la surface de plaque de tissu, si désiré, en rinçant brièvement avec le milieu de culture et en élargissant par des moyens standard.
12. Pour une utilisation ultérieure des cellules tumorales cryopréservées PDX/stroma de souris, décongelez les cellules dans un bain d’eau de 37 °C pendant 2 min. Comptez et plaquez dans une plaque de culture tissulaire de 6 puits telle que décrite à l’étape 2.10 avant de passer à l’article 3. Augmentez le nombre de cellules PDX d’environ 20 % pour tenir compte des pertes de viabilité causées par la cryopréservation.

3. Séparation basée sur la centrifugation du gradient de densité des grappes dérivées du PDX des cellules individuelles

1. Préparer 20 mL de solution de gradient de densité de 100 % en mélangeant soigneusement 18 mL de solution de centrifugation de gradient de densité avec 2 mL de solution de sel équilibré stérile de 10 x Hanks (HBSS) dans un tube conique stérile de 50 mL. Faites 10 mL chacune de 20%, 30%, 40%, et 55% solutions de gradient de densité en diluant cette solution 100% avec stérile 1x HBSS et bien mélanger.
   REMARQUE : Ces volumes sont suffisants pour deux gradients de 15 mL qui peuvent être utilisés pour séparer ~15 x 10⁶ cellules chacune. Si vous séparez moins de ~15 x 10⁶ cellules, le deuxième gradient doit être utilisé comme un équilibre pour la centrifugation.
2. Ajouter 3 mL de solution de gradient de densité de 55% au fond d’un tube conique de 15 mL. Tenant le tube à un angle, superposez très doucement 3 mL de solution de gradient de densité de 40% au-dessus de la couche de 55%, distribuant lentement le liquide sur le côté incliné du tube pour éviter de mélanger les couches. Répétez avec la solution de gradient de densité de 30%.
3. Recueillir le supernatant des cultures de rotation PDX avec une pipette sérologique de 5 mL, rincer doucement la surface de la plaque. Centrifugeuse à 200 x g pendant 2 min pour pelleter les cellules.
4. Enlevez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 3 mL de solution de gradient de densité de 20% selon le nombre de gradients nécessaires pour séparer les cellules. Superposez soigneusement la solution de gradient de densité de 20 % avec des cellules sur le dessus du gradient(s). Si vous n’utilisez qu’un seul tube de gradient pour les cellules, garnir le tube de gradient d’équilibre d’une solution de gradient de densité sans cellules de 20 %.
5. Capuchon des tubes et centrifugeuses dans une centrifugeuse de rotor de godet pivotant pendant 30 min à 4 °C, 2 000 x get 0 frein.
6. Après centrifugation, des fractions seront visibles (Figure 2C). Recueillir 2−3 mL de fractions dans des tubes frais de 15 mL. Ajouter 3−4 volumes de 1x HBSS stérile à chaque fraction et inverser pour bien mélanger.
7. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 1−2 mL de milieu de traitement PDX.
   REMARQUE : Les clusters cellulaires PDX viables se trouvent généralement à l’interface de solution de gradient de densité de 40−55 % (figure 2D) avec des cellules mortes/mourantes individuelles s’accumulant à l’interface de solution de gradient de densité de 20−40 % pour la plupart des PDX testés.
8. Retirez un petit aliquot représentatif (50−100 μL) pour la re-dissociation avec un volume égal de solution enzymatique de dissociation pour évaluer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire groupée. Comptez les cellules à l’hémocytomètre ou au compteur cellulaire automatisé.

4. Préparation hydrogel et ensemencement de plaques microfluidiques

1. Reconstituer les solutions HA hydrogel (HA, HA-SH; thiol-reactive polyéthylène glycol diacrylate, PEGDA) selon les instructions du fabricant.
2. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 50 μL de HBSS à tous les puits dans des colonnes de fenêtre d’observation (colonne 3, 7, 11, 15, 19, 23) d’une plaque microfluidique à 2 voies pour maintenir l’humidité de la culture et des conditions d’imagerie optimales.
3. Calculer le volume de suspension cellulaire à partir de la section 3 nécessaire pour 50 μL d’hydrogel à la densité cellulaire désirée (c.-à-d. 5 000 cellules/μL). Pour l’ensemencement d’une plaque microfluidique, aliquot le volume calculé dans chacun des 4 tubes stériles centrifugeuses de 1,5 mL.
   REMARQUE : Les hydrogels HA ont un temps fixe pour la gelation. Ajustez le volume des aliquots de solution de gel pour l’efficacité d’utilisateur à la distribution si la gelation prématurée se produit.
4. Réglez le pH de la solution HA-SH à 8,0 avec 1 N NaOH immédiatement avant l’utilisation. Effectuez une gelation d’essai en mélangeant 40 μL de HA-SH avec 10 μL de PEGDA et en surveillant la gelation au fil du temps. La gelation commence généralement 5−8 min après le mélange HA-SH avec le crosslinker PEGDA.
5. La suspension cellulaire centrifugeuse aliquots pendant 2 min (200 x g, température ambiante) aux cellules de granulés. Retirez soigneusement les cellules supernatantes et résuspendantes dans le volume approprié de HA-SH.
   REMARQUE : L’hydrogel final est une solution HA-SH:PEGDA 4:1 (en volume) de sorte que les cellules doivent être résuspendées en 40 μL de HA-SH pour un volume final de 50 μL.
6. Ajouter 10 μL de PEGDA à un aliquot de cellules dans HA. Bien mélanger et attendre 1−3 min (selon le temps de gelation à partir de l’étape 4.4) avant d’ensemencer la plaque microfluidique.
   REMARQUE : Permettre la réaction de gelation du début avant l’ensemencement aide à réduire au minimum le tassement cellulaire.
7. Apposer une pointe pour distribuer des volumes de 1,5 μL à un seul canal répétant pipette et charger avec des cellules dans la solution hydrogel HA. N’oubliez pas de garder l’hydrogel aliquot bien mélangé pour assurer une distribution uniforme des cellules.
8. Pour ensemencer la plaque microfluidique, alignez la pointe de pipette perpendiculairement à la plaque tout en plaçant doucement la pointe au centre de l’entrée de gel (colonnes 1, 5, 9, 13, 17, 21) pour assurer le contact mais aucune pression lors de la distribution de la solution hydrogel. En travaillant rapidement pour prévenir la solidification prématurée de l’hydrogel, distribuez 1,5 μL de solution gel dans chaque entrée de gel.
9. Observez l’état de remplissage des canaux microfluidiques en regardant du haut de la plaque, du bas de la plaque ou au microscope, et évaluez le chargement, en utilisant la figure 3 comme guide (chargement réussi à la figure 3A,guidage de positionnement pipet à la figure 3B,chargement manqué à la figure 3C, non rempli pour se terminer à la figure 3D, débordement à la figure 3E). Identifiez tous les ajustements nécessaires à la technique qui pourraient améliorer le succès de remplissage pour la prochaine série de jetons (voir discussion pour les conseils de dépannage).
10. Répétez les étapes 4.6−4.9 avec les 3 aliquots restants des cellules dans la solution HA. Inverser la plaque tout en préparant le prochain aliquot (~1 min).
    REMARQUE : Le temps d’attente de 1 min et l’inversion de la plaque améliorent la distribution 3D des cellules en réduisant le tassement cellulaire à mesure que la gelation se produit.
11. Une fois toutes les copeaux remplies, incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié jusqu’à ce que la gelation soit complète (~45 min).
12. À l’aide du manuel fourni, assurez-vous que le rocker de perfusion est installé dans l’incubateur de culture cellulaire avec les réglages de perfusion corrects (angle de 14°, intervalles de 4 min).
13. Ajouter 50 μL de milieu de culture PDX à toutes les entrées moyennes (colonnes 2, 6, 10, 14, 18, 22) et vérifier si les canaux se sont remplis correctement en renversant la plaque. Appuyez doucement sur la plaque contre une surface pour encourager le liquide à remplir les canaux microfluidiques.
14. Ajouter 50 μL de DMEM-F12 (10% FBS) pour tous les points de vente moyens (colonne 4, 8, 12, 16, 20, 24). Si des bulles d’air sont emprisonnées dans le canal de perfusion, retirez-les en tapant doucement la plaque contre une surface.
15. À l’aide d’un formulaire de disposition du microscope et de laplaque (figure supplémentaire 1),enregistrez le succès de remplissage des copeaux. Exclure les copeaux mal remplis de toute autre utilisation expérimentale.
16. Placez la plaque sur un rocker incliné réglé à une inclinaison de 14° et un cycle de 4 min pour commencer la perfusion. Remplacer le milieu de culture PDX tous les 2 jours (d’abord 50 μL dans l’entrée, puis 50 μL en sortie).

5. Coloration cellulaire, imagerie et quantification de l’image

1. Préparer une solution d’analyse de viabilité cellulaire contenant trois colorants fluorescents (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, acéoxyméthyle de calcéine [AM]).
   1. Préparer des solutions de stock de chaque colorant comme suit : Hoechst 33342 à 1,6 mM (1 mg/mL) dans l’eau déionisée; calcéine AM à 4 mM en DMSO anhydre; ethidium homodimer-1 à 2 mM en DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      REMARQUE : Les solutions stock calcéine AM et ethidium homodimer-1 sont fournies dans le kit noté dans le tableau des matériaux.
   2. Préparez une solution de travail unique dans le HBSS ou le phénol rouge-libre moyen, contenant chacun des trois sous-dyes. Optimiser la concentration finale de travail pour chaque type de cellule et matrice, dans les fourchettes de 1,6−8,0 μM pour Hoechst 33342, 0,1−10 μM pour la calcéine AM et 0,1−10 μM pour l’ethidium homodimer-1.
2. Retirez le milieu de culture et appliquez la solution de colorant de viabilité de travail aux puces microfluidiques désirées (75 μL dans l’entrée, 25 μL dans la prise) et placez-les de nouveau sur le rocker de perfusion dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 1 h.
3. Imagez les fenêtres d’observation des cultures tachées à l’aide d’un microscope confocal manuel ou automatisé(Tableau des matériaux)avec des filtres fluorescents (répertoriés comme longueurs d’onde excitation/émission, nm) pour observer tous les noyaux (Hoechst 33342, 350/461), les noyaux de cellules mortes (ethidium homodimer-1, 528/617) et le cytoplasme cellulaire vivant (calcéine AM, 494/517).
4. Capturez 140 piles Z de μm d’une taille d’étape de ≤1 μm à l’aide d’un objectif d’air de 20 x. Trois champs de vision sont nécessaires pour visualiser l’ensemble du microcanal avec une petite quantité de chevauchement. Pour éviter un double échantillonnage, n’imagez que deux champs de vision par puce.
   REMARQUE : Les conditions d’imagerie doivent être optimisées afin d’assurer un échantillonnage NyQuist approprié. Dans l’expérience des auteurs, un système d’imagerie rapide, basé soit sur la déconvolution d’une source conventionnelle d’épi fluorescence ou le mode de balayage de résonance sur un confocal, est nécessaire pour analyser complètement une pile Z complète, avec trois couleurs laser, à travers 96 puces sur une plaque dans un laps de temps raisonnable (environ 3,5 h avec imagerie automatisée, y compris la configuration).
5. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, analysez les images Z-stack pour les données quantifiées souhaitées, telles que la morphologie, l’état d’agrégation ou d’autres fonctionnalités. Pour quantifier la viabilité des cellules, comptez le nombre de cellules mortes (rouges) et de noyaux cellulaires totaux (bleu).

Representative Results

Un rocker de perfusion programmable a été préparé dans un incubateur standard de culture cellulaire à prise d’eau, et des plaques microfluidiques à deux voies ont été préparées dans un coffret de biosécurité standard pour le chargement (figure 1). Une tumeur de PDX de MDA-PCA-118b a été agrandie in vivo, récoltée quand elle avait atteint une taille maximale, et dissociée comme décrit dans la section de protocole 2 pour créer une suspension de boue des cellules, à approximativement un état unicelliste (figure 2A). Le lisier a été distribué dans des plaques de culture tissulaire de 6 puits, et placé sur un rotateur XY tel que décrit, pendant 48 h. Stroma de souris attaché au fond de la plaque de culture tissulaire, comme cela a été décrit précédemment, et les cellules humaines PDX sont restées flottant dans le milieu, assemblées en grappes (Figure 2B). Des cellules simples non assemblées étaient également visibles dans toute la solution.

Un gradient de densité d’étape a été établi dans un tube de centrifugeuse en utilisant les méthodes de la section 3 du protocole. La suspension supernatante des cellules PDX a été aspirée doucement à partir de la plaque multiwell, chargée sur le gradient d’étape, et centrifugée comme décrit. Après centrifugation, une bande brumeuse, contenant les clusters PDX, était visible près de l’interface entre les fractions 2 et 3, et des cellules individuelles ont été identifiées à l’interface entre les fractions 1 et 2 (Figure 2D). Des fractions ont été rassemblées comme décrit, diluées plus loin dans HBSS, et centrifugées encore pour enlever la solution de gradient de densité. Le supernatant a été aspiré, et les granules de cellules qui en ont résulte ont été résuspendus dans le milieu de traitement PDX. Un petit aliquot de chaque fraction traitée a été évalué au microscope, pour confirmer que la fraction prévue contenait le cluster PDX, et que la fraction séparée contenait principalement des cellules individuelles.

Les solutions d’hydrogel HA ont été reconstituées comme décrit dans la section 4 du protocole, et les grappes PDX ont été résuspendées dans la solution hydrogel. Les solutions PDX ont été chargées en copeaux sur la plaque microfluidique et évaluées pour un chargement réussi( figure 3). Dans la plupart des cas, >90% des puces ont été chargées avec succès après une certaine pratique avec la technique et l’ajustement des volumes de chargement. Après le chargement du nombre désiré de copeaux, et l’incubation pour la gelation comme décrit, le milieu de culture PDX a été ajouté à la plaque microfluidique, et la plaque a été cultivé avec perfusion.

À l’aide de colorants fluorescents et des méthodes de la section 5 du protocole, et de la microscopie confoccale, la viabilité et la morphologie de la culture 3D de PDX microfluidiques ont été évaluées dans des conditions séparées de centrifugation de gradient non paréparé et de densité (figure 4A). Des images de ces plaques ont été enregistrées sous forme de piles Z sur le microscope confocal et évaluées pour la viabilité cellulaire dans les logiciels d’analyse d’images. Le jour 1, les cultures qui ont subi la méthode de séparation présentaient 10 fois moins de cellules mortes simples (rouges) que les cultures non parées (figure 4B). Fait important, les grappes séparées se composaient principalement de cellules vivantes (vertes). Aucune différence statistiquement significative n’a été identifiée pour la répartition de la taille du cluster( figure 4C).

Les cultures ont été maintenues dans la plaque microfluidique pendant sept jours (figure 5A). Les échantillons ont été évalués périodiquement, en utilisant les mêmes méthodes d’imagerie et de quantification que ci-dessus. Le nombre total de cellules vivantes est demeuré constant (figure 5B) et les grappes ont conservé une viabilité d’environ 80 %(figure 5C)au cours de la durée de vie de la culture. La densité cellulaire dans l’état non séparé est d’environ un tiers de la condition séparée parce que les cellules simples sont vivantes pendant le comptage cellulaire, mais meurent rapidement dans l’hydrogel. Il y a également plus de variabilité dans la taille de cluster sans la séparation de gradient de densité.

Figure 1 : La plaque microfluidique perfusible à 2 voies. (A) La plaque microfluidique à 2 voies est une plaque de microtitre standard de 384 puits avec un fond modifié composé de canaux microfluidiques intégrés entre les plaques de verre. Chaque plaque se compose de 96 puces tissulaires pour la culture cellulaire 3D. (B) Vu du haut de la plaque, une seule puce microfluidique à 2 voies est composée de 4 puits d’affilée reliés par le canal gel (rouge) et le canal de perfusion (bleu); l’entrée de gel, l’entrée de perfusion, la fenêtre d’observation, et la sortie de perfusion. (C) La perfusion est réalisée dans la plaque microfluidique avec un rocker programmable qui utilise la gravité pour conduire les médias entre l’entrée de perfusion et les puits de sortie qui sont des réservoirs de médias. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Isolement du cluster PDX. (A) Disséquer le tissu pdx primaire et se dissocier en une seule suspension cellulaire contenant à la fois des cellules PCa humaines et stroma tumeur de souris. Soit cryopréserve mélange cellulaire dissocié ou ( B )ajouterà la culture de rotation pour reclus les cellules tumorales et permettre aux cellules stromales de la souris d’adhérer à la plaque de culture tissulaire (48 h). (C) Utiliser la centrifugation de gradient de densité pour éliminer les cellules mortes résiduelles simples, et (D) recueillir des clusters PDX viables à l’interface entre les couches de gradient de densité 40% et 55% (boîte en pointillés rouge). (E) Récupérer les grappes PDX, resuspendre dans la solution précurseur hydrogel, et de distribuer sur la plaque avec une pipette répétée. (F) Les calculs d’exemple, correspondant au tableau 1,démontrent les numéros de cellules initiaux nécessaires pour atteindre une concentration cellulaire finale souhaitée pour toutes les puces d’une plaque. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Surveillance du chargement des plaques microfluidiques. Le succès de chargement et les erreurs peuvent être évalués par oeil (dans les vues supérieure et inférieure), avec confirmation au microscope. (A) Le chargement réussi est identifié par une voie de perfusion ouverte (lumineuse) dans les vues supérieure et inférieure, et une voie de gel légèrement plus foncée en vue du bas. La visualisation au microscope confirme que la voie gel a été complètement remplie de cellules et de précurseurs de gel, sans déborder dans la voie adjacente. (B) Dessin animé démontrant le placement correct de pointe de pipet pendant la distribution de gel, avec le placement correct étant juste au-dessus du port d’entrée (gauche) et le placement incorrect étant hors-centré (milieu) ou appliquant la force au port d’entrée (droite). (C) Les voies lumineuses dans toutes les vues indiquent un chargement manqué, ce qui suggère que la pointe du tuyau n’a pas été correctement placée dans l’entrée de gel. (D) Un remplissage partiel de la voie de gel (non rempli à la fin) est identifié par la flèche rouge, qui montre où l’avant de solution de gel a été interrompu, soit par une bulle d’air piégée, ou une pause prématurée dans le chargement. La flèche rouge dans la vue microscope identifie le même emplacement. (E) Le contenu de la voie de gel a débordé le PhaseGuide, se déversant dans la voie de perfusion et finalement le bloquant. Ce débordement est visible en bas de la vue par l’aspect sombre des voies de gel et de perfusion. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Évaluation de la coloration cellulaire et de la viabilité de la plaque microfluidique. ( A ) À l’aide de taches fluorescentes, la viabilitéaété évaluée dans des grappes cellulaires PCa non séparées et séparées ensemencées dans la plaque microfluidique (tous les noyaux : Hoechst 33342, bleu; cellules mortes : ethidium homodimer-1, rouge; et cellules vivantes : calcéine AM, verte). Barre d’échelle = 50 μm. (B) Les cellules mortes totales ont été quantitées le jour 1 de la culture et les cultures séparées de MDA-PCa-118b PDX ont démontré une diminution significative du nombre de cellules mortes. (C) Quantification de la taille des grappes pour les PCa PDX, dans les cultures séparées et non séparées, a montré une légère augmentation, mais aucune différence statistiquement significative. Les barres et les barres d’erreur dans le panneau B représentent l’écart moyen et standard de 4 images par condition (2 puces avec 2 images/puce). L’astérisque (*) représente des différences statistiquement significatives (p < 0,05) par rapport à l’état non paréparé à l’aide du t-test d’un élève. Pour l’intrigue de la boîte et de la moustache dans le panneau C, l’icône croisée indique la moyenne, et la ligne horizontale représente la médiane, de 4 images par condition (2 puces avec 2 images/puce). La boîte contient 50% des données tandis que les moustaches s’étendent jusqu’au diamètre minimum et maximum du cluster pour chaque condition. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Caractérisation du MDA-PCa-118b séparé dans la plaque microfluidique. (A) Les grappes cellulaires cancéreuses PCa séparées (gauche) et non parées (à droite) ont été ensemencées dans la plaque microfluidique et perfusées jusqu’à sept jours. Les cultures étaient tachées de trois teintures spécifiques à tous les noyaux (Hoechst 33342, bleu), de cellules mortes (ethidium homodimer-1, rouge) et de cellules vivantes (calcéine AM, verte). Barre d’échelle = 50 μm. (B,C) Quantitation du nombre de cellules et viabilité de la culture à partir d’images sur une semaine de culture à une densité d’ensemencement de 8 000 cellules/μL. Les barres et les barres d’erreur représentent l’écart moyen et standard de quatre images par condition. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Densité cellulaire désirée finale en une seule puce (cellules/μL)	Volume chargé par puce (μL)	Nombre de copeaux sur plaque microfluidique	Mutiplier pour volume supplémentaire	Figure 2C : Nombre de cellules séparées requises pour une plaque de microwell complète (étape 3.8)	Multiplicateur pour pertes cellulaires (ablation du stroma, mort cellulaire)	Figure 2B : Démarrage # des cellules PDX dissociées pour le protocole (étape 2.8)
2,500	1.5	96	1.3	4.7E+05	3	1.4E+06
5,000	1.5	96	1.3	9.4E+05	3	2.8E+06
10,000	1.5	96	1.3	1.9E+06	3	5.7E+06
20,000	1.5	96	1.3	3.7E+06	3	1.1E+07

Tableau 1 : Matériel PDX initial et final approximatif requis pour charger une seule plaque microfluidique à deux voies.

Figure supplémentaire 1 : Disposition des plaques microfluidiques à 2 voies. Après l’ensemencement de la plaque microfluidique, enregistrez le succès individuel du chargement des copeaux (chargement réussi, manqué, non rempli à bout ou débordement) à l’aide de la disposition des plaques à deux voies. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ici nous décrivons une méthode pour traiter et cultururing les cellules viables de tumeur PDX-dérivées dans un système de culture 3D perfusé à haut débit. Tandis que ce protocole utilise le tissu de PCa PDX, il est également efficace pour d’autres tumeurs épithéliales-dérivées. Les caractéristiques tumorales varient d’une lignée PDX à l’autre, même dans le même tissu d’origine (prostate, sein, etc.). Certaines lignées PCa PDX sont plus fibrotiques et difficiles à isoler les cellules viables de tandis que d’autres sont plus cellulaires. La taille de tumeur notée ici peut être modifiée dans les directives d’IACUC pour fournir plus de tissu pour les tumeurs particulièrement à faible rendement. En outre, des fragments de tumeur peuvent être rassemblés après l’étape 2.7, ré-digérés, et mis en commun avec la digestion initiale pour augmenter le rendement. Ceci est particulièrement utile pour les tumeurs plus extracellulaires matrix-heavy. Les cycles supplémentaires de digestion au-delà de deux entraînent généralement une faible viabilité et un faible rendement et ne sont pas recommandés.

La purification des populations dérivées du PDX, afin d’éliminer les cellules mortes ou mourantes ou de contaminer les cellules hôtes, est bénéfique pour la culture 3D étendue et la quantification des cellules cancéreuses désirées. La première étape de la purification décrite ici — la culture de suspension dans un volume relativement important de médias avec la rotation XY à des vitesses modérées — favorise 1) l’extraction sélective de cellules fortement dépendantes de l’adhérence, généralement des fibroblastes stromaux de souris, et 2) la formation d’agrégats cellulaires pour fournir un contact cellule-cellule pro-survie. L’efficacité de l’extraction des fibroblastes de souris dérivés de l’hôte pendant l’étape de rotation xy de 48 h est très élevée, comme décrit dans Fong et autres^5. Les co-cultures intentionnelles de PCa-fibroblast sont certainement faisables, comme nous l’avons démontré, mais nécessitent une matrice accordée (pour soutenir l’adhérence fibroblaste à la matrice) et une plus grande proportion de fibroblastes. Les PDX occasionnels, habituellement ceux avec des caractéristiques plus mésenchymales, adhéreront plus facilement aux surfaces de culture de tissu pendant l’étape de culture de rotation de 48 heures. Les lignées PDX devraient faire l’objet d’une surveillance étroite la première fois que ce protocole est exécuté, et immunotachées pour hna, afin d’identifier la proportion de cellules humaines dans les populations adhérentes et non adhérentes. Les plaques traitées par culture non tissulaire devraient être utilisées pour la formation de grappes avec ces PDX. Les cellules stromales de souris adhéreront toujours éventuellement à la surface, mais la séparation ne sera pas aussi efficace.

Après la culture de rotation, le supernatant contenant la population non adhérente est traité par la méthode décrite de centrifugation de gradient de densité. Le protocole signalé ici peut être simplifié pour exclure au moins une étape de densité (par exemple, en utilisant seulement les solutions de 20%, 40% et 55%), mais tous les quatre devraient être utilisés lors de l’établissement de cette méthode avec chaque nouveau PDX. Les grappes multicellulaires sont facilement séparées des cellules individuelles par cette méthode, et conservent en grande partie leur phénotype groupé et d’autres caractéristiques. La population à cellules individuelles rejetées représente soit (a) les cellules mortes/mourantes avant l’étape de rotation de 48 h, et donc jamais intégrées dans un cluster, ou (b) les cellules qui sont restées vivantes après la rotation de 48 h, mais qui ne se sont toujours pas intégrées dans les grappes. Il est important de noter que le groupe b) peut comprendre des cellules que certains chercheurs trouvent souhaitables; par exemple, certains rapports ont décrit des cultures de cellules primaires contenant des cellules souches/progénitrices précoces, ou des cellules pharmacorésistantes, qui flottent chez les supernatants comme des cellules individuelles mal adhérentes au-dessus d’une population par ailleurs adhérente¹⁰. Pertinents pour les études sur le cancer, les cellules tumorales circulant (CTC), les cellules initiatrices tumorales (CCI) ou d’autres types de cellules similaires favorisant la métastase pourraient faire partie de cette population unicellule. Par conséquent, les chercheurs utilisant notre protocole devraient analyser soigneusement la population de cellules individuelles rejetées pour s’assurer que toutes les cellules d’intérêt n’ont pas été perdues. Dans nos mains, la grande majorité de ces cellules simples sont soit une petite fraction des cellules cancéreuses qui sont morts / mourants en raison du protocole initial de dissociation des tissus, ou fibroblastes rongeurs qui sont déjà en cours à travers anoikis.

Il est fortement recommandé de pratiquer la technique d’ensemencement de la plaque microfluidique avec des cellules moins précieuses pour assurer le succès lorsque vous travaillez avec des matériaux PDX limités et précieux. Soyez conscient du placement de pointe pendant la distribution, car une technique inadéquate est susceptible d’entraîner 1) débordement si la pression est appliquée pendant le chargement, ou 2) canaux vides ou partiellement remplis si la pointe n’est pas centrée sur le port d’entrée. La gelation prématurée fera également en cas de non-remplissage des canaux jusqu’à la fin. Si cela se produit, diminuez le temps d’attente entre l’ajout du crosslinker PEGDA et la distribution de la solution gel, ou travaillez avec de plus petits aliquots de solution de gel à la fois. Les volumes de distribution utilisés dans ce protocole sont bien optimisés pour le succès avec les hydrogels HA. L’utilisation de solutions plus visqueuses telles que Matrigel dans ce système nécessite une augmentation du volume de distribution à ~ 2 μL pour le remplissage approprié des canaux microfluidiques. Notez également que le choix de 50 incréments de μL à l’étape 4.3, la préparation de quatre granulés cellulaires dans cette même étape, et les résuspensions répétées à l’étape 4.10 sont délibérées; bien qu’ils produisent plus de matériel que nécessaire, ils fournissent également un surage pour tenir compte des pertes causées par la pipette répétée.

Il convient de noter que chaque PDX est susceptible d’avoir une morphologie unique et la distribution de la taille dans ce modèle de culture 3D. Dans un sens, ceci est prévu, en raison de la diversité de la maladie patiente, des antécédents de tissu, des paramètres de matrice, et beaucoup d’autres facteurs. Une évaluation expansive des lignes multiples de cancer de la prostate dans Matrigel a démontré cette diversité potentielle^11. Néanmoins, les enquêteurs peuvent être surpris de constater une grande variation des paramètres ci-dessus. Dans un manuscrit en préparation, nous présentons un large regard sur plusieurs PDX sur cette plate-forme culturelle; les cellules maintiennent une réponse cohérente dans chaque type de PDX, mais peuvent varier considérablement d’un spécimen à l’autre, ce qui entraîne des grappes qui sont, par exemple, grandes avec une densité cellulaire élevée par grappe, ou plus petites, avec des connexions intercellulaires plus lâches. Le comportement spécifique de chaque PDX doit être évalué par les chercheurs au cours de plusieurs essais, afin de confirmer une morphologie prévisible et caractéristique. Les chercheurs peuvent s’attendre à ce que les spécimens suivent les comportements généraux décrits dans cet article.

En résumé, le protocole présenté offre aux chercheurs une nouvelle méthode pour l’utilisation de PDXs ex vivo dans une plate-forme qui permet le réglage fin des conditions de culture et l’incorporation de signaux environnementaux 3D pertinents tels que la matrice extracellulaire spécifique aux tissus (ECM) et le flux de perfusion, permettant une survie cellulaire prolongée sur plusieurs jours ou semaines. La caractérisation détaillée de ces cultures a été obtenue par les analyses colorantes et morphologiques démontrées ici. En outre, si nécessaire, les cultures peuvent être soumises à des analyses basées sur des lecteurs de plaques, à l’étiquetage immunofluorescent ou utilisées pour la préparation de lysates permettant une caractérisation moléculaire plus complète. Bien que nous avons publié précédemment certains éléments de la culture PDX 3D au sein des hydrogels, cette application de purification multi-étapes est nouvelle, facile à utiliser dans un laboratoire standard, et a réussi à conserver des cultures représentatives de haute viabilité. La plate-forme OrganoPlate, dans ses variétés à 2 voies et à 3 voies, offre une plus grande complexité grâce à son modèle de perfusion tissulaire, et une occasion clé d’utiliser encore moins de cellules par expérience. Par rapport à nos modèles précédents, la plate-forme microfluidique a réduit les besoins cellulaires d’un facteur de ~30, par expérience, ce qui est un énorme avantage, étant donné la disponibilité rare du tissu tumoral PDX dans la plupart des laboratoires. Le système microfluidique permet l’imagerie étendue, l’immunostaining et l’imagerie facile, à travers une population cellulaire suffisamment grande (n = ~2 000−4 000 cellules par fenêtre d’imagerie) pour permettre la quantification du phénotype dans le contexte de l’organisation spatiale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable