Summary
Vi beskriver her en metode for vekst av Neisseria gonoré i metallbegrenset flytende medium for å lette uttrykket av gener for metallopptak. Vi skisserer også nedstrøms eksperimenter for å karakterisere fenotypen av gonokokker dyrket under disse forholdene. Disse metodene kan tilpasses for å være egnet for karakterisering av metallresponsive gener i andre bakterier.
Abstract
Spormetaller som jern og sink er viktige næringsstoffer kjent for å spille sentrale roller i prokaryotiske prosesser, inkludert genregulering, katalysis og proteinstruktur. Metallsekvestrasjon av verter fører ofte til metallbegrensning for bakterien. Denne begrensningen induserer bakteriell genuttrykk hvis proteinprodukter tillater bakterier å overvinne sitt metallbegrensede miljø. Karakterisering av slike gener er utfordrende. Bakterier må dyrkes i omhyggelig forberedte medier som gir tilstrekkelig tilgang til ernæringsmessige metaller for å tillate bakteriell vekst samtidig som en metallprofil bidrar til å oppnå uttrykk for de nevnte genene. Som sådan må det etableres en delikat balanse for konsentrasjonene av disse metallene. Voksende en ernæringsmessig kresen organisme som Neisseria gonoré, som har utviklet seg til å overleve bare i den menneskelige verten, legger til et ekstra nivå av kompleksitet. Her beskriver vi utarbeidelsen av et definert metallbegrenset medium tilstrekkelig til å tillate gonokokkvekst og det ønskede genuttrykket. Denne metoden gjør det mulig for etterforskeren å chelate jern og sink fra uønskede kilder mens supplere media med definerte kilder til jern eller sink, hvis forberedelse er også beskrevet. Til slutt skisserer vi tre eksperimenter som bruker dette mediet for å karakterisere proteinproduktene til metallregulerte gonokokkgener.
Introduction
Neisseria gonoré forårsaker den vanlige seksuelt overførbare infeksjonen gonoré. Under infeksjon uttrykker patogenne neisseria et repertoar av metallresponsive gener som gjør at bakteriene kan overvinne metallbegrensningsarbeidet til den menneskelige verten1,2,3. Spormetaller som jern og sink spiller sentrale roller i mange cellulære prosesser, for eksempel binding til enzymer i katalytiske steder, deltakelse i redoksreaksjoner og som strukturelle faktorer i ulike proteiner4,5. Under metallbegrensede forhold er metallresponsive loci derepressed og deres resulterende proteiner kan hjelpe oppkjøpet av disse næringsstoffene. Karakterisering av disse genene og proteinene presenterer en unik teknisk utfordring for etterforskeren. Metallioner må holdes tilbake fra bakterier for å indusere transkripsjon av disse genene fra deres innfødte loci, men effektiv chelation av disse ionene fra metallbelastede medier kan være vanskelig å optimalisere. De forskjellige metallprofiler av kildevann og iboende lot-to-lot variasjon6 av pulveriserte ingredienser betyr at mengden chelator som kreves for å fjerne et bestemt metall fra et rikt medium vil variere mellom ulike steder, ingrediensleverandører, og selv over tid i et enkelt laboratorium som kjemisk inventar erstattes.
For å omgå denne utfordringen beskriver vi utarbeidelsen av et definert medium som behandles med Chelex-100 harpiks under forberedelse for å fjerne spormetaller fra løsningen. Dette mediet er tilstrekkelig næringstett for å tillate vekst av gonokokker, noe som er vanskelig å kultur utenfor den menneskelige verten, og gjør det mulig for etterforskeren å innføre en bestemt metallprofil ved å legge til sine egne definerte kilder og konsentrasjoner av Metaller. Metoden for kontrollert add-back av ønskede metaller til utarmet medium øker eksperimentell konsistens og gir mulighet for robuste, replikerbare eksperimenter uavhengig av faktorer som vannkilde og kjemiske partitall. Videre kan dette mediet distribueres som enten en væske eller fast med bare mindre modifikasjoner, noe som gjør det ganske allsidig.
For å demonstrere nytten av dette mediet, skisserer vi en protokoll for bruk for gonokokkvekst og beskriver tre vellykkede eksperimenter for å karakterisere metallresponsive Neisseria gener. For det første forbereder vi gonokokkhelcellelysates fra metallutarmede eller supplerte kulturer og viser variable nivåer av proteinproduksjon fra metallresponsiv loci. Vi skisserer deretter en sinkbegrenset vekstanalyse der gonokokkvekst styres av tilskudd av spesifikke, brukbare sinkkilder. Til slutt viser vi bindende analyser som viser hele gonokokkceller som uttrykker metallresponsive overflatereseptorer som binder seg til sine respektive metallholdige ligander. Vellykket overflatepresentasjon av disse reseptorene krever vekst i metallutarmet medium.
Den nåværende protokollen ble optimalisert spesielt for Neisseria gonoré, men mange andre bakterielle patogener bruker metalloppkjøpsstrategier under infeksjon7, så denne protokollen kan tilpasses for studiet av metall homeostase hos andre bakterier. Optimalisering av disse mediene og disse eksperimentelle protokollene for bruk hos andre bakterier vil sannsynligvis kreve liten endring av metallchelatorkonsentrasjoner og/eller behandlingstid med Chelex-100, da andre bakterier kan ha litt forskjellige metallkrav enn gonokokker. Jern og sink er de primære metallene av bekymring for de beskrevne undersøkelsene, men andre metaller (f.eks. mangan) har blitt demonstrert som kritiske for bakterier, inkludert Neisseria8,9,10,11,12. Videre har lignende metoder blitt beskrevet for metallkarakteriseringer i eukatisk cellekulturarbeid, som også kan vurderes. 13.13 til 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Chelex-behandlet definerte Medium (CDM) Stock Solutions
- Lagerløsning I
- Kombiner NaCl (233,8 g),2K SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g), og KH2PO4 (10,9 g) i deionisert vann til et endelig volum på 1 L.
- Filtrer steriliser oppløsningen og aliquot i 50 ml konisk rør.
- Oppbevares ved -20 °C.
- Lagerløsning II
- Kombiner tiamin HCl (0,2 g), tiaminpyrofosfat-Cl (0,05 g), kalsiumpantothenate (0,19 g) og biotin (0,3 g) i 50 % (vol/vol) etanol til et endelig volum på 1 L.
- Aliquot i 50 ml konisk rør og lagre ved -20 °C.
- Lagerløsning III
- Kombiner L-aspartat (4,0 g), L-glutamat (10,4 g), L-arginin (1,2 g), glycin (0,2 g), L-serin (0,4 g), L-leuccine (0.72 g), L-isoleucin (0,24 g), L-valine (0.48 g), L-tyrosin (0,56 g), L-proline (0.4 g), L-tryptophan (0.64 g), L-threonin (0,4 g), L-fenylalanin (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamin (0,4 g), L-histidine-HCl (0.2 g), L-metionin (0,12 g), L-alanin (0,8 g), L-lysin (0,4 g), og redusert glutation (0,36 g) i 500 ml deionisert vann.
- Oppløs L-cystein (0,44 g) og L-cystin (0,28 g) i et minimalt volum (~ 1 ml) på 1 M HCl og legg til den ovennevnte aminosyreoppløsningen.
- Juster pH-en til oppløsningen med 10 N NaOH til all partikler er oppløst. Den siste pH vil være 10.0-11.0.
- Ta det endelige volumet til 1 L med deionisert vann.
- Filtrer steriliser oppløsningen og aliquot i 250 ml volumer.
- Oppbevares ved -20 °C.
- Lagerløsning IV
- Oppløs glukose (200 g) i deionisert vann til et endelig volum på 1 L.
MERK: Løsningen må kanskje varmes opp for å oppløse glukosen. - Filtrer steriliser og aliquot oppløsningen i 50 ml konisk rør.
- Oppbevares ved -20 °C.
- Oppløs glukose (200 g) i deionisert vann til et endelig volum på 1 L.
- Lagerløsning V
- Kombiner hypoksanthin (5,0 g), uracil (5,0 g) og NaOH (4,0 g) i deionisert vann til et endelig volum på 1 L.
- Filtrer steriliser og aliquot i 50 ml konisk rør.
- Oppbevares ved -20 °C.
- Løsning VI
- Forbered en løsning på 1 M CaCl2-2H2O (147 g/l) i avionisert vann. Filtrer steriliser og oppbevar ved romtemperatur (RT).
- Lagerløsning VII
- Forbered en 1 M vannfri MgSO4-løsning i avionisert vann. Filtrer steriliser og oppbevar på RT.
- Lagerløsning VIII
- Forbered en 1 M NaHCO3-løsning i avionisert vann. Filtrer steriliser og oppbevar på RT.
2. Utarbeidelse av 4x sterilt konsentrat og 1x CDM
MERK: Denne prosedyren skal utføres i enten syrebehandlet sterilt glass eller plast for å forhindre utvasking av metaller i løsningene.
- Kombiner lagerløsninger I (50 ml), II (20 ml), III (250 ml), IV (50 ml) og V (20 ml) med 20,0 g HEPES og rør for å blande.
- Juster pH til 7,4, og ta deretter det endelige volumet til 500 ml med deionisert vann.
- Vask Chelex-100 harpiks i 1 L deionisert vann for å fjerne konserveringsmidler før du legger den til 4x sterilt konsentrat. Gjør dette ved å legge til 50 g harpiks til 1 L deionisert vann og rør i minst 1 time. Fjern vannet ved vakuumfiltrering og bruk denne vasket harpiks en trinn 2.4.
- Tilsett 50 g harpiks og rør sakte i nøyaktig 90 min.
- Fjern harpiks ved filtersterilisering og oppbevar 4x sterilt konsentrat ved 4 °C.
- For å forberede en 1x arbeidskonsentrasjon av CDM, fortynn først 4x konsentrat et sterilt deionisert vann, tilsett deretter løsning VI (125 μL per 500 ml 1x oppløsning), løsning VII (535 μL per 500 ml) og løsning VIII (10 ml per 500 ml).
MERK: Selv om alle lagerløsninger allerede er sterilisert, anbefales det å filtrere sterilisere 1x-oppløsningen igjen etter tilberedning.
3. Utarbeidelse av CDM-plater
MERK: Oppskriften nedenfor lager 1 L-medier for plater, men det er best å forberede disse i mindre volumer. Alt skaleres proporsjonalt ned.
- Vasket agarose
- Løs opp 50 g agarose i 1 L deionisert vann, rør i 1 t.
- Overfør løsningen til en sentrifugeflaske og sentrifuge på 1200 x g i 15 min ved RT. Hell forsiktig av supernatanten og kast.
- Tilsett tilstrekkelig deionisert vann for å suspendere den agarose pellet, og deretter overføre til en 1 L kolbe. Ta et endelig volum på 1 L med deionisert vann og rør og sentrifuge som i trinn 3.1.2. Kast supernatanten.
- Tilsett tilstrekkelig 100% etanol for å suspendere pelleten på nytt, og overfør deretter til en ny 1 L kolbe. Ta til et endelig volum på 1 L med etanol. Rør og sentrifuge som i trinn 3,1,2.
- Gjenta trinn 3.1.4.
- Legg metanol til agarose pellet å resuspend, deretter overføre til en 1 L kolbe. Ta til et endelig volum på 1 L med metanol. Rør og sentrifuge som i trinn 3,1,2.
- Gjenta trinn 3.1.6.
- Overføring vasket agarose til et brett foret med aluminiumsfolie og la tørke i en røykhette. Når den er tørr, må du overføre til en metallfri beholder for langtidslagring.
- Tilsett 10 g vasket agarose og 5 g potetstivelse til 750 ml deionisert vann.
- Autoklav i 30 min ved 121 °C, 100 kPa over atmosfærisk trykk.
- Tillat media å avkjøles til ~ 65 ° C, og legg deretter til 250 ml 4X CDM, 250 μL løsning VI, 1,07 ml løsning VII og 20 ml oppløsning VIII.
- Hvis ønskelig, tilsett metaller av valget før helle plater. Tilsetning av chelatorer er ikke nødvendig for å opprettholde metallfrie forhold.
- Hell i Petri retter og la det stivne.
4. Metall begrenset vekst av Neisseria gonoré
MERK: For de fleste bruksområder er det ikke nødvendig å metallstresse bakteriene før inokulasjon av CDM. Det første dobletrinnet i CDM og den påfølgende fortynningen er tilstrekkelig til å tømme gonokokker i sine interne jern- og sinkbutikker. Som sådan utføres de to første trinnene i følgende prosedyre ved hjelp av agarplater laget av GC medium base som er supplert med Kelloggs supplement I14 og 12,5 μM Fe (NO3)3. Hvis tidlig metallstress er ønsket, anbefaler vi at du tilbereder GC-mellombaserte baseplater uten Fe(NO3)3 og med 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) etylendiamin) for sinkchelasjon eller 10 μM deferoxamin for jernchelation. All inkubasjon utføres ved 37 °C med 5 % CO2.
- To dager før eksperimentet, på dag -2, strek gonococci fra fryser aksjer på GC medium plater og inkubere for ikke mer enn 24 h.
- På dag -1, strek enkelt kolonier på friske GC mellomplater. Prøv å gjøre dette 14-16 h før veksteksperimentet.
- På dagen for eksperimentet, legg til 5-10 ml 1x CDM til en syre vasket 125 ml hvelvet sidearm kolbe (Tilleggsfigur 1) og bruk dette til å tømme en Klett colorimeter.
- Bruk en steril, bomull-tippet vattpinne for å inokulere CDM fra sunne, enkle kolonier. Sikt på 20 Klett-enheter.
MERK: Hvis et Klett-fargemåler ikke er tilgjengelig, er et spektrosofom også egnet. Det finnes ingen universell konverteringsformel for Klett-enheter til OD, men en grov guide er tilgjengelig (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Inkuber med risting på 250 o/min til omtrent en massedobling (40 Klett-enheter). Dette bør ta mellom 1-2 h.
- På dette punktet er kulturene tilbake fortynnet ved tillegg av et tilstrekkelig volum av CDM for å nå halvparten av den opprinnelige kulturtettheten (f.eks. hvis 5 ml kultur har gått fra 20 til 40 Klett enheter, vil 15 ml CDM bringe den tilbake til 10 Klett enheter) og veksten vil fortsette som i trinn 4.5. Den spesifikke mengden ryggfortynning, metallbehandlinger, etc. avhenger av nedstrøms applikasjoner. Vi gir tre eksempler nedenfor (avsnitt 5, 6 eller 7).
5. Western analyse av metall responsive genprodukter
- Fra trinn 4.6, back fortynne kulturer med tre volumer av CDM (f.eks. 15 ml CDM hvis du starter med 5 ml). På dette punktet, legg til metallbehandlinger hvis ønskelig.
- Jern-sensing gener kan derepressed med 12,5 μM Fe (NO3)3. Sink-responsive gener kan være derepressed med 10 μM ZnSO4.
- Ekstra jern- eller sinkstress er ikke nødvendig, da mediene allerede er utarmet, så responsive gener vil allerede bli uttrykt. Hvis det er ønsket ytterligere stress, anbefaler vi ikke mer enn 1–2 μM deferoksamin eller TPEN, da overdreven stress vil hindre kulturer i å vokse.
- Vokse kulturer som i trinn 4,5 for 4 h og registrere den endelige celletettheten av prøvene. Mindre metallstressede kulturer vil vokse til høyere endelige tettheter.
- Standardiser kulturer til en passende tetthet og forberede lysates.
- Standardiser helcellelysates til en tetthet tilsvarende 100 Klett enheter i 1 ml kultur. For å oppnå dette, del 100 ved Klett-enhetstettheten til prøven. Tallet du får er volumet, i ml, av kultur som vil bli brukt til å lage cellen pellet.
- Følg standard SDS-PAGE og Western blotting prosedyrer15 for å undersøke for proteiner av interesse.
6. Metallbegrenset vekstanalyser
MERK: Disse analyser beskriver premade vekst premikser. Utarbeidelsen av disse blandingene er beskrevet i avsnitt 8.
- Under massedoblingen i trinn 4,5, pretreat brønnene i en 96 brønn mikroplate med 10x premikser. I tillegg utpeke tre brønner for å tjene som blanks. Til disse brønnene tilsett 10 μL 10x premix og 90 μL CDM.
- Når kulturene i sidearmkolber har doblet, legg til 100 μL av hver kultur til en ubrukt brønn i mikroplaten og mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600). Dette kan gjøres med cuvettes i et spektrosofometer, men med større antall stammer i en analyse kan dette bli tungvint og anbefales vanligvis ikke med mindre spektrofotometeret ditt kan måle direkte fra armen på sidearmkolben (Tilleggsfigur 2).
- Mens du måler OD, plasser kolbene tilbake i inkubatoren for å sikre at gonococci forblir levedyktig.
- Beregn riktig mengde fortynning som kreves for å bringe kulturene til OD600 = 0,02. 10x premikser har en ubetydelig effekt på OD og kan utelates fra beregningen.
- Fortynn kulturer med CDM i små kulturrør og tilsett tilstrekkelig volum for å fortynne 10x premixer til 1x i platen. Hvis en platevarmer er tilgjengelig, må du holde platen ved 37 °C mens du arbeider.
- Inkuber platen i 8–12 timer med risting i en plateleser, og ta OD600 målinger med ønskede intervaller.
7. Påvisning av Ligand Binding av Ytre Membran Metall Transportører
- Behandle kulturer som ønsket som i trinn 5.1, deretter inkubere med risting i 4 timer.
- Kort tid før 4 h-merket, kutt tre stykker filterpapir og et stykke nitrocellulose til omtrentlig størrelse som trengs for å passe inn i et punktblotapparat (Tilleggsutstyr ( Tilleggsmessig figur 3). Presoak nitrocellulose i deionisert vann, og monter deretter apparatet med filterpapir under nitrocellulose.
- Ved 4 timer registrerer du celletetthetene og standardiserer til en passende endelig tetthet. Det anbefales å bruke ~ 10% av tettheten som brukes til fremstilling av cellelysates i trinn 5. For eksempel, hvis du bruker 100 KU i 1 ml for lysates, betyr dette ~ 10 KU i 1 ml for disse blots. Beregningen er ellers den samme som beskrevet i 5.3.1, og kulturer legges direkte til nitrocellulose i de beregnede volumene i stedet for gjort til lysates.
- Pipet celle kulturer på nitrocellulose og la tilstrekkelig tid for filterpapiret til å absorbere all væsken.
- Demonter apparatet, la flekken tørke, og blokkere nitrocellulosemembranen i 1 t i 5% storfe serumalbumin eller fettfri melk (w/v) i Tris-bufret saltvann.
- Sett sammen punktblotapparatet på nytt, og skift ut filterpapiret med parafinfilm for å skape en lekkasjesikker forsegling under nitrocelluloseet.
- Fortynn metallbindende ligand av interesse til 0,2 μM i blokkerings- og probeceller i 1 t.
- Siphon av væsken med et vakuum, vask blot, følg deretter standard immunologiske prosedyrer for å utvikle signalet16. Vasketrinnene kan gjøres i eller utenfor apparatet.
8. Metalllasting av Transferrin, S100A7 og Calprotectin, og tilberedning av 10x Premixer
MERK: Som med CDM-preparat, bruk syrevasket glass eller plast til løsningsforberedelse.
- Oppløs human transferrin ved 10 mg/ml (125 μM) i innledende buffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8,4). S100A7 og calprotectin er suspendert i buffer bestående av 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, og 1 mM CaCl2, pH = 8.0).
- Tilsett ferration oppløsning (100 mM natriumsitrat, 100 mM NaHCO3,5 m M FeCl3-6H2O, pH = 8,4) til transferrin oppløsning for å oppnå 30% jernmetning (f.eks. 75 μL ferration løsning er egnet for 5 ml transferrin hvis gjort ved 10 mg / ml).
- Legg ZnSO4 til S100A7 eller calprotectin med et 50% molar forhold til proteinet for å skape 25% metning (hvert proteinmolekyl har to metallbindingssteder). Preparater på 100 μM S100A7 eller calprotectin med 50 μM ZnSO4 kan brukes.
- For begge tilfeller, la end-over-end blanding i minst 1 t for metall lasting.
- Forbered 4 L dialysebuffer (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3,pH = 7,4). Del dette i to separate 2 L volumer og plasser en ved 4 °C.
- Tilsett metallbelastede proteiner i en dialysekassett ved hjelp av en sprøyte og dialyze mot det første buffervolumet i 4 timer ved RT.
- Flytt kassetten til det andre buffervolumet og dialyze over natten ved 4 °C. Etter disse trinnene bør eventuelle ubundne metaller fjernes.
MERK: Vi anbefaler en bicinchoninic acid analyse for å bestemme proteinkonsentrasjoner etter dialyse. - Bruk en 10x transferrin premix for overføringi utnyttelse som en eneste jernkilde.
- Forbered denne premixen ved å fortynne 30 % humant Fe-transferrin og storfe apo-transferrin (utarbeidet ved 125 μM som beskrevet for humantransferrin, uten jernbelastningstrinn) til henholdsvis 75 μM og 30 μM i PBS. En positiv kontroll premix erstatter 30% Fe-transferrin med 75 μM Fe (NO3)3,og en negativ kontroll premix utelater noe ekstra jern, beholder bare storfe apo-transferrin. I vekstanalysen fortynnes du 10 μL av disse konsentratene med 90 μL kultur. Endelige konsentrasjoner er 7,5 μM 30% human Fe-transferrin og 3 μM storfe apo-transferrin.
- Bruk en modifisert versjon av transferrin 10x premix for S100A7 eller calprotectin utnyttelse som en eneste sink kilde.
- For en positiv kontroll premix, innlemme 50 μM ZnSO4 i transferrin premix. For en negativ kontroll, innlemme 50 μM TPEN og utelate sink. Deretter tar du 10 μL av hver av disse for hver prøve godt nødvendig, og flytt det volumet til et nytt rør. Legg til denne halvdelen så mye volum av sterile PBS. For eksempel, hvis 10 brønner vil motta den positive kontrollpremixen, ta 100 μL premix, flytt den til et nytt rør, og tilsett 50 μL PBS. Gjør det samme for den negative kontrollen.
- For å gjøre S100A7 eller calprotectin premix, ta 10 μL av den negative kontrollen premix per godt nødvendig, flytte til et nytt rør, og legge til halvparten av det volumet av 25% Zn-S100A7 eller calprotectin. I vekstanalysen bruker du 15 μL formix og fortynn med 85 μL kultur. Endelige konsentrasjoner for transferrinene forblir de samme som i trinn 8,5, med en ekstra 5 μM zn, TPEN eller S100A7/calprotectin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et spesifikt definert medium i fravær av spormetaller for veksten av Neisseria gonoré ble utviklet og implementert for karakterisering av metallresponsive gener og deres genprodukter. I den optimaliserte protokollen styres metallprofilen til media ved å legge til metaller tilbake etter etterforskerens skjønn, i stedet for ved titreratisert chelation av et metallmål, noe som åpner for økt kontroll og konsistens fra lab til lab og eksperiment for å eksperimentere. Dette mediet kan brukes i både flytende og fast tilstand, noe som gjør det allsidig på tvers av mange eksperimentelle oppsett.
Differensialproteinproduksjon i variable metallkonsentrasjoner kan ses i den medfølgende representanten vestlige blots (Figur 1). Bildet viser de sinkresponsive yttermembrantransportørene TdfJ og TdfH, som ble oppregulert som svar på sinkchelation av TPEN. TdfJ var i hovedsak umulig å oppdage da sink ble lagt tilbake til media, og TdfH var knapp. Videre er tdfJ-arrangøren kjent for å bli indusert, i stedet for undertrykt, av jern. Dette er også synlig i blot. Disse blots benyttet jern-responsive lipoprotein TbpB2 som en lasting kontroll. Under forholdene for jernadd-back ble TbpB-produksjonen redusert.
Metallbegrenset vekstanalyser viser utnyttelseav spesifikke, definerte sinkkilder av gonokokkene (figur 2). Figur 2A viser N. gonoré vokser i nærvær av Zn-lastet calprotectin (CP), som krever virkningen av sink-responsive TdfH17,18. Når ingen brukbar sinkkilde var tilgjengelig, enten gjennom ingen sinkadd-back eller ved fravær av TdfH, var veksten begrenset. Figur 2B viser lignende resultater i nærvær av S100A7, som kan tjene som en eneste sinkkilde når den ytre membrantransportøren TdfJ produseres19. I nærvær av TPEN alene eller når TdfJ var fraværende, ble veksten hemmet, men tillegg av Zn-S100A7 gjenvunnet vekst på en TdfJ-avhengig måte. Til slutt viser figur 2C en eksperimentell feil. I dette eksemplet var fortynningstrinnet i gonokokkkulturene ikke tilstrekkelig til å tømme bakteriene i interne sinkbassenger i forhold til det totale kulturvolumet i mikroplaten. Som sådan, veksten i den negative kontrollen overskredet ønsket OD.
Spesifikk binding av hele gonokokkceller til sine respektive ligander er demonstrert av prikkblots fra kulturer utarbeidet i metallbegrensende og metallfylte forhold (figur 3). Figur 3A,B viser at gonokokker dyrket i CDM var i stand til å binde CP og S100A7 når du produserer TdfH og TdfJ, henholdsvis som følge av sink knapphet. Figur 3C sammenligner transferrin binding, som oppnås av de kognate proteiner laget av jern-sensing gener tbpA og tbpB20, når gonococci dyrkes i CDM alene vs GC medium kjøttkraft behandlet med jern chelator deferoxamine. Dette tallet viser økt binding av transferrin av kulturer dyrket i CDM, noe som indikerer høyere nivåer av proteinuttrykk på grunn av den mer jernarme natur CDM sammenlignet med chelated GC kjøttkraft.
Figur 1: Representativ vestlig blot som viser differensialproduksjon av metallresponsive proteiner. (A) Neisseria gonoré vill type belastning FA19 ble dyrket i CDM supplert med ZnSO4,Fe (NO3)3,eller TPEN i de angitte konsentrasjonene. Etter behandling ble kulturer dyrket i 4 timer før helcellelysater av standardisert tetthet ble produsert og utsatt for SDS-PAGE og vestlig flekking. Differensialproduksjonsnivåer for TdfJ, som både er undertrykt av sink og indusert av jern, kan tydelig ses som svar på sink addisjon / uttømming og jern tillegg. (B) Relativ signalintensitet for den vestlige blot ble kvantitet via densitometri. Dette tallet er tilpasset fra Maurakis et al19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sinkbegrenset vekst av gonokokker. Wild type belastning FA19, eller isogene mutanter av denne belastningen som ikke produserer tdfJ eller tdfH, ble dyrket i (A) ubehandlet CDM til eksponentiell fase ble nådd, (B) deretter tilbake fortynnet til OD600 = 0,02 og (C) OD600 = 0,1. Prøvene i A ble behandlet med premix som inneholdt calprotectin (øverst) eller ingen tilsatt sink (bunn) og dyrket i 8 timer. Prøvene i B og C ble supplert med premix som inneholdt gratis sink, ingen sink (5 μM TPEN), eller S100A7, og dyrket i 6 timer. Vekst i disse forholdene ble bare gjenopprettet ved tilskudd av medier med en brukbar sinkkilde, som CP, S100A7, eller gratis sink i A og B,mens C ikke var tilstrekkelig utvannet for å tømme interne cellulære sinkbassenger. Figur 2A er tilpasset fra Jean et al.17Figur 2B er tilpasset fra Maurakis et al19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative bindende analyser viser verten ligands binding til metall-stresset gonococci. (A) Wild type belastning FA1090, eller mutanter av denne belastningen som ikke produserer tdfJ, tdfH, eller begge, ble dyrket i CDM uten supplerende metaller og ble stiplet på nitrocellulose i standardiserte tettheter. Celler ble undersøkt med calprotectin, som gjenkjennes av sink-responsive TdfH, og binding ble vurdert ved deteksjon med et anti-calprotectin antistoff (topp). Relativ calprotectin binding ble kvantitet via densitometri, vist her på en loggskala (nederst). (B) Bindende eksperimenter ble utført som beskrevet i A, men i stedet ved hjelp av FA19 villtype belastning og tdfJ mutant og supplert stammer i den bakgrunnen. Celler ble undersøkt med HRP-merket S100A7, som er anerkjent av sink-responsive TdfJ. (C) Wild type belastning FA19 ble dyrket side om side i CDM eller GC medium kjøttkraft med 25 μM deferoxamin lagt til chelate gratis jern, prikket til nitrocellulose i standardiserte mengder, og probed med transferrin, som binder jernfølsom TbpA. Disse side-ved-side tester viser at CDM, i motsetning til GC medium kjøttkraft, krevde ingen ekstra chelation for å oppnå et jernbegrenset miljø. Figur 3A er tilpasset fra Jean et al. og bunnen fra Maurakis et al19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall 1. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall figur 2. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall figur 3. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vekstmedia tjener en rekke roller i mikrobiologisk forskning. Spesialiserte medier brukes til valg, berikelse og ulike andre bruksområder for mange unike typer studier. En slik applikasjon er induksjon av metallresponsive gener, som vanligvis oppnås ved tillegg av en bestemt chelator som retter seg mot en bestemt metallion. Denne metoden er begrenset, da mengden chelation som er nødvendig for ulike spormetaller, sannsynligvis vil være variabel på grunn av forskjellige vannkilder som inneholder unike metallprofiler, og to masse av samme medieingrediens som inneholder forskjellige metallkonsentrasjoner6. For å unngå denne iboende mangelen har vi beskrevet forberedelseog bruk av et definert medium som behandles med Chelex-100 harpiks for å fjerne alle spormetaller i bulk, slik at kontrollert tilsetning av spesifiserte metaller tilbake i mediet etter behov.
I gjeldende protokoll er det første viktige diskusjonspunktet kildevannet. Protokollen beskriver en Chelex-behandling som er tilstrekkelig til å fjerne metaller fra laboratoriet Type 2 (1,0 megaOhms-cm i henhold til ISO 3696 spesifikasjoner) vann. Ulike vannkilder vil sannsynligvis kreve kortere eller lengre Chelex behandlinger. Vi har funnet ut at vann med høyere renhet enn type 2, som molekylærbiologi klasse vann, ikke vil støtte bakteriell vekst i dette programmet. Valget av fartøy for medieforberedelse er like viktig som vannkilden. Vi anbefaler rent plastbeholdere på det sterkeste, da glass kan leach metallioner inn i løsningen. Hvis plastvar ikke er tilgjengelig, må glass vaskes for å minimere forurensningsrisiko. Den samme syrevasker kreves for kulturflasker ved bruk av CDM.
Veksten av Neisseria gonoré i en in vitro-setting kan være ganske utfordrende, da denne organismen har utviklet seg til å trives spesielt i menneskelige verter21. Mens CDM er egnet til å støtte vekst i løpet av eksperimenter, må det tas hensyn under inokulasjons- og fortynningstrinnene for å sikre at gonokokker ikke er i atmosfæriske forhold lenger enn nødvendig. På grunn av den kapofiliske natur gonococci22 og dens forkjærlighet for temperaturer som finnes i menneskelige verter, anbefaler vi ikke å holde kulturer i atmosfæriske forhold lenger enn ~ 15 min. Hvis den første massedoblingshendelsen som er beskrevet i trinn 4,5 av metoden tar lengre tid enn 2 timer, er det sannsynlig at gonokokkkulturer ikke har blitt håndtert riktig og eksperimentet bør avbrytes.
Mens fokuset på denne metoden er på metoder for vekst og karakterisering av Neisseria gonoré spesielt, er bruk av denne spesifikke CDM sannsynligvis også egnet for studier av andre Neisseria arter. Videre kan det lett brukes på karakterisering av andre metall-sensing systemer i andre bakterier. For eksempel har et lignende metallfritt medium blitt brukt til å karakterisere metallopptak i Staphylococcus aureus23 og Escherichia coli24. Utnyttelse av den beskrevne oppskriften på andre bakterier vil sannsynligvis innebære små modifikasjoner eller tillegg, avhengig av de spesifikke ernæringsmessige behovene til de aktuelle bakteriene. For eksempel er supplement VIII inkludert i oppskriften for å hjelpe til med gonococcus behov for supplerende CO2. Som beskrevet ovenfor utføres veksten ved 37 °C med en 5% CO2 atmosfære, men vi har funnet ut at tillegg av supplerende bikarbonat i media hjelpemidler de første stadiene av gonokokkvekst i definert medium. For organismer uten et slikt krav kan denne ingrediensen utelates. Dessverre må ytterligere eksempler på disse endringene bestemmes empirisk.
Til tross for behovet for å tilpasse metoden noe for bruk med andre bakterier, bør det grunnleggende rammeverket være hensiktsmessig for bred bruk. Karakterisering av metallresponsive gener og metalltransportører er en pågående bestrebelse ren i mikrobiell studie, med bakterier, inkludert Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30, og E. coli31 alle får oppmerksomhet i denne nisjen. Vår egen fremtidige utnyttelse av denne teknikken vil sikte på å fremme forståelsen av andre gonokokkmetallopptakssystemer utover de som allerede er nevnt, som tillater gonokokker å skaffe jern fra vertsproteiner som laktoferrin32,33,hemoglobin34,35, og også fra bakterielle xenosiderophores36, og å utvide våre studier til effekten av andre metaller som mangan, som har vært innblandet i oksidativt stressforsvar av Neisseria12,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendene R01 AI125421, R01 AI127793 og U19 AI144182. Skriveforfatteren vil gjerne takke alle laboratoriemedlemmer som bidro til korrekturlesing og gjennomgang av denne metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
