Summary
Vi beskriver her en metode til vækst af Neisseria gonorrée i metal-begrænset flydende medium for at lette ekspressionen af gener for metaloptagelse. Vi skitserer også downstream eksperimenter for at karakterisere fænotype af gonococci dyrket under disse betingelser. Disse metoder kan tilpasses til at være egnet til karakterisering af metal-responsive gener i andre bakterier.
Abstract
Trace metaller såsom jern og zink er vitale næringsstoffer kendt for at spille centrale roller i prokaryotiske processer, herunder genregulering, katalyse, og protein struktur. Metal binding af værter fører ofte til metal begrænsning for bakterien. Denne begrænsning inducerer bakterielgen udtryk, hvis proteinprodukter tillader bakterier at overvinde deres metal-begrænset miljø. Karakterisering af sådanne gener er udfordrende. Bakterier skal dyrkes i omhyggeligt tilberedte medier, der giver tilstrækkelig adgang til ernæringsmæssige metaller til at tillade bakterievækst og samtidig opretholde en metalprofil, der fremmer at opnå ekspression af de førnævnte gener. Som sådan skal der skabes en hårfin balance for koncentrationerne af disse metaller. Dyrkning af en ernæringsmæssigt kræsen organisme som Neisseria gonorrée, som har udviklet sig til at overleve kun i den menneskelige vært, tilføjer en ekstra grad af kompleksitet. Her beskriver vi præparatet af et defineret metalbegrænset medium, der er tilstrækkeligt til at muliggøre gonokokvækst og det ønskede genekspression. Denne metode gør det muligt for investigator at chelate jern og zink fra uønskede kilder, mens supplere medierne med definerede kilder til jern eller zink, hvis præparat er også beskrevet. Endelig skitserer vi tre eksperimenter, der udnytter dette medie til at hjælpe med at karakterisere proteinprodukter fra metalregulerede gonokokgener.
Introduction
Neisseria gonorrée forårsager den almindelige seksuelt overførte infektion gonoré. Under infektion, patogene Neisseria udtrykke et repertoire af metal-responsive gener, der gør det muligt for bakterier til at overvinde metal begrænsning indsats af den menneskelige vært1,2,3. Trace metaller som jern og zink spiller centrale roller i mange cellulære processer, såsom binding til enzymer i katalytiske steder, deltagelse i redox reaktioner, og som strukturelle faktorer i forskellige proteiner4,5. Under metalbegrænsende forhold er metal-responsive loci derepressed og deres resulterende proteiner kan støtte erhvervelsen af disse næringsstoffer. Karakterisering af disse gener og proteiner udgør en unik teknisk udfordring for investigator. Metalioner skal tilbageholdes fra bakterier for at fremkalde transskription af disse gener fra deres indfødte loci, men effektiv kelation af disse ioner fra metal-laden medier kan være svært at optimere. De forskellige metalprofiler af kildevand og iboende lot-to-lot variation6 af pulveriserede ingredienser betyder, at mængden af chelator, der kræves for at fjerne et bestemt metal fra et rigt medie, vil variere mellem forskellige steder, ingrediensleverandører, og endda over tid inden for et enkelt laboratorium, da den kemiske beholdning udskiftes.
For at omgå denne udfordring beskriver vi udarbejdelsen af et defineret medium, der behandles med Chelex-100 harpiks under tilberedningen for at fjerne spormetaller fra opløsningen. Dette medium er tilstrækkeligt næringsstoftæt til at muliggøre vækst af gonococcus, som er vanskeligt at kultur uden for den menneskelige vært, og gør det muligt for investigator at indføre en specifik metalprofil ved at tilføje deres egne definerede kilder og koncentrationer af Metaller. Metoden til kontrolleret add-back af ønskede metaller til forarmet medium øger eksperimentel konsistens og giver mulighed for robuste, replikerbare eksperimenter uanset faktorer såsom vandkilde og kemiske partinumre. Desuden kan dette medie anvendes som enten en væske eller fast med kun mindre ændringer, hvilket gør det ganske alsidigt.
For at demonstrere nytten af dette medie, skitserer vi en protokol for dets anvendelse for gonokok vækst og beskrive tre vellykkede eksperimenter til at karakterisere metal-lydhør Neisseria gener. For det første forbereder vi gonokok hele celle lysates fra metal-forarmet eller suppleret kulturer og demonstrere variable niveauer af proteinproduktion fra metal-responsive loci. Vi skitserer derefter en zink-begrænset vækst analyse, hvor gonokok vækst styres ved tilskud af specifikke, brugbare zink kilder. Endelig viser vi bindende analyser, der viser hele gonokokceller, der udtrykker metalresponsive overfladereceptorer, der binder sig til deres respektive metalholdige ligander. Vellykket overfladepræsentation af disse receptorer kræver vækst i metal-forarmet medium.
Den nuværende protokol blev optimeret specielt til Neisseria gonorrée, men mange andre bakterielle patogener anvender metal erhvervelse strategier under infektion7, så denne protokol kan tilpasses til studiet af metal homøostase i andre bakterier. Optimering af dette medie og disse eksperimentelle protokoller til brug i andre bakterier vil sandsynligvis kræve let ændring af metal chelator koncentrationer og / eller behandlingstid med Chelex-100, som andre bakterier kan have lidt forskellige metal krav end gonococcus. Jern og zink er de primære metaller, der giver anledning til bekymring i forbindelse med de beskrevne undersøgelser, men andre metaller (f.eks. mangan) er blevet påvist som kritiske for bakterier, herunder Neisseria8,9,10,11,12. Desuden er lignende metoder blevet beskrevet for metal karakteriseringer i eukaryotiske celle kultur arbejde, som også kan overvejes. 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af Chelex-behandlede definerede medium (CDM) Stock Solutions
- Lagerløsning I
- Kombiner NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) og KH2PO4 (10,9 g) i deioniseret vand til en endelig volumen på 1 L.
- Filter steriliseropløsningen og aliquot i 50 ml koniske rør.
- Opbevares ved -20 °C.
- Aktieløsning II
- Kombiner thiamin HCl (0,2 g), thiamin pyrophosphat-Cl (0,05 g), calcium pantothenate (0,19 g), og biotin (0,3 g) i 50% (vol/vol) ethanol til et endeligt volumen på 1 L.
- Aliquot i 50 ml koniske rør og opbevares ved -20 °C.
- Lagerløsning III
- Kombiner L-aspartat (4,0 g), L-glutamat (10,4 g), L-arginin (1,2 g), glycin (0,2 g), L-serin (0,4 g), L-leucin (0,7 2 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosin (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophan (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-phenylalanin (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamin (0,4 g), L-histidin-HCl (0.. 2 g), L-methionin (0,12 g), L-alanin (0,8 g), L-lysin (0,4 g) og reduceret glutathion (0,36 g) i 500 ml deioniseret vand.
- L-cystein (0,44 g) og L-cystin (0,28 g) opløses i et minimalt volumen (~1 ml) på 1 M HCl og tilsættes til ovennævnte aminosyreopløsning.
- Opløsningens pH justeres med 10 N NaOH, indtil alle partikler er opløst. Den endelige pH vil være 10,0-11,0.
- Bring det endelige volumen til 1 L med deioniseret vand.
- Filter steriliseropløsningen og aliquot i 250 ml volumener.
- Opbevares ved -20 °C.
- Aktieløsning IV
- Opløs glukose (200 g) i deioniseret vand til et endeligt volumen på 1 L.
BEMÆRK: Det kan være være ophedet, at opløsningen opløses for at opløse glukose. - Filter steriliseres og aliquot opløsningen i 50 ml koniske rør.
- Opbevares ved -20 °C.
- Opløs glukose (200 g) i deioniseret vand til et endeligt volumen på 1 L.
- Lagerløsning V
- Kombiner hypoxanthin (5,0 g), uracil (5,0 g) og NaOH (4,0 g) i deioniseret vand til en endelig volumen på 1 L.
- Filter steriliseres og aliquot i 50 ml koniske rør.
- Opbevares ved -20 °C.
- Løsning VI
- Der fremstilles en 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) opløsning i deioniseret vand. Filtrer steriliseres og opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Aktieløsning VII
- Der fremstilles en 1 M vandfri MgSO4-opløsning i deioniseret vand. Filtrer steriliser og opbevares på RT.
- Lagerløsning VIII
- Forbered en 1 M NaHCO3 løsning i deioniseret vand. Filtrer steriliser og opbevares på RT.
2. Forberedelse af 4x sterilt koncentrat og 1x CDM
BEMÆRK: Denne procedure skal udføres i enten syrebehandlet sterilt glaseller plast for at forhindre udvaskning af metaller i opløsningerne.
- Kombiner aktieopløsninger I (50 ml), II (20 ml), III (250 ml), IV (50 ml) og V (20 ml) med 20,0 g HEPES og rør til at blande.
- Juster pH til 7,4, og bring derefter det endelige volumen til 500 ml med deioniseret vand.
- Vask Chelex-100 harpiks i 1 L deioniseret vand for at fjerne konserveringsmidler, før du tilføjer det til 4x sterile koncentrat. Gør dette ved at tilsætte 50 g harpiks til 1 L deioniseret vand og omrøring i mindst 1 time. Fjern vandet ved vakuumfiltrering og brug denne vaskede harpiks til trin 2.4.
- Tilsæt 50 g harpiks og rør langsomt i præcis 90 min.
- Harpiksen fjernes ved filtersterilisering, og det 4x sterile koncentrat opbevares ved 4 °C.
- For at forberede en 1x arbejdskoncentration af CDM skal 4xkoncentratet fortyndes med sterilt deioniseret vand, og opløsning VIII (125 μL pr. 500 ml 1x opløsning), opløsning VII (535 μL pr. 500 ml) og opløsning VIII (10 ml pr. 500 ml).
BEMÆRK: Selv om alle stamopløsninger allerede er steriliseret, anbefales det at filtrere sterilisere 1x opløsningigen efter klargøring.
3. Udarbejdelse af CDM-plader
BEMÆRK: Opskriften nedenfor gør 1 L medier til plader, men det er bedst at forberede disse i mindre mængder. Alt skaleres proportionalt.
- Vasket agarose
- 50 g agarose opløses i 1 L deioniseret vand under omrøring i 1 time.
- Opløsningen overføres til en centrifugeflaske og centrifuger ved 1.200 x g i 15 min. Forsigtigt hæld supernatanten af og kassér.
- Tilsæt tilstrækkeligt deioniseret vand til at ophænge agarosepelletigenet igen og derefter overføres til en 1 L-kolbe. Bring til en endelig volumen på 1 L med deioniseret vand og derefter røre og centrifuge som i trin 3.1.2. Kassér supernatanten.
- Tilsæt tilstrækkelig 100% ethanol til at ophænge pellet, derefter overføre til en ny 1 L kolbe. Bring til et endeligt volumen på 1 L med ethanol. Rør og centrifuge som i trin 3.1.2.
- Gentag trin 3.1.4.
- Tilsæt methanol til agarose pellet at resuspendere, derefter overføre til en 1 L kolbe. Bring til et endeligt volumen på 1 L med methanol. Rør og centrifuge som i trin 3.1.2.
- Gentag trin 3.1.6.
- Overførsel vasket agarose til en bakke foret med aluminiumsfolie og lad det tørre i en røg hætte. Når den er tør, overføres den til en metalfri beholder til langtidsopbevaring.
- Tilsæt 10 g vasket agarose og 5 g kartoffelstivelse til 750 ml deioniseret vand.
- Autoklave i 30 min ved 121 °C, 100 kPa over atmosfærisk tryk.
- Lad mediet køle af til ~65 °C, og tilsæt derefter 250 ml 4X CDM, 250 μL opløsning VI, 1,07 ml opløsning VII og 20 ml opløsning VIII.
- Hvis det ønskes, tilsæt de foretrukne metaller, før der hældes plader. Tilsætning af chelatorer er ikke nødvendig for at opretholde metalfri forhold.
- Hæld i petriskåle og lad det størkne.
4. Metal begrænset vækst af Neisseria gonorrée
BEMÆRK: For de fleste anvendelser, er det ikke nødvendigt at metal stress bakterierne før inokulering af CDM. Det første fordoblingstrin i CDM og den efterfølgende fortynding er tilstrækkelig til at nedbryde gonococci af deres interne jern- og zinklagre. Som sådan udføres de første to trin i følgende procedure ved hjælp af agarplader fremstillet af GC medium base, der er blevet suppleret med Kellogg's tillæg I14 og 12,5 μM Fe (NO3)3. Hvis der ønskes tidlig metalstress, anbefaler vi, at GC-mellemgrundsplader ne tilberedes uden Fe(NO3)3 og med 5 μM TPEN (N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamin) til zinkchelation eller 10 μM deferoxamin til jernchelation. Al inkubation udføres ved 37 °C med 5% CO2.
- To dage før forsøget, på dag -2, streak gonococci fra fryser lagre på GC medium plader og inkubere for ikke mere end 24 timer.
- På dag -1, stribe enkelte kolonier på friske GC mellemstore plader. Prøv at gøre dette 14-16 h før væksteksperimentet.
- På dagen for forsøget, tilsættes 5-10 ml 1x CDM til en syre vasket 125 ml forbløffet sidearm kolbe (supplerende figur 1) og bruge dette til at tømme en Klett colorimeter.
- Brug en steril, bomuldsspidspodning til at vaccinere CDM fra sunde, enkelte kolonier. Sigt efter 20 Klett enheder.
BEMÆRK: Hvis der ikke findes et Klett-farvemåler, er et spektrofotometer også egnet. Der er ingen universel konverteringformel for Klett-enheder til OD, men der findes en grov vejledning (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Inkubermed rystelser ved 250 omdrejninger indtil ca. en massefordobling (40 Klett-enheder). Det skal tage mellem 1-2.
- På dette tidspunkt er kulturerne tilbage fortyndet ved tilsætning af en tilstrækkelig mængde CDM til at nå halvdelen af den oprindelige kulturtæthed (f.eks. hvis 5 ml kultur er gået fra 20 til 40 Klett enheder, vil 15 ml CDM bringe den tilbage til 10 Klett-enheder), og væksten vil fortsætte som i trin 4.5. Den specifikke mængde rygfortynding, metalbehandlinger osv. Vi giver tre eksempler nedenfor (afsnit 5, 6 eller 7).
5. Vestlig analyse af metal responsive genprodukter
- Begyndende ved trin 4.6, tilbage fortynde stilkulturer med tre mængder CDM (f.eks 15 ml CDM, hvis du starter med 5 ml). På dette tidspunkt, tilføje metal behandlinger, hvis det ønskes.
- Jern-sensing gener kan være nedsættende med 12,5 μM Fe (NO3)3. Zink-responsive gener kan være derepressed med 10 μM ZnSO4.
- Yderligere jern- eller zinkstress er ikke nødvendig, da medierne allerede er udtømte, så responsive gener vil allerede blive udtrykt. Hvis der ønskes yderligere stress, anbefaler vi ikke mere end 1-2 μM deferoxamin eller TPEN, da overdreven stress vil forhindre kulturer i at vokse.
- Grow kulturer som i trin 4,5 for 4 timer og registrere den endelige celletæthed af prøverne. Mindre metal-stressede kulturer vil vokse til højere endelige tætheder.
- Standardisere kulturer til en passende tæthed og forberede lysates.
- Standardisere helcellelysates til en tæthed svarende til 100 Klett enheder i 1 ml kultur. For at opnå dette skal du dividere 100 med Klett-enhedstætheden af prøven. Det antal, du får, er mængden, i ml, af kultur, der vil blive brugt til at gøre cellen pellet.
- Følg standard SDS-PAGE og vestlige blotting procedurer15 at sonde for proteiner af interesse.
6. Metal-begrænset vækst analyser
BEMÆRK: Disse analyser beskriver premade vækst forblandinger. Udarbejdelsen af disse blandinger er beskrevet i afsnit 8.
- Under masse fordobling i trin 4,5, pretreat brøndene i en 96 godt mikroplade med 10x premixes. Derudover skal du udpege tre brønde til at tjene som emner. Til disse brønde tilsættes 10 μL 10x forblanding og 90 μL CDM.
- Når kulturerne i sidearmen kolber er fordoblet, tilsættes 100 μL af hver kultur til en ubrugt brønd i mikropladen og måle den optiske tæthed ved 600 nm (OD600). Dette kan gøres med cuvetter i et spektrofotometer, men med et større antal stammer inden for en analyse kan dette blive besværligt og anbefales generelt ikke, medmindre dit spektrofotometer kan måle direkte fra armen af sidearmkolben (supplerende figur 2).
- Mens du måler OD, skal kolberne placeres tilbage i rugemaskinen for at sikre, at gonococci forbliver levedygtig.
- Den korrekte mængde fortynding, der kræves for at bringe kulturerne til OD600 = 0,02. De 10x forblandinger har en ubetydelig effekt på OD og kan udelades fra beregningen.
- Fortynd kulturer med CDM i små kulturrør og tilsæt tilstrækkelig volumen til at fortynde de 10x forblandinger til 1x i pladen. Hvis der er en pladevarmer, skal pladen holdes ved 37 °C, mens den arbejder.
- Inkuber pladen i 8-12 timer med omrystning i en pladelæser, idet OD600 målinger med de ønskede intervaller.
7. Påvisning af Ligand Binding af ydre membran metaltransportører
- Behandl kulturer som i trin 5.1, derefter inkubere med rysten i 4 timer.
- Kort før 4 h-mærket skæres tre stykker filterpapir og et stykke nitrocellulose til den omtrentlige størrelse, der er nødvendig for at passe ind i et prik blot-apparat (supplerende figur 3). Presoak nitrocellulose i deioniseret vand, derefter samle apparatet med filterpapir under nitrocellulose.
- Ved 4 timer registreres celletætheden og standardiseres til en passende endelig tæthed. Det anbefales at bruge ~10% af den tæthed, der anvendes til fremstilling af cellen lysates i trin 5. For eksempel, hvis du bruger 100 KU i 1 ml til lysates, betyder det ~ 10 KU i 1 ml for disse blots. Beregningen er ellers den samme som beskrevet i 5.3.1, og kulturer tilsættes direkte til nitrocellulose i de beregnede mængder i stedet for at blive fremstillet i lysates.
- Pipetcellekulturer på nitrocelluloseog og giver filterpapiret tilstrækkelig tid til at absorbere al væsken.
- Afmonter apparatet, lad skamplet tørre, og bloker nitrocellulosemembranen i 1 time i 5% kvægserumalbumin eller fedtfri mælk (w/v) i Tris-buffered saltvand.
- Saml prikblot-apparatet igen og udskiftning af filterpapiret med paraffinfilm for at skabe en lækagetæt forsegling under nitrocellulose.
- Metalbindingen af interesse for 0,2 μM i blokker- og sondeceller fortyndes i 1 time.
- Sifon off væsken med et vakuum, vask blot, derefter følge standard immunologiske procedurer for at udvikle signalet16. Vasketrinnene kan udføres ind eller ud af apparatet.
8. Metal loading af Transferrin, S100A7, og Calprotectin, og forberedelse af 10x Premixes
BEMÆRK: Som med CDM-tilberedning skal der anvendes syrevasket glas eller plast til klargøring af opløsning.
- Human transferrin opløses ved 10 mg/ml (125 μM) i indledende buffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8,4). S100A7 og calprotectin er suspenderet i buffer bestående af 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, og 1 mM CaCl2, pH = 8,0).
- Tilsæt ferrationsopløsning (100 mM natriumcitrat, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) til transferrinopløsningen for at opnå 30% jernmætning (f.eks. er 75 μL ferrationsopløsning egnet til 5 mL transferrin, hvis den foretages ved 10 mg/ml).
- Tilføj ZnSO4 til S100A7 eller calprotectin ved et 50% molar forhold til proteinet for at skabe 25% mætning (hvert proteinmolekyle har to metalbindingssteder). Præparater på 100 μM S100A7 eller calprotectin med 50 μM ZnSO4 kan anvendes.
- I begge tilfælde skal end-over-end blanding tillades i mindst 1 time for metalbelastning.
- Forbered 4 L dialyse buffer (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7,4). Opdel dette i to separate 2 L-volumener, og placer et ved 4 °C.
- Tilsæt metalbelastede proteiner til en dialysekassette ved hjælp af en sprøjte og dialyze mod den første buffervolumen i 4 timer ved RT.
- Flyt kassetten til den anden buffervolumen og dialyze natten over ved 4 °C. Efter disse trin skal alle ubundne metaller fjernes.
BEMÆRK: Vi anbefaler en bicinchonininsyre analyse til at bestemme proteinkoncentrationer efter dialyse. - Brug en 10x transferrin premix til transferrin udnyttelse som en eneste jernkilde.
- Denne forblanding tilberedes ved at fortynde 30% humanfe-transferrin og kvægapo-transferrin (fremstillet ved 125 μM som beskrevet for humantransferrin, uden jernbelastningstrin) til henholdsvis 75 μM og 30 μM i PBS. En positiv kontrolforblanding erstatter 30% Fe-transferrin med 75 μM Fe(NO3)3, og en negativ kontrolforblanding udelader eventuelt tilsat jern, idet der kun bevares kvægapo-transferrin. I vækstanalysen fortyndes 10 μL af disse koncentrater med 90 μL kultur. De endelige koncentrationer er 7,5 μM 30% humanFe-transferrin og 3 μM kvægapo-transferrin.
- Brug en modificeret version af transferrin 10x forblandingen til S100A7 eller calprotectin-udnyttelse som en eneste zinkkilde.
- For en positiv kontrolforblanding skal 50 μM ZnSO4 indarbejdes i transferrin-forblandingen. For en negativ kontrol, indarbejde 50 μM TPEN og udelade zink. Derefter skal du tage 10 μL af hver af disse for hver prøve godt behov, og flytte denne volumen til et nyt rør. Tilføj til denne halve så meget volumen af sterile PBS. Hvis 10 brønde for eksempel får den positive kontrolforblanding, skal du tage 100 μL forblanding, flytte den til et nyt rør og tilsættes 50 μL PBS. Gør det samme for den negative kontrol.
- For at gøre S100A7 eller calprotectin premix, tage 10 μL af den negative kontrol premix per behov, flytte til et nyt rør, og tilføje halvdelen af volumen af 25% Zn-S100A7 eller calprotectin. I vækstanalysen anvendes 15 μL forblanding og fortyndes med 85 μL kultur. De endelige koncentrationer for transferrinerne forbliver de samme som i trin 8.5 med tilsat 5 μM Zn, TPEN eller S100A7/calprotectin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et specifikt defineret medium i mangel af spormetaller til vækst af Neisseria gonorrée blev udviklet og implementeret til karakterisering af metal-responsive gener og deres genprodukter. I den optimerede protokol, metal profil af medier styres ved at tilføje metaller tilbage på skøn investigator, snarere end ved titreret kelation af et metal mål, giver mulighed for øget kontrol og konsistens fra lab til lab og eksperimentere for at eksperimentere. Dette medie kan anvendes i både flydende og solid state, hvilket gør det alsidigt på tværs af mange eksperimentelle opsætninger.
Differentialproteinproduktion i variable metalkoncentrationer kan ses i de medfølgende repræsentative vestlige blots (figur 1). Billedet viser zink-responsive ydre membran transportører TdfJ og TdfH, som blev upregulated som reaktion på zink kelation af TPEN. TdfJ var stort set målbart, da zink blev tilføjet tilbage til medierne, og TdfH var knappe. Desuden er tdfJ promotor kendt for at være induceret, snarere end undertrykt, af jern. Dette er også synligt i skamplet. Disse blots udnyttet jern-lydhør lipoprotein TbpB2 som en belastning kontrol. Under forhold med jernadd-back blev TbpB-produktionen reduceret.
Metalbegrænsede vækstanalyser viser, at gonococcus(Figur 2) udnytter specifikke, definerede zinkkilder ( figur 2 ). Figur 2A viser N. gonorrée vokser i nærvær af Zn-loaded calprotectin (CP), som kræver virkningen af zink-responsive TdfH17,18. Når der ikke var nogen brugbar zinkkilde til rådighed, enten uden zinkadd-back eller ved fraværet af TdfH, var væksten begrænset. Figur 2B viser lignende resultater i tilstedeværelsen af S100A7, som kan fungere som en eneste zinkkilde, når den ydre membrantransportør TdfJ produceres19. Alene i overværelse af TPEN, eller da TdfJ var fraværende, blev væksten hæmmet, men tilføjelsen af Zn-S100A7 genvundet vækst på en TdfJ-afhængig måde. Endelig viser figur 2C en eksperimentel fejl. I dette eksempel var fortyndingstrinnet i gonokokkulturer ikke tilstrækkelig til at nedbryde bakterierne i interne zinkbassiner i forhold til den samlede kulturvolumen i mikropladen. Som sådan oversteg væksten i den negative kontrol den ønskede OD.
Specifik binding af hele gonokokceller til deres respektive ligander påvises ved prik blots fra kulturer, der er fremstillet under metalbegrænsende og metalnedbrydelige forhold (figur 3). Figur 3A,B viser, at gonococci, der dyrkes i CDM, var i stand til at binde henholdsvis CP og S100A7, når de producerede henholdsvis TdfH og TdfJ som følge af zinkknaphed. Figur 3C sammenligner transferrinbinding, som udføres af de cognate proteiner fremstillet af jern-sensing gener tbpA og tbpB20, når gonococci dyrkes i CDM alene vs GC medium bouillon behandlet med jernchelator deferoxamin. Dette tal viser øget binding af transferrin af kulturer dyrket i CDM, hvilket er tegn på højere niveauer af protein udtryk på grund af den mere jern-forarmet karakter af CDM i forhold til chelated GC bouillon.
Figur 1: Repræsentativ Western blot viser differentieret produktion af metal responsive proteiner. (A) Neisseria gonorrée stamme af vildtype FA19 blev dyrket i CDM suppleret med ZnSO4, Fe(NO3)3eller TPEN i de angivne koncentrationer. Efter behandlingen blev kulturer dyrket i 4 timer, før helcellelysates af standardiseret massefylde blev produceret og udsat for SDS-PAGE og vestlige blotting. Differentierede produktionsniveauer for TdfJ, som både er undertrykt af zink og induceret af jern, kan tydeligt ses som reaktion på zink tilsætning / udtynding og jern tilsætning. (B) Relative signalintensiteter for den vestlige blot blev kvantificeret via densitometri. Dette tal er tilpasset fra Maurakis etal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Zinkbegrænset vækst af gonococci. Vilde typestamme FA19, eller isogene mutanter af denne stamme, der ikke producerer tdfJ eller tdfH, blev dyrket i (A) ubehandlet CDM indtil den eksponentielle fase blev nået,(B) derefter tilbage fortyndet til OD600 = 0,02 og (C) OD600 = 0,1. Prøverne i A blev behandlet med forblanding indeholdende calprotectin (top) eller ingen tilsat zink (bund) og dyrkes i 8 timer. Prøverne i B og C blev suppleret med forblanding indeholdende fri zink, ingen zink (5 μM TPEN) eller S100A7, og dyrkes i 6 timer. Væksten i disse betingelser blev kun genvundet ved tilskud af medier med en brugbar zinkkilde, såsom CP, S100A7, eller gratis zink i A og B, mens C ikke var tilstrækkeligt fortyndet til at nedbryde interne cellulære zinkpuljer. Figur 2A er tilpasset fra Jean et al.17Figur 2B er tilpasset fra Maurakis etal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Repræsentativ bindende analyser viser vært ligands bindende for metal-stressede gonococci. (A) Vilde type stamme FA1090, eller mutanter af denne stamme, der ikke producerer tdfJ, tdfH, eller begge dele, blev dyrket i CDM uden supplerende metaller og blev prikket på nitrocellulose i standardiserede tætheder. Celler blev undersøgt med calprotectin, som er anerkendt af zink-responsive TdfH, og bindende blev vurderet ved påvisning med en anti-calprotectin antistof (top). Relativ calprotectin binding blev kvantificeret via densitometri, vist her på en log skala (nederst). (B) Bindende eksperimenter blev udført som beskrevet i A, men i stedet ved hjælp af FA19 vilde type stamme og tdfJ mutant og suppleret stammer i denne baggrund. Celler blev undersøgt med HRP-mærket S100A7, som er anerkendt af zink-responsive TdfJ. (C) Vilde type stamme FA19 blev dyrket side om side i CDM eller GC medium bouillon med 25 μM deferoxamin tilsat chelate fri jern, at stiplede nitrocellulose i standardiserede mængder, og probed med transferrin, som binder jern-følsomme TbpA. Disse side-by-side tests viser, at CDM, i modsætning til GC medium bouillon, krævede ingen yderligere kelation for at opnå et jern-begrænset miljø. Figur 3A er tilpasset fra Jean et al. og bunden fra Maurakis etal. 19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vækstmedier tjener en række roller inden for mikrobiologisk forskning. Specialiserede medier bruges til udvælgelse, berigelse og forskellige andre applikationer til mange unikke typer af undersøgelse. En sådan anvendelse er induktion af metal-responsive gener, som typisk opnås ved tilsætning af en bestemt chelator, der er rettet mod en bestemt metal ion. Denne metode er begrænset, da mængden af kelation er nødvendig for forskellige spormetaller sandsynligvis vil være variabel på grund af forskellige vandkilder, der indeholder unikke metalprofiler, og to partier af samme medieingrediens, der indeholder forskellige metalkoncentrationer6. For at undgå denne iboende mangel har vi beskrevet præparatet og brugen af et defineret medium, der behandles med Chelex-100 harpiks for at fjerne alle spormetaller i løs vægt, hvilket giver kontrolleret tilsætning af specificerede metaller tilbage i mediet efter behov.
I den nuværende protokol er det første vigtige diskussionspunkt kildevandet. Protokollen beskriver en Chelex behandling, der er tilstrækkelig til at fjerne metaller fra laboratoriet Type 2 (1,0 megaOhms-cm i henhold til ISO 3696 specifikationer) vand. Forskellige vandkilder vil sandsynligvis kræve kortere eller længere Chelex behandlinger. Vi har konstateret, at vand af højere renhed end type 2, såsom molekylærbiologi grade vand, vil ikke støtte bakterievækst i denne ansøgning. Valget af fartøj til medieforberedelse er lige så vigtigt som vandkilden. Vi anbefaler stærkt rene plastbeholdere, da glaskan udvaske metalioner i opløsningen. Hvis der ikke er plastvarer til rådighed, skal glasvarer vaskes for at minimere forureningsrisikoen. Den samme syre vask er nødvendig for kultur kolber, når du bruger CDM.
Vækst af Neisseria gonorrée i en in vitro indstilling kan være ganske udfordrende, da denne organisme har udviklet sig til at trives specifikt i menneskelige værter21. Cdm er velegnet til at understøtte væksten i forsøgsperioden, men der skal udvises forsigtighed under vaccinations- og fortyndingstrinene for at sikre, at gonococci ikke er længere end nødvendigt i atmosfæriske forhold. På grund af den capnofile karakter af gonococci22 og dens forkærlighed for temperaturer, der findes i menneskelige værter, anbefaler vi ikke at holde kulturer i atmosfæriske forhold i længere tid end ~ 15 min. Hvis den første massefordoblingshændelse, der er beskrevet i trin 4.5 af metoden, tager længere tid end 2 timer, er det sandsynligt, at gonokokkulturer ikke er blevet håndteret korrekt, og forsøget bør afbrydes.
Mens fokus for denne metode er på metoder til vækst og karakterisering af Neisseria gonorrée specifikt, brug af denne specifikke CDM er sandsynligvis også egnet til undersøgelse af andre Neisseria arter. Desuden kan det let anvendes til karakterisering af andre metal-sensing systemer i andre bakterier. For eksempel har en lignende metal-fri medier blevet brugt til at karakterisere metal optagelse i Staphylococcus aureus23 og Escherichia coli24. Udnyttelse af den beskrevne opskrift på andre bakterier vil sandsynligvis indebære små ændringer eller tilføjelser, afhængigt af de specifikke ernæringsmæssige behov hos de pågældende bakterier. F.eks. er tillæg VIII inkluderet i opskriften for at hjælpe med gonococcus' behov for supplerende CO2. Som beskrevet ovenfor, vækst udføres ved 37 °C med en 5% CO2 atmosfære, men vi har konstateret, at tilsætning af supplerende bikarbonat i medierne hjælper de indledende faser af gonokok vækst i defineret medium. For organismer uden et sådant krav kan denne ingrediens udelades. Desværre skal der fastlægges yderligere eksempler på disse ændringer empirisk.
På trods af behovet for at tilpasse metoden noget til brug med andre bakterier bør de grundlæggende rammer være hensigtsmæssige til bred anvendelse. Karakterisering af metal-responsive gener og metal transportører er en løbende bestræbelse i mikrobielle undersøgelse, med bakterier, herunder Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Hæmofili influenzae29, Salmonella enterica30, og E. coli31 alle får opmærksomhed i denne niche. Vores egen fremtidige udnyttelse af denne teknik vil sigte mod at fremme forståelsen af andre gonococcal metal optagelse systemer ud over de allerede nævnte, som gør det muligt for gonococcus at erhverve jern fra vært proteiner såsom lactoferrin32,33, hæmoglobin34,35, og også fra bakterielle xenosiderophores36, og at udvide vores undersøgelser i virkningerne af andre metaller såsom mangan, som har været impliceret i oxidative forsvar af Neisseria12,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01 AI125421, R01 AI127793, og U19 AI144182. Forfatteren vil gerne takke alle lab medlemmer, der har bidraget til korrekturlæsning og gennemgang af denne metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
