Summary
Vi beskriver här en metod för tillväxt av Neisseria gonorréie i metall-begränsad flytande medium för att underlätta uttrycket av gener för metall upptag. Vi beskriver också nedströms experiment för att karakterisera fenotyp av gonococci odlas under dessa förhållanden. Dessa metoder kan anpassas för att vara lämpliga för karakterisering av metall-lyhörda gener i andra bakterier.
Abstract
Spårmetaller som järn och zink är viktiga näringsämnen kända för att spela nyckelroller i prokaryota processer inklusive genreglering, katalys och proteinstruktur. Metall bindning av värdar leder ofta till metall begränsning för bakterien. Denna begränsning inducerar bakteriellgenuttryck vars proteinprodukter tillåter bakterier att övervinna sin metallbegränsade miljö. Karakterisering av sådana gener är utmanande. Bakterier måste odlas i minutiöst förberedda medier som ger tillräcklig tillgång till näringsmetaller för att möjliggöra bakterietillväxt samtidigt som en metallprofil som bidrar till att uppnå uttryck för ovannämnda gener. Därför måste en känslig balans fastställas för koncentrationerna av dessa metaller. Växande en näringsmässigt kräsen organism som Neisseria gonorrée, som har utvecklats för att överleva endast i den mänskliga värden, lägger till en ytterligare nivå av komplexitet. Här beskriver vi beredningen av ett definierat metallbegränsat medium som är tillräckligt för att möjliggöra gonokocktillväxt och önskat genuttryck. Denna metod gör det möjligt för utredaren att chelate järn och zink från oönskade källor samtidigt komplettera media med definierade källor till järn eller zink, vars beredning beskrivs också. Slutligen beskriver vi tre experiment som använder detta media för att karakterisera proteinprodukter av metallreglerade gonokockgener.
Introduction
Neisseria gonorrée orsakar den vanliga sexuellt överförbara infektion gonorré. Under infektion, patogena Neisseria uttrycka en repertoar av metall-lyhörda gener som tillåter bakterier att övervinna metall begränsning insatser av den mänskliga värd1,2,3. Spårmetaller som järn och zink spelar nyckelroller i många cellulära processer, såsom bindning till enzymer i katalytiska platser, deltagande i redox reaktioner, och som strukturella faktorer i olika proteiner4,5. Under metall-begränsade förhållanden, metall-lyhörd loci är förtryckta och deras resulterande proteiner kan hjälpa förvärvet av dessa näringsämnen. Karakterisering av dessa gener och proteiner utgör en unik teknisk utmaning för utredaren. Metalljoner måste undanhållas från bakterier för att inducera transkription av dessa gener från deras inhemska loci, men effektiv kelering av dessa joner från metall-lastade medier kan vara svårt att optimera. De olika metallprofilerna för källvatten och inneboende parti-till-parti-variation6 av pulveriserade ingredienser innebär att den mängd kelator som krävs för att ta bort en specifik metall från ett rikt medium varierar mellan olika platser, ingrediensleverantörer och till och med över tiden inom ett enda laboratorium som kemisk inventering ersätts.
För att kringgå denna utmaning beskriver vi utarbetandet av ett definierat medium som behandlas med Chelex-100 harts under beredningen för att avlägsna spårmetaller från lösningen. Detta medium är tillräckligt näringsrikt för att möjliggöra tillväxten av gonokocker, vilket är svårt att odla utanför den mänskliga värden, och gör det möjligt för utredaren att införa en specifik metallprofil genom tillägg av sina egna definierade källor och koncentrationer av Metaller. Metoden för kontrollerad add-back av önskade metaller till utarmade medium ökar experimentell konsistens och möjliggör robusta, reproducerbara experiment oavsett faktorer som vattenkälla och kemiska partinummer. Dessutom kan detta medium distribueras som antingen en vätska eller fast med endast mindre ändringar, vilket gör det ganska mångsidig.
För att visa nyttan av detta medium, beskriver vi ett protokoll för dess användning för gonokock tillväxt och beskriva tre framgångsrika experiment för att karakterisera metall-lyhörda Neisseria gener. Först förbereder vi gonokocker hela cell lysater från metall-utarmade eller kompletterade kulturer och visa varierande nivåer av proteinproduktion från metall-lyhörd loci. Vi beskriver sedan en zink-begränsad tillväxt analys där gonokocktillväxt styrs genom tillskott av specifika, användbara zinkkällor. Slutligen visar vi bindande analyser som visar hela gonokockceller som uttrycker metall-lyhörda ytreceptorer som är bindande för sina respektive metallhaltiga ligands. Framgångsrik ytpresentation av dessa receptorer kräver tillväxt i metallutarmade medium.
Det nuvarande protokollet optimerades speciellt för Neisseria gonorrée, men många andra bakteriella patogener använder metall förvärv strategier under infektion7, så detta protokoll kan anpassas för studier av metall homeostas i andra bakterier. Optimera detta media och dessa experimentella protokoll för användning i andra bakterier kommer sannolikt att kräva liten ändring av metall kelator koncentrationer och / eller behandlingstid med Chelex-100, eftersom andra bakterier kan ha något olika metallkrav än gonococcus. Järn och zink är de primära metallerna av oro för de beskrivna undersökningarna, men andra metaller (t.ex. mangan) har visats vara kritiska för bakterier, inklusive Neisseria8,9,10,11,12. Dessutom har liknande metoder beskrivits för metallkarakteriseringar i eukaryotiskt cellodlingsarbete, vilket också kan övervägas. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Chelex-behandlade definierade medellagerlösningar
- Lagerlösning I
- Kombinera NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) och KH2PO4 (10,9 g) i avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 L.
- Filtrera sterilisera lösningen och aliquot i 50 ml koniska rör.
- Förvaras vid -20 °C.
- Lagerlösning II
- Kombinera tiamin HCl (0,2 g), tiamin pyrofosfat-Cl (0,05 g), kalciumpantothetat (0,19 g) och biotin (0,3 g) i 50% (vol/ vol) etanol till en slutlig volym av 1 L.
- Aliquot i 50 ml koniska rör och förvaras vid -20 °C.
- Lagerlösning III
- Kombinera L-aspartat (4,0 g), L-glutamat (10,4 g), L-arginin (1,2 g), glycin (0,2 g), L-serin (0,4 g), L-leucine (0,72 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosin (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptofan (0,64 g), L-tyrosin (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptofan (0,64 g), L-tyrosin (0,56 g), L-prolin (0,4 g), L-tryptofan (0,64 g), L-tyrosin (0,56 g), L-prolin (0,4 g), L-tryptofan (0,64 g), L-tyrosin (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptofan threonin (0,4 g), L-fenylalanin (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamin (0,4 g), L-histidin-HCl (0,2 g), L-metionin (0,12 g), L-alanin (0,8 g), L-lysin (0,4 g) och minskad glutation (0,36 g) i 500 ml avjoniserat vatten.
- Lös L-cystein (0,44 g) och L-cystin (0,28 g) i en minimal volym (~ 1 ml) på 1 M HCl och lägg till ovanstående aminosyralösning.
- Justera lösningens pH-värdet med 10 N NaOH tills alla partiklar är upplösta. Det sista pH-värdet blir 10.0–11.0.
- Ta den slutliga volymen till 1 L med avjoniserat vatten.
- Filtrera sterilisera lösningen och aliquot i 250 ml.
- Förvaras vid -20 °C.
- Lagerlösning IV
- Lös glukos (200 g) i avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 L.
OBS: Lösningen kan behöva värmas upp för att lösa upp glukos. - Filtrera sterilisera och aliquot lösningen i 50 ml koniska rör.
- Förvaras vid -20 °C.
- Lös glukos (200 g) i avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 L.
- Lagerlösning V
- Kombinera hypoxantin (5,0 g), uracil (5,0 g) och NaOH (4,0 g) i avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 L.
- Filtrera sterilisera och aliquot i 50 ml koniska rör.
- Förvaras vid -20 °C.
- Lösning VI
- Förbered en 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) lösning i avjoniserat vatten. Filtrera sterilisera och förvara i rumstemperatur (RT).
- Lagerlösning VII
- Förbered en 1 M vattenfri MgSO4 lösning i avjoniserat vatten. Filtrera sterilisera och förvaras på RT.
- Lagerlösning VIII
- Förbered en 1 M NaHCO3-lösning i avjoniserat vatten. Filtrera sterilisera och förvaras på RT.
2. Beredning av 4x Sterilkoncentrat och 1x CDM
OBS: Detta förfarande skall utföras i antingen syrabehandlade sterila glas varor eller plast för att förhindra urlakning av metaller i lösningarna.
- Kombinera lagerlösningar I (50 ml), II (20 ml), III (250 ml), IV (50 ml) och V (20 ml) med 20,0 g HEPES och rör om för att blanda.
- Justera pH till 7,4, ta sedan den slutliga volymen till 500 ml med avjoniserat vatten.
- Tvätta Chelex-100 harts i 1 L deionized vatten för att ta bort konserveringsmedel innan du lägger den till 4x sterila koncentrat. Gör detta genom att lägga till 50 g harts till 1 L avjoniserat vatten och omrörning för minst 1 h. Ta bort vattnet genom vakuumfiltrering och använd denna tvättade harts för steg 2.4.
- Tillsätt 50 g harts och rör långsamt om i exakt 90 min.
- Ta bort harts genom filtersterilisering och förvara 4x sterilt koncentrat vid 4 °C.
- För att förbereda en 1x arbetskoncentration av CDM späder först ut 4x-koncentrat med sterilt avjoniserat vatten och tillsätt sedan lösning VI (125 μL per 500 ml 1x-lösning), lösning VII (535 μL per 500 ml) och lösning VIII (10 ml per 500 ml).
OBS: Även om alla lagerlösningar redan har steriliserats, rekommenderas att filtrera sterilisera 1x-lösningen igen efter beredning.
3. Beredning av CDM-plattor
OBS: Receptet nedan gör 1 L media för plattor, men det är bäst att förbereda dessa i mindre volymer. Allt skalas ner proportionellt.
- Tvättad agarose
- Lös upp 50 g agarose i 1 L deionized vatten, omrörning för 1 h.
- Överför lösningen till en centrifugflaska och centrifug era vid 1 200 x g i 15 min på RT. Häll försiktigt av supernatanten och kassera.
- Tillsätt tillräckligt avjoniserat vatten för att återavbryta agarose pelleten och överför sedan till en 1 L-kolv. Ta till en slutlig volym av 1 L med avjoniserat vatten och sedan rör om och centrifugsom i steg 3.1.2. Kasta supernatanten.
- Tillsätt tillräckligt med 100% etanol för att återavbryta pelleten, sedan överföra till en ny 1 L kolv. Ta till en slutlig volym av 1 L med etanol. Rör om och centrifugera som i steg 3.1.2.
- Upprepa steg 3.1.4.
- Tillsätt metanol till agarose pelleten för att avbryta igen och överför sedan till en 1 L-kolv. Ta till en slutlig volym av 1 L med metanol. Rör om och centrifugera som i steg 3.1.2.
- Upprepa steg 3.1.6.
- Överför tvättad agarose till en bricka fodrad med aluminiumfolie och låt torka i en rök huva. När den är torr, överför till en metallfri behållare för långtidsförvaring.
- Tillsätt 10 g tvättad agarose och 5 g potatisstärkelse till 750 ml avjoniserat vatten.
- Autoklav i 30 min vid 121 °C, 100 kPa ovanför atmosfärstrycket.
- Låt media svalna till ~65 °C och tillsätt sedan 250 ml 4X CDM, 250 μL lösning VI, 1,07 ml lösning VII och 20 ml lösning VIII.
- Om så önskas, tillsätt metaller val innan hälla plattor. Tillsats av chelators är inte nödvändigt för att upprätthålla metallfria förhållanden.
- Häll i Petri rätter och låt stelna.
4. Metall begränsad tillväxt av Neisseria gonorrée
OBS: För de flesta tillämpningar är det inte nödvändigt att metall stressbakterierna före inokulering av CDM. Det ursprungliga fördubblingssteget i CDM och den efterföljande utspädningen är tillräckligt för att tömma gonococci av deras interna järn- och zinkförråd. Som sådan utförs de två första stegen i följande förfarande med hjälp av agarplattor gjorda av GC medium bas som har kompletterats med Kellogg tillägg I14 och 12,5 μM Fe (NO3)3. Om tidig metallstress önskas rekommenderar vi att du förbereder GC medium basplattor utan Fe(NO3)3 och med 5 μM TPEN (N,N,N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmetyl) etendiamin) för zinkkelering eller 10 μM deferoxamin för järnkelering. All inkubation utförs vid 37 °C med 5% CO2.
- Två dagar före experimentet, på dag -2, strimma gonococci från frys lager på GC medelstora plattor och inkubera för högst 24 h.
- På dag -1, strimma enda kolonier på färska GC medelstora plattor. Försök att göra detta 14-16 h före tillväxtexperimentet.
- På dagen för experimentet, tillsätt 5-10 ml 1x CDM till en syra tvättad 125 ml förbryllad sidoarm kolv(Kompletterande Bild 1)och använda detta för att tömma en Klett kolorimeter.
- Använd en steril, bomullstippad kompress för att vaccinera CDM från friska, enstaka kolonier. Sikta på 20 Klett-enheter.
OBS: Om en Klett kolorimeter inte är tillgänglig, är en spektrofotometer lämplig också. Det finns ingen universell konverteringsformel för Klett-enheter till OD, men en grov guide finns tillgänglig(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Inkubera med skakning vid 250 rpm tills ungefär en massa fördubbling (40 Klett enheter). Det ska ta mellan 1–2.
- Vid denna punkt är kulturerna tillbaka utspädda genom tillsats av en tillräcklig volym CDM för att nå hälften av den ursprungliga kulturtätheten (t.ex. om 5 ml kultur har gått från 20 till 40 Klett enheter, 15 ml CDM kommer att föra den tillbaka ner till 10 Klett enheter) och tillväxten kommer att fortsätta som i steg 4.5. Den specifika mängden ryggutspädning, metallbehandlingar etc. beror på nedströmsapplikationer. Vi ger tre exempel nedan (avsnitten 5, 6 eller 7).
5. Västerländsk analys av metallresponsiva genprodukter
- Början på steg 4.6, tillbaka späda kulturerna med tre volymer av CDM (t.ex. 15 ml CDM om start med 5 ml). Vid denna punkt, tillsätt metallbehandlingar om så önskas.
- Järnavsenande gener kan förträngas med 12,5 μM Fe(NO3)3. Zink-responsiva gener kan förträngas med 10 μM ZnSO4.
- Ytterligare järn eller zink stress är inte nödvändigt, eftersom media redan är uttömda, så lyhörda gener kommer redan att uttryckas. Om ytterligare stress önskas rekommenderar vi inte mer än 1–2 μM av deferoxamin eller TPEN, eftersom överdriven stress förhindrar att kulturer växer.
- Odla kulturer som i steg 4,5 för 4 h och registrera den slutliga celltätheten av proverna. Mindre metallstressade kulturer kommer att växa till högre slutliga tätheter.
- Standardisera kulturer till en lämplig densitet och förbereda lysates.
- Standardisera hela celllysats till en densitet motsvarande 100 Klett enheter i 1 ml kultur. För att åstadkomma detta, dela 100 av Klett enheten densitet av ditt prov. Antalet du får är volymen, i ml, av kultur som kommer att användas för att göra cellen pellet.
- Följ standard SDS-PAGE och Western blotting förfaranden15 att sond för proteiner av intresse.
6. Metall-begränsad tillväxt analyser
OBS: Dessa analyser beskriver färdiga tillväxt premixes. Beredningen av dessa blandningar beskrivs i avsnitt 8.
- Under massan fördubbling i steg 4,5, pretreat brunnarna på en 96 brunn microplate med 10x premixes. Dessutom utse tre brunnar för att fungera som ämnen. Tillsätt 10 μL 10x premix och 90 μL CDM.
- När kulturerna i sidoarmflaskorna har fördubblats, tillsätt 100 μl av varje kultur till en oanvänd brunn i mikroplattan och mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600). Detta kan göras med cuvettes i en spektrofotometer, men med större antal stammar inom en analys kan detta bli besvärligt och är i allmänhet inte rekommenderas om inte din spektrofotometer kan mäta direkt från armens armkolvarm(Kompletterande figur 2).
- När du mäter od, placera kolverna tillbaka i inkubatorn för att säkerställa gonococci förbli livskraftig.
- Beräkna rätt mängd utspädning som krävs för att föra kulturerna till OD600 = 0,02. De 10x premixes har en försumbar effekt på OD och kan utelämnas från beräkning.
- Späd kulturer med CDM i små kulturrör och tillsätt tillräcklig volym för att späda ut 10x premixes till 1x i plattan. Om en plattvärmare finns tillgänglig, håll plattan vid 37 °C under arbetet.
- Inkubera plattan för 8–12 h med skakning i en plattläsare, med OD600-mätningar med önskade intervaller.
7. Detektion av Ligand-bindning av yttre membranmetalltransportörer
- Behandla kulturer som önskas som i steg 5.1, sedan ruva med skakningar för 4 h.
- Strax före 4 h-märket, skär tre bitar av filterpapper och en bit nitrocellulosa till den ungefärliga storlek som behövs för att passa in i en punkt blot apparat(Kompletterande figur 3). Blötlägg nitrocellulosan i avjoniserat vatten och montera sedan apparaten med filterpapper under nitrocellulosan.
- Vid 4 h, registrera celltätheten och standardisera till en lämplig slutlig densitet. Det rekommenderas att använda ~ 10% av densiteten som används för beredning av celllysas i steg 5. Till exempel, om du använder 100 KU i 1 ml för lyssningarna, innebär detta ~10 KU i 1 ml för dessa blots. Beräkningen är annars densamma som beskrivs i 5.3.1, och kulturer läggs direkt till nitrocellulosa i de beräknade volymerna snarare än görs till lysates.
- Pipet cellkulturer på nitrocellulosa och ger tillräckligt med tid för filterpapperet att absorbera all vätska.
- Ta isär apparaten, låt blot torka och blockera nitrocellulosamembranet för 1 h i 5% bovinserumalbum eller fettfri mjölk (w/v) i Tris-buffrad koks.
- Sätt ihop punktblotapparaten och byt ut filterpapperet med paraffinfilm för att skapa en läckagesäker tätning under nitrocellulosan.
- Späd metallbindningen av intresse till 0,2 μM i blockerare och sondceller för 1 h.
- Sifon av vätskan med ett vakuum, tvätta blot, följ sedan standard immunologiska förfaranden för att utveckla signalen16. Tvättstegen kan göras in eller ut ur apparaten.
8. Metalllastning av transferrin, S100A7 och Calprotectin samt beredning av 10x Premixes
OBS: Som med CDM-beredning, använd syratvättat glas eller plast för lösningsberedning.
- Lös upp humanöverföring vid 10 mg/ml (125 μM) i initial buffert (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8,4). S100A7 och calprotectin är upphängda i buffert bestående av 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoetanol och 1 mM CaCl2, pH = 8,0).
- Tillsätt ferrationslösning (100 mM natriumcitrat, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) till transferrinlösningen för att uppnå 30% järnmättnad (t.ex. 75 μL ferrningslösning är lämplig för 5 ml transferrin om den görs på 10 mg/ml).
- Tillsätt ZnSO4 till S100A7 eller calprotectin vid ett 50% molarförhållande till proteinet för att skapa 25% mättnad (varje proteinmolekyl har två metallbindningsställen). Preparat av 100 μM S100A7 eller calprotectin med 50 μM ZnSO4 kan användas.
- För båda fallen, tillåt end-over-end blandning för minst 1 h för metalllastning.
- Förbered 4 L dialysbuffert (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7,4). Dela upp detta i två separata 2 L-volymer och placera en vid 4 °C.
- Tillsätt metallladdade proteiner i en dialyskassett med en spruta och dialys mot den första buffertvolymen för 4 h vid RT.
- Flytta kassetten till den andra buffertvolymen och dialyze över natten vid 4 °C. Efter dessa steg bör obundna metaller tas bort.
OBS: Vi rekommenderar en bicinchoninsyra analys för att bestämma proteinkoncentrationer efter dialys. - Använd en 10x transferrin premix för överanvändning som en enda järnkälla.
- Förbered denna premix genom att späda ut 30 % fe-transferrin och bovinapo-transferrin (beredd på 125 μM enligt beskrivningen för mänsklig överföring, utan järnlaststeg) till 75 μM respektive 30 μM i PBS. En positiv kontrollpremix ersätter 30% Fe-transferrin med 75 μM Fe(NO3)3, och en negativ kontroll premix utelämnar eventuellt tillsatt järn, behålla endast bovin apo-transferrin. I tillväxtanalysen späd er 10 μL av dessa koncentrat med 90 μL kultur. De slutliga koncentrationerna är 7,5 μM 30 % människa Fe-transferrin och 3 μM bovinapo-transferrin.
- Använd en modifierad version av förvärvaren 10x premix för S100A7 eller calprotectin-användning som en enda zinkkälla.
- För en positiv kontrollpremix, införliva 50 μM ZnSO4 i transferrin premix. För en negativ kontroll, införliva 50 μM TPEN och utelämna zink. Ta sedan 10 μL av var och en av dessa för varje prov välbehövlig, och flytta den volymen till ett nytt rör. Lägg till denna halv så mycket volym steril PBS. Till exempel, om 10 brunnar kommer att få den positiva kontrollen premix, ta 100 μL premix, flytta den till ett nytt rör och tillsätt 50 μL PBS. Gör samma sak för den negativa kontrollen.
- För att göra S100A7 eller calprotectin premix, ta 10 μL av den negativa kontrollen premix per välbehövlig, flytta till ett nytt rör och tillsätt hälften av den volym av 25% Zn-S100A7 eller calprotectin. Använd 15 μL premix och späd med 85 μL kultur i tillväxtanalysen. De slutliga koncentrationerna för övertagarna förblir desamma som i steg 8.5, med en tillsatt 5 μM Zn, TPEN eller S100A7/calprotectin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett specifikt definierat medium i avsaknad av spårmetaller för tillväxten av Neisseria gonorréutvecklades och implementerades för karakterisering av metallresponsiva gener och deras genprodukter. I det optimerade protokollet styrs mediets metallprofil genom att lägga till metaller igen efter utredarens gottfinnande, snarare än genom att titrerad kelering av ett metallmål, vilket möjliggör ökad kontroll och konsekvens från labb till labb och experimentera rattexperiment. Detta media kan användas i både flytande och fast tillstånd, vilket gör det mångsidigt i många experimentella inställningar.
Differentiell proteinproduktion i varierande metallkoncentrationer kan ses i de inkluderade representativa västerländska blots(figur 1). Bilden visar de zink-lyhörda yttre membran transportörerNa TdfJ och TdfH, som var uppreglerade som svar på zink kelering av TPEN. TdfJ var i huvudsak omöjlig att upptäcka när zink lades tillbaka till media, och TdfH var knappa. Dessutom är tdfJ promotorn känd för att induceras, snarare än förträngda, av järn. Detta syns också i blot. Dessa blots utnyttjas järn-lyhördlipoprotein TbpB2 som en lastkontroll. Under förhållanden med järntillägg minskade TbpB-produktionen.
Metallbegränsade tillväxtanalyser visar utnyttjandet av specifika, definierade zinkkällor av gonococcus(figur 2). Figur 2A visar N. gonorré växer i närvaro av Zn-lastad calprotectin (CP), som kräver verkan av zink-lyhördA TdfH17,18. När det inte fanns någon användningsbar zinkkälla, antingen genom någon zinktillägg eller av frånvaron av TdfH, begränsades tillväxten. Figur 2B visar liknande resultat i närvaro av S100A7, som kan fungera som en enda zinkkälla när den yttre membrantransportören TdfJ produceras19. I närvaro av TPEN ensam eller när TdfJ var frånvarande, var tillväxten hämmas, men tillägg av Zn-S100A7 återhämtade tillväxt på ett TdfJ-beroende sätt. Slutligen visar figur 2C ett experimentellt fel. I detta exempel var utspädningssteget för de gonokockska kulturerna inte tillräckligt för att tömma bakterierna i interna zinkpooler i förhållande till den totala odlingsvolymen i mikroplattan. Tillväxten i den negativa kontrollen överskred därför den önskade od.
Specifik bindning av hela gonokockceller till sina respektive ligands visas av punktblots från kulturer som är beredda i metallbegränsande och metallfyllda förhållanden(figur 3). Figur 3A,B visar att gonococci odlas i CDM kunde binda CP och S100A7 vid produktion Av TdfH respektive TdfJ som ett resultat av zinkbrist. Figur 3C jämför överföring av överföring, som åstadkoms av cognate proteiner gjorda av järn-sensing gener tbpA och tbpB20, när gonococci odlas i CDM ensam vs GC medium buljong behandlas med järnkelator deferoxamin. Denna siffra visar ökad bindning av transferrin av kulturer som odlas i CDM, vilket är ett tecken på högre nivåer av proteinuttryck på grund av mer järnutarmat karaktär CDM jämfört med kelateragc buljong.
Figur 1: Representativ västerländsk blot som visar differentiell produktion av metallresponsiva proteiner. (A) Neisseria gonorrée wild type stam FA19 odlades i CDM kompletterat med ZnSO4,Fe(NO3)3,eller TPEN i de angivna koncentrationerna. Efter behandling odlades kulturer för 4 h innan hela celllysats av standardiserad densitet producerades och utsattes för SDS-PAGE och Western blotting. Differentierade produktionsnivåer för TdfJ, som både förträngs av zink och orsakas av järn, kan tydligt ses som svar på zinktillsats/utarmning och järntillägg. (B)Relativ signalintensitet för den västra bloten har förstorats via densitometri. Denna siffra är anpassad från Maurakis et al19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Zinkbegränsad tillväxt av gonokocker. Wild type stam FA19, eller isogenic mutanter av denna stam som inte producerar tdfJ eller tdfH, odlades i (A) obehandlad CDM tills exponentiell fas nåddes, (B) sedan tillbaka utspädd till OD600 = 0,02 och (C) OD600 = 0,1. Proverna i A behandlades med premix som innehåller calprotectin (överst) eller ingen tillsatt zink (botten) och odlades för 8 h. Proverna i B och C kompletterades med premix som innehåller gratis zink, ingen zink (5 μM TPEN) eller S100A7, och odlades för 6 h. Tillväxten under dessa förhållanden återfanns endast vid tillskott av media med en användbar zinkkälla, såsom CP, S100A7 eller gratis zink i A och B, medan C inte var tillräckligt utspädd för att tömma interna cellulära zinkpooler. Figur 2A är anpassad från Jean et al.17Figur 2B är anpassad från Maurakis et al19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Representativa bindande analyser visar värd ligands bindande för metall-stressad gonococci. (A)Stam av vilda typ FA1090, eller mutanter av denna stam som inte producerar tdfJ, tdfH eller båda, odlades i CDM utan kompletterande metaller och var prickade på nitrocellulosa i standardiserade densiteter. Celler undersöktes med calprotectin, som känns igen av den zinkkänsliga TdfH, och bindningbedömdes genom detektion med en anti-calprotectin antikropp (överst). Relativ calprotectinbindning en quantitated via densitometri, som visas här på en loggskala (botten). (B)Bindande experiment utfördes enligt beskrivningen i A, men istället med fa19 wild type stam och tdfJ mutant och kompletterade stammar i den bakgrunden. Celler undersöktes med HRP-märkta S100A7, som känns igen av den zink-lyhörda TdfJ. (C) Wild typ stam FA19 odlades sida vid sida i CDM eller GC medium buljong med 25 μM deferoxamin läggas till chelate fritt järn, prickade till nitrocellulosa i standardiserade mängder, och sonderade med transferrin, som binder den järnkänsliga TbpA. Dessa sida vid sida tester visar att CDM, till skillnad från GC medium buljong, krävs ingen ytterligare kelering för att uppnå en järnbegränsad miljö. Figur 3A är anpassad från Jean et al. och botten från Maurakis et al19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillväxtmedia tjänar en mängd olika roller inom mikrobiologisk forskning. Specialiserade medier används för urval, berikning och olika andra applikationer för många unika typer av studier. En sådan applikation är induktion av metall-lyhörda gener, som vanligtvis sker genom tillägg av en specifik kelator som riktar sig mot en viss metalljon. Denna metod är begränsad, eftersom den mängd kelering som krävs för olika spårmetaller sannolikt kommer att variera på grund av olika vattenkällor som innehåller unika metallprofiler, och två partier av samma medieingrediens som innehåller olika metallkoncentrationer6. För att undvika denna inneboende brist har vi beskrivit beredningen och användningen av ett definierat medium som behandlas med Chelex-100 harts för att avlägsna alla spårmetaller i bulk, vilket möjliggör kontrollerad tillsats av specificerade metaller tillbaka till mediet efter behov.
I det nuvarande protokollet är den första viktiga diskussionspunkten källvattnet. Protokollet beskriver en Chelex-behandling som är tillräcklig för att avlägsna metaller från laboratorietyp 2 (1,0 megaOhms-cm enligt ISO 3696-specifikationer) vatten. Olika vattenkällor kommer sannolikt att kräva kortare eller längre Chelex behandlingar. Vi har funnit att vatten av högre renhet än typ 2, såsom molekylärbiologi kvalitet vatten, inte kommer att stödja bakteriell tillväxt i denna tillämpning. Valet av fartyg för medieberedning är lika viktigt som vattenkällan. Vi rekommenderar starkt rena plastbehållare, eftersom glasvaror kan läcka metalljoner i lösningen. Om det inte finns något plastföremål måste glasen tvättas för att minimera föroreningsrisken. Samma syratvätt krävs för odlingsflaskor vid användning av CDM.
Tillväxt av Neisseria gonorré i en in vitro inställning kan vara ganska utmanande, eftersom denna organism har utvecklats för att frodas specifikt i mänskliga värdar21. Cdm är lämplig för att stödja tillväxten under experimentens varaktighet, men försiktighet måste iakttas under inokulerings- och utspädningsåtgärderna för att säkerställa att gonokocker inte är i atmosfäriska förhållanden längre än nödvändigt. På grund av den kapnofilade karaktären av gonokocker22 och dess förkärlek för temperaturer som finns inom mänskliga värdar, rekommenderar vi inte att hålla kulturer i atmosfäriska förhållanden längre än ~ 15 min. Om den första massa fördubbling händelse som beskrivs i steg 4.5 av metoden tar längre tid än 2 h, är det troligt att gonococcal kulturer inte har hanterats korrekt och experimentet bör avbrytas.
Medan fokus för denna metod är på metoder för tillväxt och karakterisering av Neisseria gonorré specifikt, användning av denna specifika CDM är sannolikt också lämplig för studier av andra Neisseria arter. Dessutom kan det lätt appliceras på karakterisering av andra metallavsenande system i andra bakterier. Till exempel har en liknande metall-fria medier använts för att karakterisera metall upptag i Staphylococcus aureus23 och Escherichia coli24. Utnyttjande av det beskrivna receptet för andra bakterier kommer sannolikt att innebära små ändringar eller tillägg, beroende på de specifika näringsbehoven hos bakterierna i fråga. Till exempel, tillägg VIII ingår i receptet för att hjälpa till med gonococcus behov av kompletterande CO2. Som beskrivits ovan, tillväxt utförs vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär, men vi har funnit att tillägg av kompletterande bikarbonat i media hjälper de inledande stadierna av gonococcal tillväxt i definierade medium. För organismer utan ett sådant krav kan denna ingrediens utelämnas. Tyvärr måste ytterligare exempel på dessa ändringar empiriskt fastställas.
Trots behovet av att anpassa metoden något för användning med andra bakterier bör den grundläggande ramen vara lämplig för bred användning. Karakterisering av metall-responsiva gener och metall transportörer är en pågående strävan i mikrobiell studie, med bakterier inklusive Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Blödarsjuka influensa29, Salmonella enterica30, och E. coli31 alla får uppmärksamhet i denna nisch. Vårt eget framtida utnyttjande av denna teknik kommer att syfta till att främja förståelsen av andra gonokocker metall upptag system utöver de som redan nämnts, som gör det möjligt för gonokocker att förvärva järn från värdproteiner såsom laktoferrin32,33, hemoglobin34,35, och även från bakteriellxenosiderophores36, och att utöka våra studier i effekterna av andra metaller såsom mangan, som har varit inblandad i oxidativ stressförsvar av Neisseria12,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag En R01 AI125421, R01 AI127793 och U19 AI144182. Skrivförfattaren vill tacka alla labbmedlemmar som bidragit till korrekturläsning och granskning av denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
