Summary
Descriviamo qui un metodo per la crescita delle gonorree Neisseria nel mezzo liquido con restrizioni metalliche per facilitare l'espressione dei geni per l'assorbimento dei metalli. Illustremo anche esperimenti a valle per caratterizzare il fenotipo dei gonocchi coltivati in queste condizioni. Questi metodi possono essere adattati per essere adatti per la caratterizzazione di geni che rispondono ai metalli in altri batteri.
Abstract
I metalli traccia come ferro e zinco sono nutrienti vitali noti per svolgere un ruolo chiave nei processi procatotici, tra cui la regolazione genica, la catalisi e la struttura delle proteine. Il sequestro di metallo da parte degli ospiti spesso porta a limitazioni di metallo per il batterio. Questa limitazione induce l'espressione genica batterica i cui prodotti proteici consentono ai batteri di superare il loro ambiente limitato dai metalli. La caratterizzazione di tali geni è impegnativa. I batteri devono essere coltivati in supporti meticolosamente preparati che consentano un accesso sufficiente ai metalli nutrizionali per consentire la crescita batterica, pur mantenendo un profilo metallico favorevole al raggiungimento dell'espressione dei suddetti geni. Come tale, un delicato equilibrio deve essere stabilito per le concentrazioni di questi metalli. Coltivare un organismo nutrizionalmente esigente come Neisseria gonorrhoeae, che si è evoluto per sopravvivere solo nell'ospite umano, aggiunge un ulteriore livello di complessità. Qui, descriviamo la preparazione di un mezzo definito a limitata di metalli sufficiente a consentire la crescita gonococcica e l'espressione genica desiderata. Questo metodo consente allo sperimentatore di maticare ferro e zinco da fonti indesiderate integrando i media con fonti definite di ferro o zinco, la cui preparazione è anche descritta. Infine, illustreremo tre esperimenti che utilizzano questo mezzo per aiutare a caratterizzare i prodotti proteici dei geni gonococcici regolati dai metalli.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae provoca la comune infezione trasmessa sessualmente gonorrea. Durante l'infezione, patogeni Neisseria esprimono un repertorio di geni che rispondono ai metalli che permettono ai batteri di superare gli sforzi di restrizione dei metalli da parte dell'ospite umano1,2,3. I metalli traccia come il ferro e lo zinco svolgono un ruolo chiave in molti processi cellulari, come il legame agli enzimi nei siti catalitici, la partecipazione alle reazioni di redox e come fattori strutturali in varie proteine4,5. In condizioni di metallo limitato, i loci che rispondono ai metalli sono derepressi e le loro proteine risultanti possono aiutare ad acquisire questi nutrienti. La caratterizzazione di questi geni e proteine rappresenta una sfida tecnica unica per lo sperimentatore. Gli ioni metallici devono essere trattenuti dai batteri per indurre la trascrizione di questi geni dai loro loci nativi, ma una malattia efficace di questi ioni da supporti carichi di metalli può essere difficile da ottimizzare. I diversi profili metallici dell'acqua di origine e la variazione intrinseca di6 ingredienti in polvere significano che la quantità di chelatore necessaria per rimuovere un metallo specifico da un mezzo ricco varierà tra diverse posizioni, fornitori di ingredienti, e anche nel tempo all'interno di un singolo laboratorio come inventario chimico viene sostituito.
Per aggirare questa sfida, descriviamo la preparazione di un mezzo definito che viene trattato con resina Chelex-100 durante la preparazione per rimuovere i metalli traccia dalla soluzione. Questo mezzo è sufficientemente nutriente denso per consentire la crescita del gonococco, che è difficile da coltura al di fuori dell'ospite umano, e permette allo sperimentatore di introdurre un profilo metallico specifico aggiungendo le proprie fonti definite e concentrazioni di Metalli. Il metodo di controllo add-back dei metalli desiderati a medio impoverito aumenta la consistenza sperimentale e consente esperimenti robusti e replicabili indipendentemente da fattori quali la fonte d'acqua e il numero di lotti chimici. Inoltre, questo supporto può essere distribuito come liquido o solido con solo piccole modifiche, rendendolo abbastanza versatile.
Al fine di dimostrare l'utilità di questo mezzo, descriviamo un protocollo per il suo utilizzo per la crescita gonococcica e descriviamo tre esperimenti di successo per caratterizzare i geni Neisseria sensibili ai metalli. In primo luogo, prepariamo lismi a cellule intere gonococcali da colture impoverite o integrate di metallo e dimostriamo livelli variabili di produzione di proteine da loci che rispondono ai metalli. Viene quindi illustrato un saggio di crescita limitato allo zinco in cui la crescita gonococcale è controllata dal completamento di specifiche fonti di zinco utilizzabili. Infine, mostriamo saggi vincolanti che dimostrano cellule gonococciche intere che esprimono recettori di superficie che rispondono al metallo che si legano ai rispettivi ligoandi contenenti metalli. La presentazione superficiale di successo di questi recettori richiede la crescita nel mezzo impoverito di metalli.
L'attuale protocollo è stato ottimizzato specificamente per neisseria gonorrhoeae, ma numerosi altri patogeni batterici impiegano strategie di acquisizione di metalli durante l'infezione7, quindi questo protocollo può essere adattato per lo studio dell'omeostasi metallica in altri batteri. Ottimizzare questo supporto e questi protocolli sperimentali per l'uso in altri batteri richiederà probabilmente una leggera modifica delle concentrazioni di chelatori metallici e/o il tempo di trattamento con Chelex-100, poiché altri batteri possono avere requisiti metallici leggermente diversi rispetto al gonococcus. Ferro e zinco sono i metalli primari di preoccupazione per le indagini descritte, ma altri metalli (ad esempio, manganese) sono stati dimostrati come critici per i batteri, tra cui Neisseria8,9,10,11,12. Inoltre, sono stati descritti metodi simili per le caratterizzazioni dei metalli nel lavoro di coltura cellulare eucarome, che può anche essere considerato. 13 del sistema
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Protocol
1. Preparazione di soluzioni stock A media definita (CDM) trattate da Chelex
- Soluzione stock I
- Combinare NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) e KH2PO4 (10,9 g) in acqua deionizzata a un volume finale di 1 L.
- Filtro sterilizzare la soluzione e aliquota in tubi conici 50 mL.
- Conservare a -20 gradi centigradi.
- Soluzione stock II
- Combinare tiamina HCl (0,2 g), tirafofafo-Cl (0,05 g), pantotofina di calcio (0,19 g) e biotina (0,3 g) nel 50% (vol/vol) di etanolo ad un volume finale di 1 L.
- Aliquota in tubi conici da 50 ml e conservata a -20 gradi centigradi.
- Soluzione stock III
- Combinare L-aspartate (4,0 g), L-glutamate (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucina (00 l-isoleucina (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tirosina (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophan (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamine (0,4 g), L-istidine-HCl (0 0,8 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lysina (0,4 g) e glutathione ridotto (0,36 g) in acqua diionizzata da 500 ml.
- Sciogliere L-cisteina (0,44 g) e L-cistina (0,28 g) in un volume minimo (1 mL) di 1 M HCl e aggiungere alla soluzione di amminoacido di cui sopra.
- Regolare il pH della soluzione con 10 N NaOH fino a quando tutto il particolato non viene sciolto. Il pH finale sarà 10.0–11.0.
- Portare il volume finale a 1 L con acqua deionizzata.
- Filtro sterilizzare la soluzione e aliquota in volumi 250 mL.
- Conservare a -20 gradi centigradi.
- Soluzione stock IV
- Sciogliere il glucosio (200 g) in acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L.
NOTA: potrebbe essere necessario riscaldare la soluzione per sciogliere il glucosio. - Filtrare sterilizzare e aliquota la soluzione in tubi conici da 50 ml.
- Conservare a -20 gradi centigradi.
- Sciogliere il glucosio (200 g) in acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L.
- Soluzione stock V
- Combinare l'iposintomata (5,0 g), l'uracile (5,0 g) e NaOH (4,0 g) in acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L.
- Filtrare sterilizzare e aliquota in tubi conici da 50 mL.
- Conservare a -20 gradi centigradi.
- Soluzione VI
- Preparare una soluzione da 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) in acqua divinizzata. Filtrare sterilizzare e conservare a temperatura ambiente (RT).
- Soluzione Stock VII
- Preparare una soluzione MgSO4 idroacqua da 1 m in acqua deionizzata. Filtrare sterilizzare e memorizzare a RT.
- Soluzione Stock VIII
- Preparare una soluzione NaHCO3 da 1 M in acqua deionizzata. Filtrare sterilizzare e memorizzare a RT.
2. Preparazione di 4x Sterile Concentrate e 1x CDM
NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in vetro sterile trattato con acido o in plastica per evitare lisciviazione di metalli nelle soluzioni.
- Combinare le soluzioni stock I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) e V (20 mL) con 20,0 g di HEPES e mescolare per mescolare.
- Regolare il pH a 7,4, quindi portare il volume finale a 500 mL con acqua deionizzata.
- Lavare la resina Chelex-100 in acqua 1 L per rimuovere i conservanti prima di aggiungerla al concentrato sterile 4x. In questo modo si aggiungono 50 g di resina a 1 L dionizzata acqua e mescolando per almeno 1 h. Rimuovere l'acqua mediante filtrazione sottovuoto e utilizzare questa resina lavata per il passaggio 2.4.
- Aggiungere 50 g di resina e mescolare lentamente per esattamente 90 min.
- Rimuovere la resina sterilizzazione del filtro e conservare il concentrato sterile 4x a 4 gradi centigradi.
- Per preparare una concentrazione di lavoro di 1x di CDM, prima diluire il concentrato 4x con acqua sterile deionizzata, quindi aggiungere la soluzione VI (125 mL per 500 mL di soluzione 1x), la soluzione VII (535 x L per 500 mL) e la soluzione VIII (10 mL per 500 mL).
NOTA: Anche se tutte le soluzioni di stock sono già state sterilizzate, si consiglia di filtrare di nuovo sterilizzare la soluzione 1x dopo la preparazione.
3. Preparazione di piastre CDM
NOTA: La ricetta qui sotto fa 1 L supporti per piatti, ma è meglio prepararli in volumi più piccoli. Tutto si riduce proporzionalmente.
- Agarose lavate
- Sciogliere 50 g di agarose in 1 L dionizzata acqua, mescolando per 1 h.
- Trasferire la soluzione in una bottiglia di centrifuga e centrifugare a 1.200 x g per 15 min a RT. Versare con attenzione il supernatante e scartare.
- Aggiungere acqua sufficientemente ionizzata per risospendere il pellet di agarose, quindi trasferire in un pallone da 1 LL. Portare ad un volume finale di 1 L con acqua deionizzata e poi mescolare e centrifugare come al passo 3.1.2. Scartare il super-attardato.
- Aggiungere sufficiente 100% di etanolo per risospendere il pellet, quindi trasferire in un nuovo pallone da 1 L. Portare ad un volume finale di 1 L con etanolo. Mescolare e centrifugare come nel punto 3.1.2.
- Ripetere il passaggio 3.1.4.
- Aggiungere metanolo al pellet di agarose per risospendere, quindi trasferire in un pallone da 1 LL. Portare ad un volume finale di 1 L con metanolo. Mescolare e centrifugare come nel punto 3.1.2.
- Ripetere il passaggio 3.1.6.
- Trasferire agarose lavato in un vassoio rivestito con foglio di alluminio e lasciare asciugare in una cappa di fumi. Quando è asciutto, trasferire in un contenitore senza metalli per lo stoccaggio a lungo termine.
- Aggiungere 10 g di agarose lavate e 5 g di amido di patate a 750 mL di acqua deionizzata.
- Autoclave per 30 min a 121 gradi centigradi, 100 kPa sopra la pressione atmosferica.
- Lasciare raffreddare i supporti a 65 gradi centigradi, quindi aggiungere 250 mL di 4X CDM, 250 l di soluzione VI, 1,07 mL di soluzione VII e 20 mL di soluzione VIII.
- Se lo si desidera, aggiungere i metalli di scelta prima di versare piastre. L'aggiunta di chelatori non è necessaria per mantenere le condizioni senza metallo.
- Versare nei piatti Petri e lasciare solidificare.
4. Metal Limited Crescita di Neisseria gonorrhoeae
NOTA: Per la maggior parte delle applicazioni, non è necessario stressare i batteri prima dell'inoculazione del CDM. La fase iniziale di raddoppio nel CDM e la successiva diluizione sono sufficienti per esaurire i gonocococchi dei loro depositi interni di ferro e zinco. Come tale, i primi due passaggi della seguente procedura sono condotti utilizzando piastre di agar fatte di base media GC che sono stati integrati con il supplemento di Kellogg I14 e 12.5 Fe(NO3)3. Se si desidera lo stress metallico iniziale, si consiglia di preparare piastre di base medie GC senza Fe(NO3)3 e con 5 TPEN (N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) per la chelazione di zinco o 10 m di deferoxamina per la chelazione del ferro. Tutta l'incubazione è condotta a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Due giorni prima dell'esperimento, il giorno -2, strisciago gonococci da scorte di congelatori su piastre medie GC e incubare per non più di 24 ore.
- Il giorno -1, striscia singole colonie su piastre medie GC fresche. Provate a fare questo 14-16 h prima dell'esperimento di crescita.
- Il giorno dell'esperimento, aggiungere 5-10 mL 1x CDM a un fiaschettadi braccio laterale sconcertato da 125 mL e utilizzarlo per svuotare un colorimetro Klett.
- Utilizzare un tampone sterile con punta di cotone per inoculare CDM da colonie singole sane. Punta a 20 unità Klett.
NOTA: Se non è disponibile un colorimetro Klett, è adatto anche uno spettrofotometro. Non esiste una formula di conversione universale per le unità Klett in OD, ma è disponibile una guida approssimativa (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Incubare con agitazione a 250 rpm fino a circa un raddoppio di massa (40 unità Klett). Questo dovrebbe richiedere tra 1-2 h.
- A questo punto, le colture sono diluite dall'aggiunta di un volume sufficiente di CDM per raggiungere la metà della densità di coltura iniziale (ad esempio, se 5 mL di cultura è passata da 20 a 40 unità Klett, 15 mL di CDM lo riporterà a 10 unità Klett) e la crescita continuerà come nel passaggio 4.5. La quantità specifica di diluizione alla schiena, trattamenti metallici, ecc. dipende dalle applicazioni a valle. Di seguito sono riportati tre esempi (sezioni 5, 6 o 7).
5. Analisi occidentale dei prodotti genici metalressimi reattivi
- A partire dal passaggio 4.6, retro diluire le culture con tre volumi di CDM (ad esempio, 15 mL di CDM se si inizia con 5 mL). A questo punto, aggiungere i trattamenti metallici, se lo si desidera.
- I geni di rilevamento del ferro possono essere derepressicon 12,5 M Fe(NO )3. I geni che rispondono allo zinco possono essere derepressi con 10 snSO4.
- Non è necessario ulteriore stress da ferro o zinco, poiché i media sono già esauriti, quindi i geni reattivi saranno già espressi. Se si desidera ulteriore stress, si consiglia di non più di 1-2 M di deferoxamina o TPEN, poiché lo stress eccessivo impedirà alle colture di crescere.
- Coltivare le colture come nel passaggio 4.5 per 4 h e registrare la densità finale delle cellule dei campioni. Le culture meno sovraccariche di metalli raggiungeranno una densità finale più elevata.
- Standardizzare le colture ad una densità adeguata e preparare listi.
- Standardizzare i listi a cellule intere a una densità equivalente a 100 unità Klett in 1 mL di coltura. Per ottenere questo risultato, dividete 100 per la densità dell'unità Klett del campione. Il numero che si ottiene è il volume, in mL, di coltura che verrà utilizzato per rendere la pellet cellulare.
- Seguire le procedure standard SDS-PAGE e Western blotting15 per sondare le proteine di interesse.
6. Saggi di crescita con limitato di metalli
NOTA: Questi saggi descrivono le premiscele di crescita precostituite. La preparazione di queste miscele è descritta nella sezione 8.
- Durante il raddoppio della massa nel passaggio 4.5, pretrattare i pozzi di una micropiastra da 96 pozzeconto con premix 10x. Inoltre, designare tre pozzi da servire come spazi vuoti. A questi pozze, aggiungere 10 L di 10x premix e 90 L di CDM.
- Una volta raddoppiate le colture dei flaconi dell'arma laterale, aggiungere 100 l di ogni coltura a un pozzo inutilizzato nella microplacca e misurare la densità ottica a 600 nm (OD600). Questo può essere fatto con cuvettein in uno spettrometro, ma con un maggior numero di ceppi all'interno di un saggio questo può diventare ingombrante e generalmente non è consigliato a meno che lo spettrofotometro può misurare direttamente dal braccio del braccio laterale (Figura supplementare 2).
- Durante la misurazione dell'OD, riporre i flaconi nell'incubatrice per garantire che i gonococci rimangano vitali.
- Calcolare la corretta quantità di diluizione necessaria per portare le colture a OD600 x 0,02. I premix 10x hanno un effetto trascurabile sull'OD e possono essere omessi dal calcolo.
- Diluire le colture con CDM in piccoli tubi di coltura e aggiungere un volume sufficiente per diluire i premi 10x a 1x nella piastra. Se è disponibile un riscaldamento a piastra, tenere la piastra a 37 gradi centigradi mentre si lavora.
- Incubare la piastra per 8-12 h con agitazione in un lettore di lamiere, prendendo600 misurazioni OD a intervalli desiderati.
7. Rilevamento del rilegatura del ligando da parte dei trasportatori di metalli a membrana esterna
- Trattare le culture come desiderato al punto 5.1, quindi incubare con agitazione per 4 h.
- Poco prima del marchio 4 h, tagliare tre pezzi di carta da filtro e un pezzo di nitrocellulosa alla dimensione approssimativa necessaria per adattarsi a un apparato macchia punto (Figura supplementare 3). Presoak la nitrocellulosa in acqua deionizzata, quindi assemblare l'apparato con carta da filtro sotto la nitrocellulosa.
- A 4 h, registrare la densità delle cellule e standardizzare ad una densità finale appropriata. Si consiglia di utilizzare il 10% della densità utilizzata per la preparazione delle lisate cellulari nel passaggio 5. Ad esempio, se si utilizza 100 KU in 1 mL per i lismi, ciò significa 10 KU in 1 mL per questi set di macchie. Il calcolo è altrimenti lo stesso descritto in 5.3.1 e le culture vengono aggiunte direttamente alla nitrocellulosa nei volumi calcolati piuttosto che trasformate in lisari.
- Le colture cellulari pipet sulla nitrocellulosa e consentono tempo sufficiente per la carta filtrante per assorbire tutto il liquido.
- Smontare l'apparato, lasciare asciugare la macchia e bloccare la membrana di nitrocellulosa per 1 h in 5% di albumina di siero bovino o latte non grasso (w/v) in salina con buffer Tris.
- Rimontare l'apparato macchia del punto, sostituendo la carta da filtro con pellicola di paraffina per creare una guarnizione a prova di perdita sotto la nitrocellulosa.
- Diluire il ligando metallico di interesse a 0,2 M nelle celle bloccante e sonda per 1 h.
- Sifone dal liquido con un vuoto, lavare la macchia, quindi seguire le procedure immunologiche standard per sviluppare il segnale16. I passaggi di lavaggio possono essere eseguiti all'esterno o all'esterno dell'apparecchio.
8. Caricamento metallico di Transferrin, S100A7 e Calprotectin e Preparazione di premi 10x
NOTA: Come con la preparazione CDM, utilizzare vetro lavato acido o plastica per la preparazione della soluzione.
- Sciogliere la transferrina umana a 10 mg/mL (125 mL) nel buffer iniziale (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH - 8,4). S100A7 e calprotectin sono sospesi in buffer costituito da 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol e 1 mM CaCl2, pH - 8,0).
- Aggiungere alla soluzione di ferrazione la soluzione di ferrazione (100 mM di citrato di sodio, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH - 8,4) alla soluzione di transferrina per ottenere una saturazione di ferro del 30% (ad esempio, 75 gradi di soluzione di ferrazione è adatta per il transferrin5 mL se effettuata a 10 mg/mL).
- Aggiungete il 4a S100A7 o la calprotectina con un rapporto molare del 50% rispetto alla proteina per creare una saturazione del 25% (ogni molecola proteica ha due siti di legame metallico). È possibile utilizzare i preparativi di 100 S100A7 o calprotectin con 50 M nSO4.
- Per entrambi i casi, consentire la miscelazione end-over-end per almeno 1 h per il carico di metallo.
- Preparare 4 L di buffer di dialisi (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH - 7.4). Dividere questo in due volumi separati 2 L e posizionarne uno a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere le proteine metalliche caricate in una cassetta di dialisi utilizzando una siringa e dialyze contro il primo volume tampone per 4 h a RT.
- Spostare la cassetta sul secondo volume tampone e dialare durante la notte a 4 gradi centigradi. Dopo questi passaggi, tutti i metalli non associati devono essere rimossi.
NOTA: Consigliamo un saggio di acido bicinchoninico per determinare le concentrazioni di proteine dopo la dialisi. - Utilizzare una premix 10x transferrin per l'utilizzo del transferrin come unica fonte di ferro.
- Preparare questa premix diluindo il 30% di trasferimento umano Fe-transferrin e di opotrasferimento bovino (preparato a 125 M come descritto per il transferrin umano, senza la fase di carico di ferro) rispettivamente a 75 e 30M, rispettivamente, in PBS. Una premiazione di controllo positiva sostituisce il 30% di Fe-transferrin con 75 Fe(NO3)3, e una premidicina di controllo negativo omette qualsiasi ferro aggiunto, mantenendo solo l'apo-transferrin bovino. Nel saggio di crescita, diluire 10 l di questi concentrati con 90 . Le concentrazioni finali sono pari al 7,5 M -30% di Fe-transferrin umano e 3 m di apo-transferrin bovino.
- Utilizzare una versione modificata della premix transferrin 10x per l'utilizzo di S100A7 o calprotectin come unica fonte di zinco.
- Per una premix di controllo positivo, incorporare 50 M nSO4 nella premix di trasferimento. Per un controllo negativo, incorporare 50 TPEN e omettere lo zinco. Quindi, prendere 10 l di ciascuno di questi per ogni campione ben necessario, e spostare quel volume in un nuovo tubo. Aggiungete a questo mezzo volume di PBS sterile. Ad esempio, se 10 pozze riceveranno la premix di controllo positivo, prendere 100 L di premix, spostarlo in un nuovo tubo e aggiungere 50 L di PBS. Eseguire la stessa operazione per il controllo negativo.
- Per fare la premix S100A7 o calprotectin, prendere 10 L della premix di controllo negativo per ben necessario, passare a un nuovo tubo, e aggiungere la metà di quel volume del 25% n-S100A7 o calprotectin. Nel pezzetto di crescita, utilizzare 15 l di premieri e diluire con 85 l l di coltura. Le concentrazioni finali per i trasferimenti rimangono le stesse del punto 8,5, con un aumento di 5 M di N, TPEN o S100A7/calprotectin.
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Representative Results
Uno specifico mezzo definito in assenza di metalli traccia per la crescita di Neisseria gonorrhoeae è stato sviluppato e implementato per la caratterizzazione dei geni che rispondono ai metalli e dei loro prodotti genici. Nel protocollo ottimizzato, il profilo metallico dei supporti è controllato aggiungendo metalli a discrezione dello sperimentatore, piuttosto che titerando chelazione di un bersaglio metallico, consentendo un maggiore controllo e coerenza da laboratorio a laboratorio e sperimentando per sperimentare. Questo supporto può essere impiegato sia in stato liquido che solido, rendendolo versatile in molte configurazioni sperimentali.
La produzione differenziale di proteine nelle concentrazioni variabili di metallo può essere vista nelle macchie occidentali rappresentative incluse(Figura 1). L'immagine mostra i trasportatori a membrana esterna tdfJ e TdfH, che sono stati potenziati in risposta alla chelazione dello zinco da TPEN. TdfJ era essenzialmente inosservabile quando lo zinco è stato aggiunto di nuovo ai media, e TdfH era scarso. Inoltre, il promotore del tdfJ è noto per essere indotto, piuttosto che represso, dal ferro. Questo è visibile anche nella macchia. Queste macchie hanno utilizzato la lipoproteina a ferro-reT TbpB2 come un controllo di carico. In condizioni di aggiunta di ferro, la produzione di TbpB è stata ridotta.
I saggi di crescita con limiti di metalli dimostrano l'utilizzo di fonti di zinco specifiche e definite dal gonococco (Figura 2). Figura 2Mostra N. gonorrhoeae in crescita in presenza di calprotectin (CP) carico di zinco, che richiede l'azione del TdfH17,18. Quando non era disponibile alcuna fonte di zinco utilizzabile, né attraverso l'aggiunta di zinco o per assenza di TdfH, la crescita è stata limitata. Figura 2B mostra risultati simili in presenza di S100A7, che può servire come una fonte di zinco sola quando il trasportatore di membrana esterna TdfJ viene prodotto19. In presenza di TPEN da solo o quando TdfJ era assente, la crescita è stata ostacolata, ma l'aggiunta di n-S100A7 ha recuperato la crescita in modo dipendente da TdfJ. Infine, Figura 2C Mostra un errore sperimentale. In questo esempio, la fase di diluizione delle colture gonococcale non era sufficiente per esaurire i batteri delle piscine di zinco interne rispetto al volume totale di coltura nella micropiastra. Di conseguenza, la crescita del controllo negativo ha superato l'OD desiderato.
Il legame specifico di intere cellule gonococcali ai rispettivi ligandi è dimostrato da macchie di punti provenienti da colture preparate in condizioni di limitazione dei metalli e di metallo -Figura 3). La figura 3A,B mostra che i gonococci coltivati in CDM sono stati in grado di legare CP e S100A7 durante la produzione rispettivamente di TdfH e TdfJ, a causa della scarsità di zinco. Figura 3C confronta il legame di transferrin, che viene realizzato dalle proteine cognate fatte dai geni di ferro-sensing tbpA e tbpB20, quando i gonococci sono coltivati in CDM solo vs GC brodo medio trattati con il ferro chelatore deferoxamine. Questa figura mostra un maggiore legame del transferrina da parte delle colture coltivate in CDM, che è indicativo di livelli più elevati di espressione proteica a causa della natura più impoverita di ferro del CDM rispetto al brodo GC chelato.
Figura 1: Caratteristica della macchia occidentale che mostra la produzione differenziale di proteine metalliche reattive. (A) Neisseria ceppo di tipo selvaggio FA19 è stato coltivato in CDM integrato con nSO4, Fe(NO3)3o TPEN nelle concentrazioni indicate. Dopo il trattamento, le colture sono state coltivate per 4 h prima che le lismi intera cellula di densità standardizzata sono state prodotte e sottoposte a SDS-PAGE e gonfiore occidentale. I livelli di produzione differenziali per TdfJ, che è sia repressa dallo zinco e indotta dal ferro, possono essere chiaramente visibili in risposta all'aggiunta/esaurimento dello zinco e all'addizione del ferro. (B) Le intensità del segnale relative per la macchia occidentale sono state quantificate tramite densitometria. Questa cifra è adattata da Maurakis et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Crescita limitata allo zinco dei gonococci. Ceppo di tipo selvatico FA19, o mutanti isogenici di questo ceppo che non producono tdfJ o tdfH, sono stati coltivati in (A) non trattato CDM fino a quando la fase esponenziale è stata raggiunta, (B) poi diluire di nuovo a OD600 - 0,02 e (C) OD600 - 0,1. I campioni in A sono stati trattati con premix contenenti calprotectin (in alto) o senza zinco aggiunto (in basso) e coltivati per 8 h. I campioni in B e C sono stati integrati con premix contenenti zinco libero, senza zinco (5 M TPEN), o S100A7, e coltivati per 6 h. La crescita in queste condizioni è stata recuperata solo al completamento di supporti con una fonte di zinco utilizzabile, come CP, S100A7, o zinco libero in A e B, mentre C non era sufficientemente diluito per esaurire le piscine interne di zinco cellulare. La figura 2A è adattata da Jean et al.17La figura 2B è adattata da Maurakis et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. I saggi vincolanti rappresentativi mostrano i ligandi ospiti vincolanti per i gonocchi inghiorati dal ricciolo. (A) Ceppo di tipo selvaggio FA1090, o mutanti di questo ceppo che non producono tdfJ, tdfH, o entrambi, sono stati coltivati in CDM senza metalli supplementari e sono stati punteggiati su nitrocellulosa in densità standardizzate. Le cellule sono state sondate con calprotectin, che è riconosciuta dal TdfH che risponde allo zinco, e il legame è stato valutato mediante rilevamento con un anticorpo anti-calprotectin (superiore). La rilegatura calprotectin relativa è stata quantificata tramite densitometria, mostrata qui su una scala di log (in basso). (B) Gli esperimenti di rilegatura sono stati eseguiti come descritto in A, ma utilizzando invece il ceppo di tipo selvaggio FA19 e il mutante tdfJ e completato ceppi in tale contesto. Le cellule sono state sondate con il marchio HRP S100A7, che è riconosciuto dal ceppo di tipo tdfJ. ( C ) wild reattivo allo zinco (C) il ceppo di tipo selvatico FA19 è stato coltivato fianco a fianco in CDM o GC brodo medio con 25 m di deferoxamina aggiunto per chelato ferro libero, punteggiato al nitrocellulosa in quantità standardizzate, e sondato con transferrin, che lega il Tbp sensibile al ferro. Questi test side-by-side dimostrano che il CDM, a differenza del brodo medio GC, non richiedeva una chelazione aggiuntiva per ottenere un ambiente a ferro limitato. La figura 3A è adattata da Jean et al. e il fondo di Maurakis et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I mezzi di crescita riscantono una varietà di ruoli nella ricerca microbiologica. I supporti specializzati vengono utilizzati per la selezione, l'arricchimento e varie altre applicazioni per molti tipi di studio unici. Una di queste applicazioni è l'induzione di geni che rispondono ai metalli, che viene in genere realizzata mediante l'aggiunta di un chelante specifico che si rivolge a un particolare ione metallico. Questo metodo è limitato, in quanto la quantità di chelazione necessaria per vari metalli traccia è probabilmente variabile a causa di diverse fonti d'acqua contenenti profili metallici unici, e due lotti dello stesso ingrediente media contenente diverse concentrazioni di metalli6. Per evitare questa carenza intrinseca, abbiamo descritto la preparazione e l'uso di un supporto definito che viene trattato con resina Chelex-100 per rimuovere tutti i metalli traccia in massa, consentendo l'aggiunta controllata di metalli specificati di nuovo nel mezzo in base alle esigenze.
Nel protocollo attuale, il primo punto importante di discussione è l'acqua di origine. Il protocollo descrive un trattamento Chelex che è sufficiente per rimuovere i metalli dal laboratorio di tipo 2 (1,0 megaOhms-cm secondo le specifiche ISO 3696). Diverse fonti d'acqua richiederanno probabilmente trattamenti Chelex più brevi o più lunghi. Abbiamo scoperto che l'acqua di maggiore purezza rispetto al tipo 2, come l'acqua di grado di biologia molecolare, non sosterrà la crescita batterica in questa applicazione. La scelta della nave per la preparazione dei supporti è altrettanto importante della fonte d'acqua. Consigliamo vivamente contenitori di plastica puliti, poiché la vetreria può lisciviare gli ioni metallici nella soluzione. Se il materiale plastico non è disponibile, la vetreria deve essere lavata acidi per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Lo stesso lavaggio acido è necessario per i flaconi di coltura quando si utilizza CDM.
Crescita di Neisseria gonorrhoeae in un ambiente in vitro può essere molto impegnativo, come questo organismo si è evoluto per prosperare specificamente in ospiti umani21. Mentre il CDM è adatto a sostenere la crescita per tutta la durata degli esperimenti, durante l'inoculazione e le misure di diluizione devono essere prese attenzione per garantire che i gonocci non si trovino in condizioni atmosferiche più lunghe del necessario. A causa della natura capnophilifica dei gonococci22 e della sua predilezione per le temperature che si trovano all'interno degli ospiti umani, si consiglia di non mantenere le colture in condizioni atmosferiche per più di 15 min. Se l'evento di raddoppio di massa iniziale descritto nel passaggio 4.5 del metodo richiede più di 2 h, è probabile che le impostazioni cultura gonococcali non siano state gestite correttamente e che l'esperimento venga interrotto.
Mentre l'attenzione di questo metodo è sui metodi per la crescita e la caratterizzazione di Neisseria gonorrhoeae specificamente, l'uso di questo specifico CDM è probabilmente adatto anche per lo studio di altre specie di Neisseria. Inoltre, può essere facilmente applicato alla caratterizzazione di altri sistemi di rilevamento dei metalli in altri batteri. Ad esempio, un supporto simile privo di metalli è stato utilizzato per caratterizzare l'assorbimento di metalli in Staphylococcus aureus23 ed Escherichia coli24. L'utilizzo della ricetta descritta per altri batteri comporta probabilmente piccole modifiche o aggiunte, a seconda delle esigenze nutrizionali specifiche dei batteri in questione. Ad esempio, supplemento VIII è incluso nella ricetta per aiutare con la necessità di gonococco per CO supplementare2. Come descritto in precedenza, la crescita viene eseguita a 37 gradi centigradi con un'atmosfera di CO2 del 5%, ma abbiamo scoperto che l'aggiunta di bicarbonato supplementare nei media aiuta le fasi iniziali della crescita gonococcale nel mezzo definito. Per gli organismi senza tale requisito, questo ingrediente può essere omesso. Purtroppo, ulteriori esempi di queste modifiche devono essere determinati empiricamente.
Nonostante la necessità di adattare il metodo un po 'per l'uso con altri batteri, il quadro di base dovrebbe essere appropriato per un uso ampio. La caratterizzazione di geni e trasportatori di metalli che rispondono ai metalli è un impegno continuo nello studio microbico, con batteri tra cui Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30, e E.31 tutti ricevendo attenzione in questa nicchia. Il nostro utilizzo futuro di questa tecnica mira a promuovere la comprensione di altri sistemi di assorbimento dei metalli gonococcali oltre a quelli già menzionati, che permettono al gonococco di acquisire ferro da proteine ospiti come lactoferrina32,33, emoglobina34,35, e anche da xenagliori batterici36, e di espandere i nostri studi sugli effetti di altri metalli come il manganese, che è stato implicato nella difesa da stress ossidativo di Neisseria12,37.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01 AI125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. L'autore dello scrittore desidera ringraziare tutti i membri del laboratorio che hanno contribuito alla revisione e alla revisione di questo metodo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
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