Summary
Il protocollo presenta i parametri ottimizzati per la preparazione di liposomi termosensibili utilizzando il dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato. Questo permette anche co-incapsulazione di doxorubicina e verde indocianina nei liposomi e il rilascio fototermico innescato di doxorubicina per il rilascio di droga controllato / innescato.
Abstract
Il protocollo presentato consente una preparazione continua ad alto consumo di liposomi sensibili alla bassa temperatura (LTSL), che sono in grado di caricare farmaci chemioterapici, come doxorubicina (DOX). Per raggiungere questo obiettivo, una miscela di lipidi etanolici e una soluzione di solfato di ammonio vengono iniettati in un dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato (SHM). Le soluzioni sono rapidamente mescolate dal SHM, fornendo un ambiente di solvente omogeneo per l'auto-assemblaggio dei liposomi. I liposomi raccolti vengono prima anuniti, quindi dializzati per rimuovere l'etanolo residuo. Un gradiente di pH solfato di ammonio viene stabilito attraverso lo scambio tampone della soluzione esterna utilizzando la cromatografia di esclusione di dimensioni. DOX viene quindi caricato a distanza nei liposomi con elevata efficienza di incapsulamento (> 80%). I liposomi ottenuti hanno dimensioni omogenee con diametro medio di 100 nm. Sono in grado di innescare la temperatura di rilascio a raffica di DOX incapsulato in presenza di ipertermia lieve (42 gradi centigradi). Indocyanine green (ICG) può anche essere co-caricato nei liposomi per il rilascio DOX a infrarossi vicino a infrarossi. L'approccio microfluidico garantisce una preparazione ad alta produttività, riproducibile e scalabile delle LLT.
Introduction
La formulazione LTSL è un prodotto liposomico clinicamente rilevante che è stato sviluppato per fornire il farmaco chemioterapico doxorubicin (DOX)e consente un efficiente rilascio di farmaci a raffica a ipertermia lieve clinicamente raggiungibile (T 41 . La formulazione LTSL è composta da 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), il lysolipido1-stearoyl-2-idrossi-sn -glycero-3-phosphatidylcho (MSPC; M sta per "mono") e PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Una volta raggiunta la temperatura di transizione di fase (Tm ) , i lincidi e dSPE-PEG2000 insieme facilitano la formazione dei pori della membrana, con conseguente rilascio di scoppio del farmaco2. La preparazione di LTSL utilizza principalmente un approccio bulk dall'alto verso il basso, vale a dire l'idratazione e l'estrusione delle pellicole lipidiche. Resta difficile preparare in modo riproducibile grandi lotti con proprietà identiche e in quantità sufficienti per le applicazioni cliniche3.
La microfluidica è una tecnica emergente per la preparazione dei liposomi, che offre dimensioni delle nanoparticelle regolabili, riproducibilità e scalabilità3. Una volta ottimizzati i parametri di produzione, la velocità effettiva potrebbe essere aumentata mediante parallelizzazione, con proprietà identiche a quelle preparate in scala di panca3,4,5. Uno dei principali vantaggi della microfluidica rispetto alle tecniche di massa convenzionali è la capacità di gestire piccoli volumi di liquidi con elevata controllabilità nello spazio e nel tempo attraverso la miniaturizzazione, consentendo un'ottimizzazione più veloce, operando in modo continuo e automatizzato6. La produzione di liposomi con dispositivi microfluidici è ottenuta da un approccio di nanoprecipitazioni dal basso verso l'alto, che è più efficiente in termini di tempo ed energia perché i processi di omogeneizzazione come l'estrusione e la sonicazione non sono necessari7. Tipicamente, una soluzione organica (ad esempio etanolo) di lipidi (e carico idrofobico) viene mescolata con un non solvente miscibile (ad esempio acqua e carico idrofilo). Come il solvente organico si mescola con il non solvente, la solubilità per i lipidi è ridotta. La concentrazione di lipidi alla fine raggiunge una concentrazione critica in cui viene attivato il processo di precipitazione7. Nanoprecipitati di lipidi alla fine crescono di dimensioni e si chiudono in un liposoma. I principali fattori che regolano le dimensioni e l'omogeneità dei liposomi sono il rapporto tra il non solvente e il solvente (cioè il rapporto di portata acquoso-organico; FRR) e l'omogeneità dell'ambiente solvente durante l'auto-assemblaggio dei lipidi in liposomi8.
La miscelazione efficiente dei fluidi in microfluidica è quindi essenziale per la preparazione di liposomi omogenei, e vari progetti di miscelatori sono stati impiegati in diverse applicazioni9. Il micromixer a spina di pesce sfalsato (SHM) rappresenta una delle nuove generazioni di miscelatori passivi, che consente un'elevata produttività (nella gamma di mL/min) con un fattore di diluizione basso. Questo è superiore ai tradizionali dispositivi di miscelazione idrodinamica microfluidica8,10. Lo SHM ha modellato scanalature a spina di pesce, che mescolano rapidamente fluidi per advezione caotica9,11. La breve scala cronologica di miscelazione di SHM (< 5 ms, inferiore alla tipica scala temporale di aggregazione di 10-100 ms) consente l'autoassemblaggio dei lipidi in un ambiente omogeneo, producendo nanoparticelle con distribuzione uniforme delle dimensioni3,12.
La preparazione di LTSL con microfluidica non è, tuttavia, così semplice rispetto alle formulazioni liposomiche convenzionali a causa della mancanza di colesterolo8, senza il quale i bistrati lipidici sono suscettibili all'interdigitalizzazione indotta dall'etanolo13,14,15. Fino ad ora, l'effetto dell'etanolo residuo si presenta durante la produzione microfluidica di liposomi non è stato ben compreso. La maggior parte delle formulazioni segnalate sono intrinsecamente resistenti all'interdigitazione (contenente colesterolo o lipidi insaturi)16, che a differenza delle LTSL sono sia saturi che privi di colesterolo.
Il protocollo qui presentato utilizza SHM per preparare i LTSL per la somministrazione di farmaci a rilascio di temperatura. Nel metodo presentato, abbiamo assicurato che i LTSL microfluidici-preparati sono nano-dimensioni (100 nm) e uniforme (dispersità < 0.2) da dispersione dinamica della luce (DLS). Inoltre, abbiamo incapsulato DOX usando il metodo del gradiente di solfato di ammonio transmembrana (noto anche come caricamento remoto)17 come convalida dell'integrità del bistrato lipidico LTSL. Il caricamento a distanza del DOX richiede che il liposoma mantenga un gradiente di pH al fine di ottenere un'elevata efficienza di incapsulamento (EE), che è improbabile che si verifichi senza un bistrato lipidico intatto. In questo metodo presentato, distintivo dai tipici protocolli di preparazione del liposoma microfluidico, è necessaria una fase di annealing prima che l'etanolo venga rimosso per abilitare la capacità di caricamento remoto; cioè per ripristinare l'integrità del bistrato lipidico.
Come accennato in precedenza, i carichi idrofili e idrofobici possono anche essere introdotti alle soluzioni iniziali per l'incapsulamento simultaneo dei carichi utili durante la formazione di LTSL. Come proof-of-concept, il verde indocianina (ICG), un coloranti fluorescente a infrarossi vicino alla FDA, che è anche un promettente agente fototermico, viene introdotto nella miscela di lipidi iniziali e co-caricato con successo nelle LSL. Un laser da 808 nm viene utilizzato per irradiare i LTS caricati da DOX/ICG e indurre con successo il rilascio a scoppio di DOX innescato dal riscaldamento fototermico entro 5 min.
Tutti gli strumenti e i materiali sono disponibili in commercio, pronti all'uso e senza bisogno di personalizzazione. Poiché tutti i parametri per la formulazione dei lPSL sono stati ottimizzati, seguendo questo protocollo, i ricercatori senza alcuna conoscenza preliminare della microfluidica potrebbero anche preparare i LTSL, che funge da base per un sistema di somministrazione di farmaci termosensibili.
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Protocol
1. Configurazione dell'attrezzatura
- Assemblare le pompe di siringhe e SHM come segue.
- Collegare la porta "To Computer" della pompa di siringa secondaria (Pompa 02, per soluzione acquosa) alla porta "To Network" della pompa della siringa master (Pompa 01, per soluzione lipidi etanolo) utilizzando Pump to Pump network cable (Figura 1, giallo).
- Collegare la porta "Al computer" della pompa master alla porta "RS232 Serial" del computer utilizzando il PC per pompare il cavo di rete (Figura 1, blu).
- Collegare i tubi a ciascuna delle prese e delle prese del SHM utilizzando un dado e ferrule. Convertire il terminale del tubo per entrambe le insenature in Luer femmina utilizzando un altro dado e ferrule e un assieme di unione. Il tubo più lungo delle insenature consente un più facile attaccamento alle siringhe (Figura 2).
- Impostare il software di controllo della pompa.
- Assegnare l'indirizzo della pompa della siringa master e della pompa della siringa secondaria a "Ad:01" e "Ad:02", rispettivamente, utilizzando il pulsante "Setup" della pompa della siringa. Questo deve essere fatto solo per la prima volta.
- Aprire il software di controllo della pompa sul computer. Le due pompe di siringhe devono essere rilevate automaticamente, seguite da un segnale acustico. In caso contrario, fare clic su Pompe e cercare pompe per aggiornare la connessione. (Figura 3).
- Assegnare diametro a 12,45 (mm) scegliendo "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia-12.45)".
- Assegna Velocità a 0,25 mL/min per pompa 01 (soluzione lipidiarica anololo) e 0,75 mL/min per la pompa 02 (soluzione aquess). Le portate corrispondono a una portata totale (TFR) di 1 mL/min e aqueous-to-etanol flow rate ratio (FRR) di 3.
- Assegnare Volume a qualsiasi valore superiore a 5 mL.
NOTA: Il volume di infusione mirato è impostato su un volume superiore al volume liquido caricato considerando il volume vuoto del tubo. - Selezionare la modalità INF (infusione) per entrambe le pompe.
- Premere Set per confermare le impostazioni.
2. Preparare i lPL
- Preparare una miscela di lipidi LTSL10 o LTSL10-ICG (vedere la tabella 1).
- Ritirare 1 mL di miscela di lipidi e almeno 3 mL di (NH4)2SO4 soluzione utilizzando due siringhe di blocco 5 mL Luer.
- Installare le due siringhe sulle pompe di siringa in posizione eretta facendo scorrere la flangia della canna della siringa al fermo siringa della pompa e la flangia di tuffo della siringa al blocco pusher della pompa (Figura 4).
- Avvolgere l'estremità del nastro riscaldante sulla siringa con la soluzione acquosa. Avvolgere l'altra estremità del nastro riscaldante e la sonda di temperatura del termostato intorno alla siringa con la soluzione lipidi. È utile esercitarsi con siringhe vuote per facilitare il processo di assemblaggio (Figura 5A).
- Collegare le due siringhe agli adattatori Luer femminili delle corrispondenti prese dello SHM. Assicurarsi che le siringhe contenenti la miscela di lipidi e (NH4)2SO4 soluzioni siano collegate insolla e inserito, rispettivamente. Regolare la posizione dello stantuffo per rimuovere le bolle d'aria dalle siringhe (Figura 5B).
NOTA: Assicurarsi che le siringhe siano ancora posizionate saldamente sul fermo siringa delle pompe. - Riscaldare le siringhe al di sopra di 51 gradi centigradi utilizzando il nastro riscaldante utilizzando una sessione di riscaldamento da 10 s. Lasciare che il termostato aggiorni la temperatura delle siringhe. Ripetere questo passaggio nei passaggi seguenti per mantenere la temperatura durante l'infusione.
AMMONIMento: Spegnere il nastro riscaldante dopo 10 s per evitare l'superamento della temperatura e consentire al termostato di aggiornare la temperatura effettiva. Il nastro riscaldante deve anche essere maneggiato con cura in quanto la sua temperatura aumenta molto rapidamente. Riscaldamento continuo può danneggiare l'apparecchiatura e siringhe, a causa del ritardo di tempo del termostato per l'aggiornamento della temperatura misurata. - Una volta che la temperatura è superiore a 51 gradi centigradi, eseguire le pompe di siringhe premendo Run All nel software di controllo della pompa (Figura 3).
- Assicurarsi che il flusso di fluido sia privo di bolle d'aria e di eventuali perdite. Smaltire il volume iniziale (circa 0,5 mL) di liquido dalla presa come rifiuto.
NOTA: Questo volume di rifiuti iniziale non è definito e dipende dal volume interno dell'installazione, ovvero il volume per il fluido per viaggiare dalle siringhe attraverso il tubo e SHM alla presa. - Raccogliere il resto del liquido come campioni di liposoma in un tubo di microcentrifuga o fiala bijou.
- Mettere in pausa/arrestare l'infusione quando il liquido in una delle siringhe è quasi vuoto.
NOTA: Le pompe devono essere fermate manualmente, poiché le pompe potrebbero non rilevare con precisione la posizione quando le siringhe sono vuote. - Collocare le soluzioni liposomiche raccolte in un bagno d'acqua di 60 gradi per anneal per 1,5 h.
NOTA: Questo passaggio è essenziale per consentire il caricamento di farmaci nei liposomi. - Trasferire le soluzioni ai tubi di dialisi. Dialyze le soluzioni contro 1 L di 240 mM (NH4)2SO4 a 37 s per almeno 4 h per ottenere liposomi purificati.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I liposomi in questa fase sono a 5 mM di fosfolipidi. I liinfoani purificati possono essere conservati a 4 gradi centigradi. - Per pulire lo SHM per un uso ripetuto, lavare lo SHM in sequenza con acqua deionizzata, etanolo e secco con gas di azoto.
3. Caricamento remoto di DOX in LTSLs con gradiente di pH transmembrana
- Scambiare buffer esterno di LTSL a HEPES-buffered saline (HBS) utilizzando la cromatografia di esclusione di dimensioni (SEC) per stabilire un gradiente di pH transmembrana.
- Aggiungere un totale di 25 mL di HBS nella parte superiore di una colonna SEC per preparare la colonna. Lasciare che tutto eluente elute attraverso la colonna e smaltire l'eluato.
- Aggiungere 1 mL di liposomi dialisti, preparati dal punto 2.12, alla colonna e smaltire l'elute.
- Aggiungere 1,5 mL di HBS alla colonna ed eliminare l'elute.
- Aggiungere 3 mL di HBS alla colonna e raccogliere il 3 mL di elute.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I liposomi vengono raccolti in questa fase e sono a 1,67 mM di fosforiide. I liposomi scambiati buffer possono essere conservati a 4 gradi centigradi.
- Incubare i LTSL con doxorubicin (DOX) e purificare i LTSL.
- Aggiungi la soluzione DOX in 1:20 rapporto molare DA DOX a fosforolipilide in 1 mL di soluzione liposomi scambiata tampone (1,67 mmol) contenuta in una fiala bijou. Ciò può essere ottenuto aggiungendo una soluzione DOX di 1 mg/mL (83,4 ml).
- Mettere la fiala bijou in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 1,5 h per consentire il caricamento DOX nei liposomi.
- Mescolare 10 l dei liposomi con 170 luna di HBS e 20 -L di 1% (v/v) Triton X-100 soluzione in una piastra nera 96-bene. Ripetere per tre pozze. Questi pozzi corrispondono al contenuto DOX "prima della purificazione".
- In caso di preparazione del LTSL10-ICG, mescolare 40 - L dei liposomi con 160 L di DMSO in una piastra chiara 96-well. Ripetere per tre pozze. Questi pozzi corrispondono al contenuto ICG "prima della purificazione".
- Purificare la soluzione lipososo come descritto nel passaggio 3.1.
NOTA: per riutilizzare la colonna per una futura purificazione, pulire la colonna dal DOX gratuito aggiungendo prima 1 mL di soluzione NaOH diluita prima di eseguire il passaggio 3.1.1. DoX gratuito in rosso diventerà viola-blu ed eluire attraverso la colonna rapidamente. - Mescolare 30 l della soluzione di liposomi purificati con 150 gradi l di HBS e 20 -L di 1% (v/v) Soluzione Triton X-100 in una piastra nera 96-well. Ripetere per tre pozze. Questi pozzi corrispondono al contenuto DOX "dopo la purificazione".
- In caso di LTSL10-ICG, mescolare 40 l della soluzione di liposomi purificati con 160 L di DMSO in una piastra chiara di 96 pozze. Ripetere per tre pozze. Questi pozzi corrispondono al contenuto ICG "dopo la purificazione".
- Misurare l'intensità di fluorescenza DOX dei pozzi prima (passaggio 3.2.3) e dopo la purificazione (passaggio 3.2.5) utilizzando un lettore di microplacio (seziones .
- Calcolare l'efficienza di incapsulamento di DOX (DOX EE) prendendo il rapporto delle intensità di fluorescenza prima e dopo la purificazione.
- Misurare l'assorbimento ICG dei pozzi prima e dopo la purificazione, utilizzando un lettore di micropla (600 a 1000 nm).
- Calcolare l'efficienza di incapsulamento di ICG (ICG EE) tenendo il rapporto tra assorbimento a 792 nm prima e dopo la purificazione, tenendo conto del fattore di diluizione (3 volte) durante la purificazione.
4. Dispersione dinamica della luce (DLS)
- Aggiungete 50 - L di liposomi (passaggio 2,12) a 450 -L di acqua deionizzata.
- Posizionare la cuvette all'interno dello strumento DLS ed eseguire la misurazione secondo le istruzioni del produttore.
- Registrare il diametro medio medio di z e la dispersione di tre misure per ogni campione.
5. Calorimetria di scansione differenziale (DSC)
- Concentrare 1 mL dei campioni di liposomi (passaggio 2.12) con un'unità di filtro centrifuga a 0,5 mL (concentrazione lipidica finale di 10 mM). Utilizzando un rotore ad angolo fisso, girare a 7500 x g per circa 15 min.
- Trasferire 20 -L di (NH4)2campioni di soluzione SO4 e liposomi su due rispettive pentole DSC. Sigillare le pentole con coperchi ermetici DSC utilizzando il kit di pressa campione DSC.
- Misurare il campione da 30 a 60 gradi centigradi ad una velocità di riscaldamento di 1 oC/min utilizzando un calorimetro a scansione differenziale.
- Analizzare i dati con il software appropriato. Prendere la temperatura di transizione di fase (Tm)come l'inizio della transizione di fase (picco di fusione), che viene misurata dall'intercetta x della tangente del punto di pendenza massima.
6. Rilascio di Doxorubicina
- Preriscaldare l'HBS a temperatura designata (37 o 42 gradi centigradi) utilizzando un bagno d'acqua. Preparare un bagno d'acqua ghiacciata per sgranocchiare i campioni.
- Aggiungere 100 l di liposomi puri carichi DOX (passaggio 3.2.5) in 1,9 mL di HBS in un tubo di microcentrifuga. Collocare il tubo nel bagno d'acqua della temperatura designata.
- Ritirare immediatamente 200 l di campioni dal tubo e posizionarlo rapidamente nel bagno d'acqua ghiacciata per placare qualsiasi successivo rilascio di droga. L'esempio corrisponde al punto temporale iniziale (t - 0).
- Ritirare 200 l di campioni nei momenti successivi (t : 5, 10, 15, 30, 60 min) e posizionarlo rapidamente nel bagno d'acqua ghiacciata per placare qualsiasi rilascio di droga.
- Mescolare 50 l di campione di ogni punto temporale con 150 gradi l di HBS in una piastra nera di 96 pozze. Misurare l'intensità di fluorescenza DOX utilizzando un lettore di piastre.
- Aggiungete 20 L dell'1% (v/v) Triton X-100 in pozzi selezionati casuali preparati al punto 6.5. Misurare l'intensità di fluorescenza DOX di questi pozze utilizzando un lettore di piastre. Questi valori corrispondono al punto di tempo completamente rilasciato (t ] e versione 100%.
- Calcolare e tracciare la percentuale di DOX rilasciata interpolando l'intensità della fluorescenza di ogni punto temporale (I(t)), rispetto al valore iniziale (I(0)) e completamente rilasciato (I(z)).
7. Riscaldamento laser e rilascio innescato
- Impostare la temperatura del bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e lasciare che la temperatura si stabilizzi.
- Aggiungete 200 l di LTSL10-ICG caricato da DOX ([ICG] - 10 g/mL) a una piastra chiara da 96 pozze, quindi posizionatela nel bagno d'acqua, tenete il fondo immerso in acqua.
- Impostare la corrente del sistema laser su 2,27 A. Posizionare il collimatore del sistema laser a 5 cm verticalmente sopra la superficie della piastra di 96 pozzetti, che corrisponde a un flusso di energia di 0,5 W/cm2 [Figura 6].
AVVISO: Il sistema laser deve essere azionato in conformità con le misure di sicurezza laser pertinenti. - Accendere il laser e monitorare la temperatura ogni minuto utilizzando una sonda di temperatura in fibra ottica.
- A 5 e 10 min, prelevare 10 l di liposomi irradiati al laser dalla piastra chiara 96-well a e mescolare con 190 L di HBS per tre pozze in una piastra nera 96-po.
- Mescolare 10 l dei liposomi con 170 luna di HBS e 20 L della soluzione Triton X-100 dell'1% (v/v) per tre pozzetti in una piastra nera 96 pozze. Questi pozzi corrispondono al contenuto DOX "100% rilasciato". Misurare l'intensità fluorescente DOX e calcolare il rilascio DOX come descritto nel passaggio 6.7.
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Representative Results
La preparazione di LTSL mediante microfluidica richiede la composizione lipidica di DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, rapporto molare; LTSL10). Figura 7A (sinistra) mostra l'aspetto di LTSL10 preparato dal passaggio 2.9, come un liquido chiaro e non viscoso. La formulazione LTSL10 è sviluppata a partire dalla formulazione convenzionale, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, rapporto molare) poiché LTSL4 forma un campione viscoso simile ad gel, come indicato dalla grande quantità di bolle d'aria intrappolate nel campione (Figura 7A; a destra).
La misura DLS di LTSL10 (Figura 7B, rosso) ha mostrato che il diametro medio zo e la dispersione di LTSL10 erano rispettivamente 95,28 x 7,32 nm e 0,1000 , che indicano l'esito positivo dell'esperimento. La figura 7B (grigio) mostra anche un campione non ottimale, preparato a 20 gradi centigradi, dove sono stati ottenuti liposomi più grandi e dispersi.
Figura 7C mostra che il DOX EE di LTSL10. DOX EE dovrebbe essere di solito intorno all'80%. I LTSL preparati dal metodo convenzionale di idratazione delle pellicole lipidi con estrusione (LF) sono inclusi per il confronto, preparati come descritto altrove18. DOX EE di LTSL4 (LF) e LTSL10 (LF) ha mostrato un carico DOX decente di circa il 70% e il 50%, rispettivamente. L'inserimento di LTSL10 (passaggio 2.11) è essenziale per consentire il caricamento DOX. In assenza della fase di annessione, doX EE basso (< 20%) era persistente, indipendentemente dalla temperatura di incubazione (da 20 a 42 gradi centigradi) e dalla durata (da 1 a 24 h). Ciò indicava l'incapacità di LTSL10 di mantenere un gradiente di pH transmembrana, dove DOX veniva invece caricato passivamente o per adsorgezione. Annealing il LTSL10 come-preparato, DOX EE è aumentato in modo significativo a una media di 85%, indicando il successo del caricamento remoto di DOX e la presenza del gradiente di pH transmembrana.
Figura 7D Mostra il profilo di versione DOX di LTSL10. A 37 gradi centigradi, il rilascio di DOX incapsulato oltre 60 min era di circa il 10%. Al contrario, a 42 gradi centigradi, tutto il DOX incapsulato è stato rilasciato in 5 minuti, dimostrando la sensibilità alla temperatura di LTSL10. Risultati simili sono stati osservati con LTSL10 (LF) come controllo.
La figura 8 mostra la temperatura di transizione di fase (Tm)di LTSL10 caratterizzata dall'utilizzo di calorimetria a scansione differenziale (DSC). Le linee punteggiate come tangente del punto di pendenza massima vengono aggiunte come aiuto visivo della temperatura di transizione di fase di insorgenza (x-intercetta della linea tangente). LTSL10 ha una transizione di fase relativamente ampia con esordio a 41,6 gradi centigradi e un picco a 42,6 gradi centigradi. Risultati simili sono stati osservati con LTSL10 (LF), suggerendo una differenza minore tra le tecniche di preparazione. A titolo di confronto, la LTSL4 (LF) ha una transizione di fase più bassa e nitida, in accordo con la letteratura1.
Figura 9 Mostra la caratterizzazione di LTSL10-ICG. L'effetto della concentrazione iniziale di ICG sulle dimensioni (Figura 9A) e l'efficienza di carico di DOX e ICG (Figura 9B) sono classificati in tre intervalli di concentrazione. A bassa concentrazione di ICG (rapporto molare ICG-lipid di 0,003; concentrazione iniziale di 60 ICG e 20 mM di lipidi), la media zo, la dispersione e DOX EE erano simili a LTSL10 senza caricamento ICG; L'ICG EE era di circa il 75%. L'efficiente co-caricamento di DOX e ICG in LTSL10 può essere ottenuto a questa concentrazione ICG. A concentrazioni intermedie di ICG, mentre le dimensioni e la dispersione dei campioni erano soddisfacenti, sia il DOX che l'ICG EE sono stati ridotti. In particolare, la diminuzione del DOX EE ha indicato l'interruzione della membrana liposomica e, quindi, il pH-gradient. Ad alte concentrazioni di ICG, i campioni sono stati nuovamente vinttati; DOX e ICG EE sono stati entrambi significativamente diminuiti.
LTSL10-ICG è stato irradiato con laser a infrarossi vicino (sezione 7) per indurre il riscaldamento fototermico e ha innescato il rilascio di DOX (Figura 10). Dopo l'irradiazione laser, il campione si è riscaldato per la prima volta fino a 49,7 gradi centigradi con una graduale riduzione della temperatura. La successiva irradiazione laser ha aumentato la temperatura a 36,7 gradi centigradi. La quantificazione del DOX rilasciato ha indicato che un rilascio completo di burst del DOX incapsulato è stato raggiunto dopo il primo ciclo di riscaldamento. Questo era come previsto dal momento che la temperatura ha raggiunto al di sopra di 42 gradi centigradi, in accordo con il profilo di rilascio DOX mostrato Figura 7D. Al contrario, la LTSL10 senza ICG non è in grado di fornire riscaldamento fototermico e quindi non ha rilasciato DOX sull'irradiazione laser.
Figura 1: Fotografia della configurazione delle pompe di siringhe. La porta "To Network" della pompa master (Pompa 01) è collegata alla "Al Computer" della pompa secondaria (Pompa 02; giallo); la porta "Al computer" della pompa master è collegata alla porta RS-232 del computer (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fotografia della configurazione SHM. (A) Vista assemblata dell'impostazione SHM. (B) Vista esplosa dell'impostazione SHM. Le prese e le prese del SHM sono collegate ai tubi utilizzando un dado e un ferruleo. Il tubo di entrambe le insenature è esteso da un tubo più lungo con dado e ferrule su ogni estremità, terminato da un adattatore Luer femmina utilizzando un assieme di unione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Interfaccia del software di controllo della pompa. Le due pompe di siringhe devono essere rilevate automaticamente all'avvio del software; in caso contrario, fare clic su Pompe nell'angolo in alto a sinistra e cerca pompe. I parametri da configurare sono evidenziati in caselle rosse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Fotografia delle pompe a siringa e installazione di una siringa. (A) Staffa di fermo della siringa e siringa (2, una per lato) della pompa della siringa (scatola gialla). Blocco pusher, pollice di regolazione e pulsante dado (pulsante bianco a sinistra) della pompa della siringa (scatola verde). (B) Posizione di una siringa installata sulla pompa della siringa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Fotografia dell'assemblaggio di siringhe, elemento riscaldante e SHM. (A) Assemblaggio di siringhe, nastro riscaldante e termostato. (B) Assemblaggio di siringhe, nastro riscaldante, termostato e SHM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Fotografia dell'impostazione laser. (A) Fotografia del sistema laser accoppiato in fibra durante il funzionamento. (B) Posizione del collimatore 5 cm sopra la piastra 96-bene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Caratterizzazione di LTSL10. (A) Fotografia di (sinistra) LTSL10 e (destra) LTSL4, prima della dialisi. LTSL10 è apparso come liquido chiaro e non viscoso, mentre LTSL4 era gel-like e viscoso. (B) Diametro medio di 10 mM di LTSL10 preparato a 20 e 51 gradi centigradi. Le barre continue e i cerchi aperti (z) indicano rispettivamente il diametro e la dispersione della media zo.. (C) DOX EE di LTSL4 (LF; bianco), LTSL10 (LF; bianco) e LTSL10 prima (grigio) e dopo l'inserimento (rosso). (D) Rilascio DOX di LTSL10 (cerchio) e LTSL10 (LF; croce) a 37 gradi (nero) e 42 gradi centigradi (rosso). I dati rappresentano la media: SD di almeno tre esperimenti indipendenti. p < 0.001; t-test a due code non accoppiati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Proprietà termiche di LTSL10. Termografie di LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) e LTSL10 caratterizzate da DSC. Le linee punteggiate vengono aggiunte come aiuto visivo della temperatura di transizione della fase di insorgenza. I dati rappresentano la media di almeno tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Caratterizzazione di LTSL10-ICG. (A) Diametro medio di z (rosso) e dispersione (blu) di LTSL10 caricato iCG. (B) DOX EE (rosso) e ICG EE (verde) di LTSL10 caricato da ICG. I dati rappresentano la media : SD di almeno tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Il riscaldamento fototermico indotto dal laser ha innescato il rilascio di LTSL10 caricato da DOX e LTSL10-ICG. (A) La temperatura dei campioni irradiati eilrilascio DOX di LTSL10 caricato da DOX (blu) e LTSL10-ICG (rosso) durante il riscaldamento fototermico indotto dal laser. I dati rappresentano la media : SD di almeno tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Miscele di lipidi, buffer e soluzioni azionarie.
| 20 mM miscela di lipidi LTSL10 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, rapporto molare) |
Per 1 mL di 20 mM MISCELA di lipidi LTSL10: Sciogliere 11,75 mg di DPPC con 210 -L di stock di etanolo MSPC (5 mg/mL), 558 stock di etanolo DSPE-PEG2000 (10 mg/mL) e 232 - L di etanolo. In alternativa, quantità equivalente di MSPC (1.05 mg) e DSPE-PEG2000 (5.58 mg) può essere aggiunto come polvere. |
| 20 mM Miscela di lipidi LTSL10-ICG (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, rapporto molare; Rapporto molare ICG-lipidico : 0,003) |
Per 1 mL di 20 mM miscela di lipidi LTSL10 caricata da ICG: Sciogliere 11,75 mg di DPPC con 210 -L di stock di etanolo MSPC (5 mg/mL), 558 stock di etanolo DSPE-PEG2000 (10 mg/mL) e 46,5 - L di etanolo ICG (1 mg/mL) e 185,5 - L di etanolo. In alternativa, quantità equivalente di MSPC (1.05 mg) e DSPE-PEG2000 (5.58 mg) può essere aggiunto come polvere. Contiene 60 M di ICG e 20 mM di lipid. |
| Soluzione solfato di ammonio da 240 mM (NH4)2SO4, pH 5.4 | Sciogliere 31,71 g di (NH4)2SO4 per L di acqua deionizzata. Il pH della soluzione è nativo 5.4, non è necessaria una regolazione pH aggiuntiva. |
| Soluzione Doxorubicina (DOX), 1 mg/mL | Sciogliere 1 mg di DOX per mL di acqua deionizzata. |
| DSPE-PEG2000 etanolo, 10 mg/mL | Sciogliere 10 mg di DSPE-PEG2000 per mL di etanolo. |
| HEPES-buffered salina (HBS), pH 7.4 | Sciogliere 8,0 g di NaCl e 4,766 g di HEPES per L di acqua deionizzata. Regolare pH a 7,4 con la soluzione NaOH da 2,5 M. |
| Stock di etanolo ICG, 1 mg/mL | Sciogliere 1 mg di ICG per mL di etanolo. |
| Stock di etanolo MSPC, 5 mg/mL | Sciogliere 5 mg di DPPC per mL di etanolo. |
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Discussion
Il protocollo presentato descrive la preparazione di liposomi sensibili alla bassa temperatura (LTSL) utilizzando un micromixer a spina di pesce sfalsato (SHM). La formulazione LTSL10 consente il rilascio di scoppio innescato dalla temperatura di doxorubicina entro 5 minuti ad una temperatura ipertermica clinicamente raggiungibile di 42 gradi centigradi. Indocyanina verde (ICG) può anche essere co-caricato per il riscaldamento fototermico innescato il rilascio di DOX. Il metodo si basa su: (i) auto-assemblaggio di fosforidi in liposomi in un ambiente solvente omogeneizzato fornito dalla rapida e caotica miscelazione di soluzione di etanolo e solfato di ammonio nel SHM11; ii) l'annessione dei liposomi per preservare l'integrità del bistrato lipidico essenziale per il caricamento DOX; e (iii) caricamento remoto del DOX nelle LT da parte di un solfato di ammonio pH-sfumato17. Poiché le apparecchiature utilizzate in questo protocollo sono disponibili in commercio e i parametri sono ottimizzati, questo approccio è gestibile per gli utenti senza una conoscenza preliminare o un'esperienza microfluidica.
Uno dei passaggi più critici all'interno del protocollo consiste nell'assicurare che l'intero assieme sia fissato correttamente e che il fluido possa essere infuso correttamente (passaggio 2.5). Poiché la riproducibilità dell'autoassemblaggio dei liposomi si basa su un ambiente solvente omogeneizzato, qualsiasi instabilità, come lo slittamento delle siringhe o l'introduzione di bolle d'aria, disturba la stabilità del flusso fluido e si tradurrà in dimensioni lipososo e la dispersione. Questa è anche la logica alla base della fase 2.8, in cui il volume, costituito dal fluido che inizialmente occupa il canale e prima di raggiungere un flusso stabile, deve essere smaltito.
Un secondo passo critico per un esperimento di successo è la fase di annealing, per consentire un elevato DOX EE (passaggio 2.11). Nei liposomi senza colesterolo, i componenti della membrana che formano micelle (ad esempio MSPC e DSPE-PEG2000)si accumulano ai confini del grano con un alto grado di difetti per accogliere una curvatura ad alta membrana2. Questi arrangiamenti termodinamicamente favoriscono la formazione e stabilizzare i pori della membrana, i liposomi aperti o i dischi del biostrato. Il basso DOX EE di LTSL10 senza annealing ha suggerito che le strutture porose esistevano anche al di sotto di Tm, con conseguente assenza del gradiente di pH richiesto per il caricamento DOX (Figura 7C). La formazione prematura di pori al di sotto di Tm non è stata osservata per le LTSL preparate da pellicole lipidiche (LTSL4 (LF) e LTSL10 (LF)), dove non è richiesta l'annessione. Inoltre, anche le formulazioni contenenti colesterolo preparate dalla microfluidica non richiedono l'analialing8. Si ipotizza quindi che la formazione prematura dei pori sia un effetto combinato della presenza di etanolo durante la preparazione e della mancanza di colesterolo nel bistrato lipidico. Sono stati segnalati difetti strutturali all'interno della membrana bistrato per l'inserimento annealing dei liposomi al di sopra di T m , consentendo alle molecole lipidichediridistribuirsi in modo omogeneo e ai difetti di essere corretti19. Inoltre, il processo di annessione è un processo irreversibile in cui i liposomi annessi che ritornano ad una temperatura inferiore a Tm non ricreano vescicoli che perdono19, in accordo con la LTSL10 annealed.
La natura della preparazione microfluidica del liposoma è un processo di nanoprecipitazione, che richiede due solventi errudibili con solubilità distintiva per i lipidi: tipicamente, etanolo (come solvente per lipidi) e soluzione acquosa (come non solvente lipidico). Così, la presenza di etanolo è inevitabile. Pertanto, formulazioni sensibili o soggette a interdigitalizzazione indotta dall'alcol13, come i liposomi senza colesterolo20, possono richiedere la modifica della formulazione o la ri-ottimizzazione del protocollo. Come dimostrato con la preparazione di LTSL4, è stato ottenuto il gel altamente viscoso, (Figura 7A), che era probabilmente dovuto alla formazione di una fase di gel interdigitato15. D'altra parte, ltSL10, con la sua più alta concentrazione di polimeri che impedisce l'interdigitalizzazione21, è stato preparato con successo. Di conseguenza, deve essere eseguita anche una procedura di rimozione dell'etanolo; qui, è stato rimosso semplicemente per dialisi. Mentre le tecniche di purificazione continua su chip come la filtrazione del flusso tangenziale (in grado di rimuovere sia l'etanolo che lo scambio di buffer) sono state sviluppate22,23, la loro implementazione (come un chip o modulare) sono al di là dell'obiettivo di questo protocollo. Tuttavia, in futuro, prevediamo che questi progetti modulari o standardizzati saranno ottimizzati e aumentati in termini di disponibilità, semplificando il processo di produzione microfluidico.
Un'altra limitazione del protocollo è la perdita di campioni dovuta alla distanza di viaggio dei liquidi, vale a dire il volume iniziale dei rifiuti (passaggio 2.8) e l'ultima frazione di soluzioni che verrebbero iniettate ma non raggiungerebbero lo sbitto. Queste perdite di campione sono quasi inevitabili e possono contribuire a una parte significativa del volume di preparazione a base di banco, soprattutto quando si deve preparare un piccolo volume o campioni preziosi. Se necessario, il recupero dei lipidi potrebbe essere quantificato con un metodo di rilevamento della dispersione della luce a luce liquida-evaporazione ad alte prestazioni che consente una rapida quantificazione delle concentrazioni di lipidi24. Tuttavia, una volta che il processo è ottimizzato e scalato, ad esempio utilizzando una siringa più grande o un serbatoio di liquidi, la velocità effettiva potrebbe essere ulteriormente aumentata e le perdite del campione sarebbero meno significative.
La differenza principale tra questo metodo e il metodo di preparazione esistente è che i liposomi sono auto-assemblati in un ambiente solvente controllabile in modo continuo e ad alta produttività. Il metodo della pellicola lipidica è un processo di produzione batch e richiede l'omogeneizzazione delle dimensioni. Anche se molto fattibile su una prostra, rimane difficile scalare per la produzione clinica. Nell'ambito delle tecniche microfluidiche esistenti, ad esempio la messa a fuoco idrodinamica microfluidica, SHM offre una scala cronologica di miscelazione più breve11 e una maggiore produttività (nell'intervallo di mL/min) con un fattore di diluizione inferiore; nonostante la preparazione di LTSL non sia stata segnalata utilizzando finora altri dispositivi microfluidici. Il vantaggio principale del nostro approccio è la produzione ad alta produttività e scalabile di liposomi termosensibili.
Finora, il nostro protocollo microfluidico offre la produzione continua di LTSL10 con capacità di caricamento dei farmaci. Anche i carichi utili diversi da DOX e ICG sono praticabili. Tuttavia, la rimozione dell'etanolo per dialisi, caricamento remoto di droga e purificazione da parte della colonna SEC rimangono come processi batch e sono i colli di bottiglia del processo di formulazione globale. Lo sviluppo futuro potrebbe concentrarsi sull'utilizzo di approcci microfluidici (come la filtrazione del flusso tangenziale) per migliorare la produttività di questi processi a valle e aumentare la scalabilità del protocollo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) e l'Ingegneria e scienze fisiche research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) per il finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
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