Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنتاج ميكرووبوبي من الليسوبيد اتووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو

Published: March 3, 2020 doi: 10.3791/60907
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Pharmacy, Queen's University Belfast

Summary

يقدم البروتوكول المعلمات المحسنة لإعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة باستخدام جهاز ميكروميكس ميكروميكس الرنجة المتداخل. وهذا يسمح أيضا شارك في تغليف دوكسوروبيسين وindocyanine الخضراء في الليبوزومات والإفراج عن الإفراج عن الدوكسوروبيسين للرقابة / أثار المخدرات.

Abstract

يتيح البروتوكول المقدم إعدادًا مستمرًا عالي الإنتاجية للدهون المنخفضة الحساسية لدرجة الحرارة (LTSLs) ، والقادرة على تحميل أدوية العلاج الكيميائي ، مثل دوكسوروبيسين (DOX). لتحقيق ذلك ، يتم حقن خليط الدهون الايثانولية ومحلول كبريتات الأمونيوم في جهاز ميكرومية عظم الرنجة (SHM) . يتم خلط الحلول بسرعة من قبل SHM ، مما يوفر بيئة مذيبة متجانسة للتجميع الذاتي للدهون. يتم أولاً تسيد الليبوزومات التي تم جمعها، ثم يتم رفعها لإزالة الإيثانول المتبقي. يتم إنشاء تدرج درجة الحموضة كبريتات الأمونيوم من خلال تبادل العازلة من الحل الخارجي باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ثم يتم تحميل DOX عن بعد في الليبوزومات مع كفاءة تغليف عالية (> 80٪). الدهون التي تم الحصول عليها متجانسة في الحجم مع متوسط قطر Z من 100 نانومتر. فهي قادرة على إطلاق انفجار درجة الحرارة الناجمة عن DOX مغلفة في وجود ارتفاع الحرارة المعتدل (42 درجة مئوية). يمكن أيضا ً تحميل الإندوسياين الأخضر (ICG) في الليبوزومات لإطلاق DOX الذي يتم تشغيله بالليزر بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. يضمن نهج microfluidic إعداد LTSLs عالي الإنتاجية والقابل للتكرار وقابلية التوسع.

Introduction

صياغة LTSL هو منتج liposomal ذات الصلة سريريا التي تم تطويرها لتقديم المخدرات العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين (DOX) ويسمح كفاءة انفجار إطلاق المخدرات في ارتفاع الحرارة خفيفة يمكن تحقيقها سريريا (T ☆ 41 درجة مئوية)1. تتكون تركيبة LTSL من 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), الليسوبيد 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidyl (MSPC كولين; M تقف على "أحادية") وPEGylated الدهون 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين-N-[ميثوكسي (البولي إيثيلين جليكول)-2000] (DSPE-PEG2000). عند الوصول إلى درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm - 41 درجة مئوية) ، يسهل الليسوبيد وDSPE-PEG2000 معًا تشكيل مسام الأغشية ، مما يؤدي إلى إطلاق انفجار الدواء2. إعداد LTSLs يستخدم في المقام الأول نهج السائبة من أعلى إلى أسفل، وهي ترطيب فيلم الدهون والبثق. يبقى تحديا لإعداد مجموعات كبيرة من الاستنساخ مع خصائص متطابقة وبكميات كافية للتطبيقات السريرية3.

Microfluidics هو تقنية الناشئة لإعداد الليبوزومات، وتقدم حجم الجسيمات النانوية tunable، والاستنساخ، وقابلية التوسع3. بمجرد تحسين معلمات التصنيع ، يمكن توسيع الإنتاجية عن طريق التوازي ، مع خصائص مطابقة لتلك التي أعدت على مقياس مقاعد البدلاء3،4،5. ميزة رئيسية من microfluidics على تقنيات السائبة التقليدية هو القدرة على التعامل مع أحجام السائل الصغيرة مع التحكم عالية في المكان والزمان من خلال تصغير، مما يسمح الأمثل أسرع، في حين تعمل بطريقة مستمرة وآلية6. إنتاج الليبوزومات مع الأجهزة microfluidic يتحقق من خلال نهج nanoprecipitation من أسفل إلى أعلى، وهو أكثر من الوقت وكفاءة الطاقة لأن عمليات التجانس مثل البثق وسونيكيشن غير ضرورية7. وعادة ما يختلط محلول عضوي (مثل الإيثانول) من الدهون (والحمولة الكارهة للماء) بغير مذيب غير قابل للامتزاج (مثل الماء والحمولة المائية). كما يمزج المذيبات العضوية مع غير المذيبات، يتم تقليل الذوبان للدهون. يصل تركيز الدهون في نهاية المطاف إلى تركيز حرج يتم فيه تشغيل عملية هطول الأمطار7. نانوراسب الدهون تنمو في نهاية المطاف في الحجم وقريبة من liposome. والعوامل الرئيسية التي تحكم حجم وتجانس الليبوزومات هي النسبة بين نسبة معدل التدفق غير المذيب ة والمذيبات (أي نسبة معدل التدفق المائية إلى العضوية؛ ونسبة العضوية ونسبة العضوية. FRR) وتجانس البيئة المذيبات خلال التجميع الذاتي للدهون في الليبوزومات8.

وبالتالي فإن خلط السوائل الفعالة في الموائع الدقيقة أمر ضروري لإعداد الليبوزومات المتجانسة ، وقد تم استخدام تصاميم مختلفة من الخلاطات في تطبيقات مختلفة9. يمثل الخلاط المجهري لعظم الرنجة (SHM) أحد الأجيال الجديدة من الخلاطات السلبية ، والتي تمكن من الإنتاجية العالية (في نطاق mL / min) مع عامل تخفيف منخفض. هذا هو متفوقة على أجهزة خلط الهيدروديناميكية microfluidic التقليدية8،10. وقد نقشSHM الأخاج الرنجة، والتي تخلط بسرعة السوائل عن طريق الإزالة الفوضوية9،11. يسمح مقياس الوقت القصير للخلط SHM (< 5 ms، أقل من مقياس وقت التجميع النموذجي من 10-100 مللي ثانية) بحدوث التجميع الذاتي للدهون في بيئة مذيبة متجانسة، مما ينتج جسيمات نانوية ذات توزيع حجم موحد3،12.

إعداد LTSLs مع microfluidics، ومع ذلك، ليست واضحة بالمقارنة مع تركيبات الدهون التقليدية بسبب عدم وجود الكوليسترول8،والتي بدونها ثنائيات الدهون عرضة للinterdigitation الناجم عن الإيثانول13،14،15. حتى الآن ، لم يكن تأثير الايثانول المتبقي يعرض خلال إنتاج microfluidic من الليبوزومات مفهومة جيدا. غالبية التركيبات المبلغ عنها هي بطبيعتها مقاومة للتوسيط (التي تحتوي على الكوليسترول أو الدهون غير المشبعة)16، والتي على عكس LTSLs على حد سواء المشبعة وخالية من الكوليسترول.

البروتوكول المعروض هنا يستخدم SHM لإعداد LTSLs لدرجة الحرارة التي أدت إلى إطلاق المخدرات التسليم. في الطريقة المعروضة ، تأكدنا من أن LTSLs المعدة microfluidic هي نانو الحجم (100 نانومتر) وموحدة (التشتت < 0.2) عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS). وعلاوة على ذلك، قمنا بتغليف DOX باستخدام طريقة تدرج كبريتات الأمونيوم عبر الغشاء (المعروف ة أيضًا باسم التحميل عن بعد)17 كتحقق من سلامة ثنائي الدهون LTSL. التحميل عن بعد من DOX يتطلب liposome للحفاظ على درجة الحموضة التدرج من أجل تحقيق كفاءة عالية التغليف (EE)، وهو ما من غير المرجح أن يحدث دون طبقة الدهون سليمة. في هذه الطريقة المقدمة ، المميزة من بروتوكولات إعداد الدهون المجهرية النموذجية ، يلزم اتخاذ خطوة الصلب قبل إزالة الإيثانول لتمكين القدرة على التحميل عن بعد ؛ أي لاستعادة سلامة طبقة الدهون.

وكما ذُكر سابقاً، يمكن أيضاً إدخال حمولات هيدروفيلية ومسعورة على الحلول الأولية للتغليف المتزامن للحمولات أثناء تشكيل الـ LTSLs. كدليل على مفهوم, indocyanine الأخضر (ICG), ووافقت ادارة الاغذية والعقاقير بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت, الذي هو أيضا عامل الحرارية الضوئية واعدة, يتم إدخال إلى خليط الدهون الأولية وبنجاح شارك في تحميلها في LTSLs. يتم استخدام ليزر 808 نانومتر لتشعيع الـ LTSLs المحملة بـ DOX /ICG ويحفز بنجاح إطلاق الاندفاع الحراري الضوئي الذي تسبب في إطلاق DOX في غضون 5 دقيقة.

جميع الأدوات والمواد متاحة تجاريا، جاهزة للاستخدام، ودون الحاجة إلى التخصيص. وبما أن جميع البارامترات لصياغة الـ LTSLs قد تم تحسينها، بعد هذا البروتوكول، فإن الباحثين الذين ليس لديهم معرفة مسبقة بالميكروسيوليمكن أيضاً أن يعدوا الـ LTSLs، الذي يعمل كأساس لنظام تسليم الأدوية الحساس للحرارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المعدات

  1. تجميع مضخات الحقنة وSHM على النحو التالي.
    1. توصيل "إلى الكمبيوتر" ميناء مضخة حقنة الثانوية (مضخة 02، للحل مائي) إلى ميناء "إلى الشبكة" من مضخة حقنة رئيسية (مضخة 01، لمحلول الدهون الإيثانول) باستخدام مضخة لضخ كابل الشبكة(الشكل 1،أصفر).
    2. توصيل منفذ "إلى الكمبيوتر" من المضخة الرئيسية إلى منفذ "RS232 المسلسل" من الكمبيوتر باستخدام جهاز الكمبيوتر إلى كابل شبكة مضخة(الشكل 1، الأزرق).
    3. ربط أنابيب إلى كل من مداخل ومنافذ من SHM باستخدام الجوز والفير. تحويل محطة الأنابيب لكلا المداخل إلى الإناث Luer باستخدام آخر الجوز والفير وجمعية الاتحاد. أطول أنابيب من مداخل يسمح أسهل المرفق إلى المحاقن(الشكل 2).
  2. إعداد برنامج التحكم في المضخة.
    1. تعيين عنوان مضخة الحقنة الرئيسية ومضخة الحقنة الثانوية إلى "Ad:01" و "Ad:02"، على التوالي، وذلك باستخدام زر "الإعداد" من مضخة الحقنة. هذا يحتاج فقط إلى القيام به للمرة الأولى.
    2. افتح برنامج التحكم في المضخة على الكمبيوتر. يجب الكشف عن مضختين الحقنة تلقائيًا ، متبوعًا بصوت الصفير. خلاف ذلك، انقر فوق مضخات والبحث عن مضخات لتحديث الاتصال. (الشكل3).
    3. تعيين القطر إلى 12.45 (ملم) عن طريق اختيار "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia = 12.45)".
    4. تعيين معدل إلى 0.25 مل / دقيقة لمضخة 01 (محلول الدهون الإيثانول) و 0.75 مل / دقيقة للمضخة 02 (محلول مائي). وتقابل معدلات التدفق معدل تدفق إجمالي قدره 1 مل/دقيقة ونسبة معدل تدفق مائي إلى إيثانول (FRR) قدرها 3.
    5. تعيين وحدة التخزين إلى أي قيم أعلى من 5 مل.
      ملاحظة: يتم تعيين حجم التسريب المستهدف أكبر من حجم السائل المحملة بالنظر إلى حجم الفراغ من الأنابيب.
    6. حدد وضع INF (التسريب) لكلا المضختين.
    7. اضغط على تعيين لتأكيد الإعدادات.

2. إعداد LTSLs

  1. إعداد خليط الدهون LTSL10 أو LTSL10-ICG (انظر الجدول 1).
  2. اسحب 1 مل من خليط الدهون وما لا يقل عن 3 مل من (NH4)2SO4 حل باستخدام اثنين من 5 مل محاقن قفل Luer.
  3. تثبيت اثنين من المحاقن على مضخات حقنة في وضع تستقيم عن طريق انزلاق شفة برميل من الحقنة إلى التجنيب حقنة من المضخة، وشفة المكبس من الحقنة إلى كتلة دافع من المضخة(الشكل 4).
  4. التفاف نهاية شريط التدفئة إلى الحقنة مع الحل مائي. التفاف الطرف الآخر من شريط التدفئة ودرجة الحرارة التحقيق من الحرارة حول الحقنة مع محلول الدهون. من المفيد ممارسة هذه الخطوة باستخدام المحاقن الفارغة في مكانها من أجل تسهيل عملية التجميع(الشكل 5A).
  5. ربط اثنين من المحاقن إلى محولات Luer الإناث من مداخل المقابلة من SHM. تأكد من أن المحاقن التي تحتوي على خليط الدهون و (NH4)2SO4 يتم توصيل محاليل الإيثانول والمياه، على التوالي. ضبط موقف المكبس لإزالة فقاعات الهواء من المحاقن(الشكل 5B).
    ملاحظة: تأكد من أن المحاقن لا تزال في وضع آمن على مُلتك المحاقن للمضخات.
  6. تسخين المحاقن إلى ما فوق 51 درجة مئوية باستخدام شريط التدفئة باستخدام جلسة التدفئة 10 s. السماح للحرارة لتحديث درجة حرارة المحاقن. كرر هذه الخطوة في الخطوات التالية للحفاظ على درجة الحرارة أثناء التسريب.
    تنبيه: قم بإيقاف تشغيل شريط التدفئة بعد 10 s لمنع تجاوز درجة الحرارة والسماح للحرارة بتحديث درجة الحرارة الفعلية. وينبغي أيضا أن يتم التعامل مع شريط التدفئة بعناية كما ترتفع درجة حرارته بسرعة كبيرة. التدفئة باستمرار قد تلف المعدات والمحاقن، وذلك بسبب التأخير الزمني للحرارة لتحديث درجة الحرارة المقاسة.
  7. مرة واحدة في درجة الحرارة فوق 51 درجة مئوية، تشغيل مضخات حقنة عن طريق الضغط على تشغيل الكل في برنامج التحكم في مضخة(الشكل 3).
  8. تأكد من تدفق السوائل خالية من فقاعات الهواء وأي تسرب. تخلص من الحجم الأولي (حوالي 0.5 مل) من السائل من المنفذ كنفايات.
    ملاحظة: حجم النفايات الأولي هذا غير محدد ويعتمد على الحجم الداخلي للإعداد، وهو حجم السوائل للسفر من المحاقن عبر الأنابيب وSHM إلى المنفذ.
  9. جمع بقية السائل كعينات الدهنية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق أو قارورة بيجو.
  10. وقفة / وقف التسريب عندما السائل في أي من المحاقن فارغة تقريبا.
    ملاحظة: يجب إيقاف المضخات يدويًا، نظرًا لأن المضخات قد لا تكتشف الموضع بدقة عندما تكون المحاقن فارغة.
  11. ضع الحلول الدهنية التي تم جمعها في حمام مائي 60 درجة مئوية إلى الصلب لمدة 1.5 ساعة.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية في تمكين تحميل المخدرات في الليبوزومات.
  12. نقل الحلول لأنابيب غسيل الكلى. دييز الحلول ضد 1 لتر من 240 mM (NH4)2SO4 في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل للحصول على الليبوزومات المنقى.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. الدهون في هذه الخطوة هي في 5 ممل من الفوسفوليبيد. يمكن تخزين الليبوزومات المنقاة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  13. لتنظيف SHM للاستخدام المتكرر، مسح SHM بالتتابع مع الماء المؤين، والإيثانول والجافة مع غاز النيتروجين.

3. تحميل عن بعد من DOX في LTSLs عن طريق تدرج درجة الحموضة عبر الغشاء

  1. تبادل المخزن المؤقت الخارجي من LTSLs إلى خط السالين المؤقت HEPES (HBS) باستخدام اللونية استبعاد الحجم (SEC) لإنشاء تدرج درجة الحموضة عبر الغشاء.
    1. إضافة ما مجموعه 25 مل من HBS إلى أعلى عمود SEC لإعداد العمود. السماح لجميع eluent إلى elute من خلال العمود والتخلص من eluate.
    2. إضافة 1 مل من الليبوزومات dialyzed، أعدت من الخطوة 2.12، إلى العمود والتخلص من elute.
    3. إضافة 1.5 مل من HBS إلى العمود والتخلص من elute.
    4. إضافة 3 مل من HBS إلى العمود وجمع 3 مل من elute.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يتم جمع الليبوزومات في هذه الخطوة وهي في 1.67 مم من الفوسفوليبيد. يمكن تخزين الليبوزومات العازلة المتبادلة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. احتضان LTSLs مع دوكسوروبيسين (DOX) وتنقية LTSLs.
    1. إضافة محلول DOX في نسبة الأضراس من 1:20 DOX إلى الفوسفوليبيد إلى 1 مل من محلول الليبوزومات المخزنية المتبادلة (1.67 ملليمول) الموجودة في قارورة بيجو. ويمكن تحقيق ذلك بإضافة 48.4 ميكرولتر من محلول DOX 1 ملغم/مل (83.4 ميكرومول).
    2. ضع قارورة بيجو في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للسماح بتحميل DOX في الليبوزومات.
    3. مزيج 10 ميكرولتر من الليبوزومات مع 170 ميكرولتر من HBS و 20 ميكرولتر من 1٪ (v/v) ترايتون X-100 الحل في لوحة سوداء 96-جيدا. كرر لثلاثة آبار. هذه الآبار تتوافق مع "قبل تنقية" DOX المحتوى.
    4. في حالة إعداد LTSL10-ICG، اخلط 40 ميكرولتر من الليبوزومات مع 160 ميكرولتر من DMSO في لوحة واضحة 96-well. كرر لثلاثة آبار. وتتوافق هذه الآبار مع محتوى اللجنة الدولية لـ "قبل التنقية".
    5. تنقية محلول الدهنية كما هو موضح في الخطوة 3.1.
      ملاحظة: لإعادة استخدام العمود لتنقية المستقبل، قم بتنظيف العمود من DOX المجانية عن طريق إضافة 1 مل من محلول 0.5 M NaOH المخفف قبل تنفيذ الخطوة 3.1.1. سوف DOX الحرة باللون الأحمر بدوره البنفسجي الأزرق وelute من خلال العمود بسرعة.
    6. مزيج 30 ميكرولتر من محلول الليبوزومات المنقى مع 150 ميكرولتر من HBS و 20 ميكرولتر من 1٪ (v/v) ترايتون X-100 الحل في لوحة سوداء 96-جيدا. كرر لثلاثة آبار. هذه الآبار تتوافق مع "بعد تنقية" DOX المحتوى.
    7. في حالة LTSL10-ICG، اخلط 40 ميكرولتر من محلول الليبوزومات المنقى مع 160 ميكرولتر من DMSO في لوحة واضحة 96-well. كرر لثلاثة آبار. وتتوافق هذه الآبار مع محتوى اللجنة الدولية لـ "بعد التنقية".
    8. قياس كثافة الفلورسة DOX من الآبار قبل (الخطوة 3.2.3) وبعد (الخطوة 3.2.5) تنقية، وذلك باستخدام قارئ microplate(ο ex = 485 نانومتر،em = 590 نانومتر).
    9. حساب كفاءة تغليف DOX (DOX EE) عن طريق أخذ نسبة كثافة الفلورسينس قبل وبعد التنقية.
      Equation 1
    10. قياس امتصاص ICG من الآبار قبل وبعد تنقية، وذلك باستخدام قارئ microplate (600 إلى 1000 نانومتر).
    11. احسب كفاءة التغليف لـ ICG (ICG EE) من خلال أخذ نسبة الامتصاص عند 792 نانومتر قبل وبعد التنقية ، مع الأخذ في الاعتبار عامل التخفيف (3 مرات) أثناء التنقية.
      Equation 2

4. تشتت الضوء الديناميكي (DLS)

  1. أضف 50 ميكرولتر من محلول الليبوزومات (الخطوة 2.12) إلى 450 ميكرولتر من الماء المنزوع الأيونات.
  2. ضع الكوفيت داخل أداة DLS وانفذ القياس وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. تسجيل متوسط متوسط قطر وتشتت ثلاثة قياسات لكل عينة.

5- قياس السعرات الحرارية للمسح التفاضلي

  1. تركيز 1 مل من عينات الليبوزومات (الخطوة 2.12) مع وحدة تصفية الطرد المركزي إلى 0.5 مل (تركيز الدهون النهائي من 10 م. م. ). باستخدام دوار ثابت الزاوية، تدور في 7500 × ز لمدة 15 دقيقة تقريبا.
  2. نقل 20 ميكرولتر من (NH4)2SO4 الحل وعينات الليبوزومات إلى اثنين من المقالي DSC المعنية. ختم المقالي مع أغطية DSC المطبعية باستخدام طقم الصحافة عينة DSC.
  3. قياس العينة من 30 درجة مئوية إلى 60 درجة مئوية بمعدل تدفئة 1 درجة مئوية / دقيقة باستخدام مقياس السعرات الحرارية المسح يتفاضلي.
  4. تحليل البيانات باستخدام البرامج المناسبة. خذ درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm)كبداية لانتقال المرحلة (ذروة الذوبان) ، والتي تقاس باعتراض x لظل نقطة المنحدر الأقصى.

6. دوكسوروبيسين الافراج

  1. سخني HBS في درجة حرارة محددة (37 أو 42 درجة مئوية) باستخدام حمام مائي. إعداد حمام ماء جليدي لإخماد العينات.
  2. أضف 100 ميكرولتر من الليبوزومات المنقاة المحملة من DOX (الخطوة 3.2.5) إلى 1.9 مل من HBS في أنبوب طرد مركزي صغير. ضع الأنبوب في حمام الماء في درجة الحرارة المعينة.
  3. سحب فورا 200 ميكرولتر من العينات من الأنبوب وبسرعة وضعه في حمام الماء المثلج لاخماد أي إطلاق المخدرات اللاحقة. تتوافق هذه العينة مع نقطة الوقت الأولية (t = 0).
  4. سحب 200 ميكرولتر من العينات في نقاط زمنية لاحقة (t = 5، 10، 15، 30، 60 دقيقة) وبسرعة وضعه في حمام الماء الجليدي لإخماد أي إطلاق المخدرات.
  5. مزيج 50 ميكرولتر من عينة من كل نقطة زمنية مع 150 ميكرولتر من HBS في لوحة سوداء 96-جيدا. قياس كثافة الفلورسة DOX باستخدام قارئ لوحة.
  6. أضف 20 ميكرولتر من 1% (v/v) تريتون X-100 إلى آبار عشوائية مختارة أعدت في الخطوة 6.5. قياس كثافة الفلورسة DOX من هذه الآبار باستخدام قارئ لوحة. تتوافق هذه القيم مع النقطة الزمنية التي تم إصدارها بالكامل (t = ☆; 100% الإصدار).
  7. حساب ورسم النسبة المئوية لـ DOX التي تم إصدارها عن طريق استيفاء كثافة الفلورية لكل نقطة زمنية (I (t))، مقارنة بالقيمة الأولية (I (0))، والقيمة التي تم إصدارها بالكامل (I().).
    Equation 3

7. تسخين الليزر والإفراج أثار

  1. ضبط درجة حرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية والسماح لدرجة الحرارة لتحقيق الاستقرار.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من DOX تحميل LTSL10-ICG ([ICG] = 10 ميكروغرام / مل) إلى لوحة واضحة 96 جيدا، ثم وضعه في حمام الماء، والحفاظ على الجزء السفلي مغمورة في الماء.
  3. تعيين تيار نظام الليزر إلى 2.27 A. ضع الكوليماتور لنظام الليزر في 5 سم عموديا فوق سطح لوحة 96-well، والذي يتوافق مع تدفق الطاقة من 0.5 W/cm2 [الشكل 6].
    تنبيه: يجب تشغيل نظام الليزر وفقًا لتدابير السلامة ذات الصلة بالليزر.
  4. قم بتشغيل الليزر وراقب درجة الحرارة كل دقيقة باستخدام مسبار درجة حرارة الألياف البصرية.
  5. في 5 و 10 دقيقة، اسحب 10 ميكرولتر من الليبوزومات المشععة بالليزر من لوحة 96-well واضحة في وتخلط مع 190 ميكرولتر من HBS لثلاث آبار في لوحة سوداء 96-well.
  6. مزيج 10 ميكرولتر من الليبوزومات مع 170 ميكرولتر من HBS و 20 ميكرولتر من 1٪ (v/v) ترايتون X-100 حل لثلاثة آبار في لوحة سوداء 96-جيدا. هذه الآبار تتوافق مع "100٪ صدر" DOX المحتوى. قياس كثافة الفلورسنت DOX وحساب الإفراج DOX كما هو موضح في الخطوة 6.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد LTSLs بواسطة microfluidics يتطلب تكوين الدهون من DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, نسبة الأضراس; LTSL10). يوضح الشكل 7A (يسار) مظهر LTSL10 الجاهز من الخطوة 2.9، كسائل واضح وغير لزج. تم تطوير صياغة LTSL10 من الصياغة التقليدية ، LTSL4 (DPPC / MSPC / DSPE - PEG2000، 86/10/4 ، نسبة الأضراس) منذ LTSL4 يشكل عينة لزجة تشبه هلام ، كما هو مبين من قبل كمية كبيرة من فقاعات الهواء المحاصرين في العينة(الشكل 7ألف؛ الحق).

أظهر قياس DLS لـ LTSL10(الشكل 7B، الأحمر) أن قطر وتشتت Z-Average لـ LTSL10 كان 95.28 ± 7.32 نانومتر و0.100 ± 0.022 ، على التوالي ، مما يشير إلى نجاح التجربة. ويبين الشكل 7باء (رمادي) أيضاً عينة دون المستوى الأمثل، أعدت عند درجة حرارة 20 درجة مئوية، حيث تم الحصول على دهون أكبر وأكثر تشتتاً.

ويبين الشكل 7C أن DOX EE من LTSL10. يجب أن يكون DOX EE عادة حوالي 80٪. يتم تضمين LTSLs التي أعدتها الطريقة التقليدية لترطيب فيلم الدهون مع البثق (LF) للمقارنة ، كما أعدت على النحو المبين في مكان آخر18. DOX EE من LTSL4 (LF) وLTSL10 (LF) وأظهرت تحميل DOX لائق من حوالي 70٪ و 50٪، على التوالي. الصلب من LTSL10 كما هو معد (الخطوة 2.11) أمر ضروري لتمكين تحميل DOX. في غياب خطوة الصلب ، منخفضة DOX EE (< 20 ٪) ، وانخفاض كان ثابتا، بغض النظر عن درجة حرارة الحضانة (20 درجة مئوية إلى 42 درجة مئوية) والمدة (1 إلى 24 ساعة). هذا يشير إلى فشل LTSL10 للحفاظ على تدرج درجة الحموضة عبر الغشاء ، حيث تم تحميل DOX بدلا ً من ذلك بشكل سلبي أو عن طريق الامتزاز. من خلال تحديد LTSL10 كما هو معد، DOX EE زيادة كبيرة إلى متوسط 85٪، مما يشير إلى نجاح التحميل عن بعد من DOX ووجود تدرج درجة الحموضة عبر الغشاء.

يوضح الشكل 7D ملف تعريف إصدار DOX لـ LTSL10. في 37 درجة مئوية، وكان الافراج عن DOX مغلفة أكثر من 60 دقيقة حوالي 10٪. في المقابل، عند 42 درجة مئوية، تم إطلاق جميع DOX المغلفة في غضون 5 دقائق، مما يدل على حساسية درجة الحرارة من LTSL10. ولوحظت نتائج مماثلة مع LTSL10 (LF) كتحكم.

ويبين الشكل 8 درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm)من LTSL10 التي تتميز باستخدام قياس السعرات الحرارية المسحي التفاضلي (DSC). تتم إضافة الخطوط المنقطة كمماس من نقطة المنحدر الأقصى ، كمساعدة بصرية لدرجة حرارة مرحلة الانتقال للبدء (تقاطع x للخط المماس). LTSL10 لديه مرحلة انتقالية واسعة نسبيا مع بداية في 41.6 درجة مئوية والذروة في 42.6 درجة مئوية. ولوحظت نتائج مماثلة مع LTSL10 (LF)، مما يشير إلى وجود فرق طفيف بين تقنيات التحضير. على سبيل المقارنة، LTSL4 (LF) لديه مرحلة انتقالية أقل وأكثر وضوحا، في الاتفاق مع الأدب1.

ويبين الشكل 9 توصيف LTSL10-ICG. يتم تصنيف تأثير تركيز ICG الأولي على الحجم(الشكل 9A)وكفاءة التحميل من DOX و ICG(الشكل 9B)إلى ثلاثة نطاقات تركيز. وعند انخفاض تركيز ICG (نسبة الأضراس من ICG إلى الدهون 0.003؛ وكان التركيز الأولي 60 ميكرومتر ICG و20 مم من الدهون)، Z-average، والتشتت وDOX EE مماثلة LTSL10 دون تحميل ICG؛ وكان ICG EE حوالي 75٪. ويمكن تحقيق كفاءة التحميل المشترك لDOX وICG في LTSL10 في هذا التركيز ICG. وبتركيزات ICG الوسيطة، بينما كان حجم العينات وتشتتها مرضيين، تم تخفيض كل من DOX وICG EE. وعلى وجه الخصوص، أشار الانخفاض في DOX EE إلى تعطل الغشاء الدهني وبالتالي، تدرج درجة الحموضة. وبتركيزات عالية من المواد الموجهة إلى اللجنة الدولية، تم ّ تَلَقُّر العينات مرة أخرى؛ وقد انخفض كل من DOX وICG EE بشكل كبير.

تم تشعيع LTSL10-ICG بالليزر بالأشعة تحت الحمراء القريبة (القسم 7) للحث على التدفئة الحرارية الضوئية وأثار إطلاق DOX(الشكل 10). عند تشعيع الليزر ، سخنت العينة لأول مرة حتى 49.7 درجة مئوية مع انخفاض تدريجي في درجة الحرارة. التشعيع الليزر اللاحقة زيادة درجة الحرارة إلى 36.7 درجة مئوية. وأشار القياس الكمي لـ DOX المفرج عنه إلى أنه تم الإفراج عن اندفاع كامل من DOX المغلفة بعد دورة التدفئة الأولى. وكان هذا كما هو متوقع منذ درجة الحرارة التي تم التوصل إليها فوق 42 درجة مئوية، بالاتفاق مع ملف تعريف الإصدار DOX هو مبين في الشكل 7D. وعلى النقيض من ذلك، لا يمكن لـ LTSL10 بدون ICG توفير التدفئة الحرارية الضوئية، وبالتالي لم يتم إطلاق DOX عند تشعيع الليزر.

Figure 1
الشكل 1: صورة لإعداد مضخات الحقنة. يتم إرفاق منفذ "إلى الشبكة" من المضخة الرئيسية (مضخة 01) إلى "إلى الكمبيوتر" من المضخة الثانوية (مضخة 02؛ أصفر)؛ يتم إرفاق منفذ "إلى الكمبيوتر" من المضخة الرئيسية إلى منفذ RS-232 للكمبيوتر (أزرق). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صورة لإعداد SHM. (أ)طريقة عرض مجمعة لإعداد SHM. (ب)عرض انفجرت من الإعداد SHM. يتم توصيل مداخل ومنافذ SHM إلى الأنابيب باستخدام الجوز والفير. يتم تمديد أنابيب كل من المداخل من قبل أنابيب أطول مع الجوز والفدر على كل نهاية، وإنهاء بواسطة محول Luer الإناث باستخدام جمعية الاتحاد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: واجهة برنامج التحكم في المضخة. وينبغي الكشف عن مضختين الحقنة تلقائيا عند بدء تشغيل البرنامج؛ خلاف ذلك، انقر فوق مضخات على الزاوية اليسرى العليا والبحث عن مضخات. يتم تمييز المعلمات المراد تكوينها في مربعات حمراء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صورة لمضخات الحقنة وتركيب حقنة. (أ)حقنة التجنيب قوس وحقنة التجنيب الإبهام (2، واحد على كل جانب) من مضخة حقنة (مربع أصفر). كتلة القفل، وطاقم الإبهام التعديل، وزر الجوز (زر أبيض على اليسار) من مضخة الحقنة (مربع أخضر). (ب)موقف حقنة مثبتة على مضخة الحقنة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صورة لتجميع المحاقن، عنصر التدفئة وSHM. (أ)تجميع المحاقن، شريط التدفئة، والحرارة. (ب)تجميع المحاقن، شريط التدفئة، الحرارة، وSHM. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: صورة لإعداد الليزر. (أ)صورة فوتوغرافية لنظام الليزر الألياف مقرونة أثناء التشغيل. (ب)موقف من الكوليماتور 5 سم فوق لوحة 96-جيدا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: توصيف LTSL10. (أ)صورة فوتوغرافية لـ LTSL10 و (يمين) LTSL4، قبل غسيل الكلى. LTSL10 كما ظهرت واضحة وغير لزجة السائل، في حين كان LTSL4 هلام مثل واللزجة. (B)متوسط قطر وتشتت 10 مM من LTSL10 أعدت في 20 و 51 درجة مئوية. تشير القضبان الصلبة والدوائر المفتوحة (○) إلى متوسط قطر وتشتت Z، على التوالي. (C)DOX EE من LTSL4 (LF; أبيض), LTSL10 (LF; أبيض), و LTSL10 قبل (رمادي) وبعد الصلب (أحمر). (D)DOX الإفراج عن LTSL10 (دائرة) وLTSL10 (LF؛ عبر) في 37 درجة مئوية (أسود) و 42 درجة مئوية (أحمر). تمثل البيانات متوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. p < 0.001; اثنين من الذيل غير مقترنة تي الاختبارات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الخصائص الحرارية لـ LTSL10. الحرارة من LTSL4 (LF)، LTSL10 (LF)، وLTSL10 تتميز DSC. تتم إضافة الخطوط المنقطة كمساعدة بصرية لدرجة حرارة مرحلة الانتقال للمرحلة الأولى. وتمثل البيانات متوسط ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: توصيف LTSL10-ICG. (A)متوسط قطر Z (أحمر) وتشتت (أزرق) من LTSL10 تحميل ICG. (ب)DOX EE (أحمر) وICG EE (أخضر) من LTSL10 تحميل ICG. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: أدت التدفئة الحرارية الضوئية الناجمة عن الليزر إلى إطلاق DOX-تحميل LTSL10 وLTSL10-ICG. (أ)درجة حرارة العينات المشععة و (B) إطلاق DOX من LTSL10 (الأزرق) وLTSL10-ICG (أحمر) أثناء التسخين الحراري الضوئي الناجم عن الليزر. تمثل البيانات متوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: خلائط الدهون والمخازن المؤقتة وحلول المخزون.

20 mM LTSL10 خليط الدهون
(DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000؛ 80/10/10، نسبة الأضراس)		 ل1 مل من 20 مل LTSL10 خليط الدهون:
إذابة 11.75 ملغ من DPPC مع 210 ميكرولتر من مخزون الإيثانول MSPC (5 ملغ/مل)، و558 ميكرولتر DSPE-PEG2000 مخزون الإيثانول (10 ملغ/مل)، و232 ميكرولتر من الإيثانول.
بدلا من ذلك، يمكن إضافة كمية مكافئة من MSPC (1.05 ملغ) وDSPE-PEG2000 (5.58 ملغ) كمسحوق.
20 mM LTSL10-ICG خليط الدهون
(DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000؛ 80/10/10، نسبة الأضراس؛
ICG إلى نسبة المولي للدهون = 0.003)		 ل1 مل من 20 mM ICG محملة LTSL10 خليط الدهون:
إذابة 11.75 ملغ من DPPC مع 210 ميكرولتر من مخزون الإيثانول MSPC (5 ملغ/مل)، و558 ميكرولتر DSPE-PEG2000 مخزون الإيثانول (10 ملغم/مل)، و46.5 ميكرولتر من مخزون الإيثانول ICG (1 ملغ/مل) و 185.5 ميكرولتر من الإيثانول.
بدلا من ذلك، يمكن إضافة كمية مكافئة من MSPC (1.05 ملغ) وDSPE-PEG2000 (5.58 ملغ) كمسحوق.
يحتوي على 60 ميكرومتر من ICG و 20 مم من الدهون.
240 mM محلول كبريتات الأمونيوم (NH4)2SO4، درجة الحموضة 5.4 حل 31.71 غرام من (NH4)2SO4 لكل لتر من الماء المنزوع الأيونات.
درجة الحموضة للمحلول هو أصلا 5.4، لا يلزم تعديل درجة الحموضة إضافية.
محلول دوكسوروبيسين (DOX)، 1 ملغ/مل حل 1 ملغ من DOX لكل مل من الماء المغون.
DSPE-PEG2000 مخزون الإيثانول، 10 ملغ /مل حل 10 ملغ من DSPE-PEG2000 لكل مل من الإيثانول.
خط السالة العازلة HEPES (HBS)، درجة الحموضة 7.4 حل 8.0 غرام من NaCl و 4.766 غرام من HEPES لكل لتر من الماء الديمؤين.
ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 2.5 M NaOH الحل.
مخزون الإيثانول ICG، 1 ملغ/مل حل 1 ملغ من ICG لكل مل من الإيثانول.
مخزون الإيثانول MSPC، 5 ملغ/مل حل 5 ملغ من DPPC لكل مل من الإيثانول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف البروتوكول المقدم إعداد الليبوزومات ذات الحساسية المنخفضة لدرجة الحرارة (LTSLs) باستخدام خلاط مجهري عظم الرنجة (SHM). صيغة LTSL10 تمكن من درجة الحرارة التي تسببها إطلاق انفجار من doxorubicin في غضون 5 دقائق في درجة حرارة hyperthermic يمكن تحقيقها سريريا من 42 درجة مئوية. Indocyanine الأخضر (ICG) يمكن أيضا أن تكون المشاركة في تحميل للتدفئة الحرارية الضوئية أثار الإفراج عن DOX. وتعتمد الطريقة على: '1' التجميع الذاتي للفوسفوليبيدات في الليبوزومات في إطار بيئة مذيبة متجانسة يوفرها الخلط السريع والفوضوي لمحلول الإيثانول وكبريتات الأمونيوم في SHM11؛ '2' تأكسد الليبوزومات للحفاظ على سلامة طبقة الدهون المزدوجة الضرورية لتحميل الدوإكس؛ و (3) التحميل عن بعد من DOX في LTSLs بواسطة درجة الحموضة كبريتات الأمونيوم17. وبما أن المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول متاحة تجارياً وجاهزة للاستخدام، وأن المعلمات هي الأمثل، فإن هذا النهج يمكن التحكم فيه للمستخدمين دون معرفة مسبقة أو خبرة ميكروفلويديك.

واحدة من الخطوات الأكثر أهمية داخل البروتوكول هو ضمان أن يتم تأمين التجميع بأكمله بشكل صحيح ويمكن غرس السوائل بشكل صحيح (الخطوة 2.5). نظرًا لأن قابلية إعادة إنتاج التركيب الذاتي للدهون تعتمد على بيئة مذيبة متجانسة ، فإن أي عدم استقرار ، مثل إزاحة المحاقن أو إدخال فقاعات الهواء ، سيزعج استقرار تدفق السوائل ويؤدي إلى دون المستوى الأمثل الدهون الحجم والتشتت. وهذا هو أيضا الأساس المنطقي للخطوة 2-8، حيث ينبغي التخلص من الحجم، الذي يتألف من السائل الذي يشغل القناة في البداية وقبل الوصول إلى تدفق مستقر.

الخطوة الحاسمة الثانية لتجربة ناجحة هي خطوة الصلب ، لتمكين DOX EE عالية (الخطوة 2.11). في الليبوزومات الخالية من الكوليسترول ، سوف تتراكم مكونات الغشاء المكونة لمايكل (أي MSPC و DSPE-PEG2000)عند حدود الحبوب مع درجة عالية من العيوب لاستيعاب انحناء غشاء عالي2. هذه الترتيبات الحرارية تفضل تشكيل واستقرار المسام الغشاء، والليبوزومات فتح، أو أقراص ثنائية الطبقة. واقترح انخفاض DOX EE LTSL10 دون الصلب أن الهياكل المسامية موجودة حتى تحتT M، مما أدى إلى عدم وجود تدرج درجة الحموضة المطلوبلتحميل DOX(الشكل 7C). لم يلاحظ تشكيل مسام تحتT m لLTSLs التي أعدها فيلم الدهون (LTSL4 (LF) وLTSL10 (LF)) ، حيث لا يلزم الصلب. وعلاوة على ذلك، تركيبات تحتوي على الكوليسترول التي أعدتها microfluidics أيضا لا تتطلب الصلب8. ولذلك ، فإنه من المتوقع أن تشكيل السابق لأوانه من المسام هو تأثير مشترك من وجود الإيثانول أثناء إعداد وعدم وجود الكوليسترول في طبقة الدهون. وقد أفيد العيوب الهيكلية داخل غشاء ثنائي الطبقات أن يتم القضاء عليها عن طريق الصلب الدهنية فوقT م،مما يسمح جزيئات الدهون لإعادة توزيع متجانسة والعيوب التي يتعين تصحيحها19. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية الصلب هو عملية لا رجعة فيها حيث الدهون الصلب العودة إلى درجة حرارة أقل من Tم لا إعادة الحويصلات تسرب19، بالاتفاق مع LTSL10 الصلب.

طبيعة إعداد microfluidic من liposome هي عملية الهطول النانوي ، والتي تتطلب اثنين من المذيبات القابلة للامتزاج مع ذوبان مميزة للدهون: عادة ، الإيثانول (كمذيب الدهون) ومحلول مائي (كدهون غير مذيب). وبالتالي ، فإن وجود الإيثانول أمر لا مفر منه. لذلك ، قد تتطلب التركيبات الحساسة أو المعرضة للتداخل الناجم عن الكحول13، مثل الليبوزومات الخالية من الكوليسترول20، تعديل ًا في صياغة البروتوكول أو إعادة التحسين. كما هو موضح مع إعداد LTSL4 ، تم الحصول على الجل اللزج للغاية ،(الشكل 7A)، والذي كان من المرجح بسبب تشكيل مرحلة هلام متشابكة15. من ناحية أخرى ، LTSL10 ، مع تركيز البوليمر العالي الذي يمنع التفاعلالبيني 21، تم إعداده بنجاح. وبالتالي، يجب أيضا إجراء إزالة الإيثانول؛ هنا، تمت إزالته ببساطة عن طريق غسيل الكلى. في حين أن تقنيات التنقية المستمرة على رقاقة مثل الترشيح تدفق عرضية (قادرة على إزالة الإيثانول وتبادل العازلة) وقد وضعت22،23، وتنفيذها (كما رقاقة واحدة أو وحدات) هي أبعد من الهدف من هذا البروتوكول. ومع ذلك، نتوقع في المستقبل أن يتم تحسين هذه التصاميم المعيارية أو الموحدة وزيادة توافرها، مما يبسط عملية إنتاج الميكروسيوليك.

وثمة قيد آخر للبروتوكول هو فقدان العينة بسبب مسافة السفر للسوائل، أي حجم النفايات الأولية (الخطوة 2-8) وكذلك الجزء الأخير من الحلول التي سيتم حقنها ولكنها لن تصل إلى المأخذ. وهذه العينات لا يمكن تجنبها تقريباً وقد تسهم في جزء كبير من حجم الإعداد في الإنتاج على نطاق مقاعد البدلاء، لا سيما عندما يتعين إعداد كمية صغيرة أو عينات ثمينة. عند الضرورة ، يمكن قياس استرداد الدهون من خلال طريقة كاشف تشتت الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء والتبخر التي تمكن من التحديد الكمي السريع لتركيزات الدهون24. ومع ذلك، بمجرد تحسين العملية وتوسيع نطاقها، مثل استخدام محقنة أكبر أو خزان سائل، يمكن زيادة الإنتاجية وستكون خسائر العينة أقل أهمية.

الفرق الرئيسي بين هذه الطريقة وطريقة التحضير الحالية هو أن الليبوزومات يتم تجميعها ذاتيًا في بيئة مذيبة يمكن التحكم فيها بطريقة عالية الإنتاجية ومستمرة. طريقة فيلم الدهون هي عملية تصنيع دفعة ويتطلب التجانس الحجم. في حين أن من الممكن جدا على نطاق مقاعد البدلاء، فإنه لا يزال من الصعب لتوسيع نطاق للإنتاج السريري. ضمن التقنيات الدقيقة السوائل القائمة، على سبيل المثال، التركيز الهيدروديناميكي الميكروسيولي، SHM يقدم أقصر مقياس زمني خلط11 وإنتاجية أكبر (في نطاق مل / دقيقة) مع انخفاض عامل التخفيف؛ على الرغم من إعداد LTSLs لم يتم الإبلاغ عن استخدام أجهزة microfluidic أخرى حتى الآن. الميزة الرئيسية لنهجنا هو إنتاج عالية الإنتاجية والقابلة للتطوير من الليبوزومات الحساسة للحرارة.

حتى الآن، لدينا بروتوكول microfluidic يقدم الإنتاج المستمر من LTSL10 مع القدرة على تحميل المخدرات. كما أن الحمولات الأخرى غير DOX وICG قابلة للتطبيق. ومع ذلك ، فإن إزالة الإيثانول عن طريق غسيل الكلى ، وتحميل المخدرات عن بعد ، والتنقية من قبل عمود SEC لا تزال عمليات دفعة وهي اختناقات عملية الصياغة الشاملة. ويمكن أن تركز التنمية في المستقبل على استخدام النهج الموائعالمجهرية (مثل ترشيح التدفق العرضي) لتعزيز إنتاجية هذه العمليات النهائية وزيادة قابلية البروتوكول للتوسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر سرطان البروستاتا في المملكة المتحدة (CDF-12-002 Fellowship) ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية (EP/M008657/1) على التمويل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Lipoid PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) Lipoid PE 18:0/18:0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) Avanti Polar Lipid 855775P-500MG Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC
(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375-100G
Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-624 Requires 2 units. For the inlets
Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-630 Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)
Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich 31119-1KG-M
Bijou vial VWR 216-0980 7 mL, clear, polystyrene vial
Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801008 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit
Centrifuge ThermoFisher Scientific Heraeus Megafuge 8R With HIGHConic III Fixed Angle Rotor
Cuvette Fisher Scientific 11602609 Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement
Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi Sigma-Aldrich PURX12015-1KT 12-14 kDa MWCO
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34943-1L-M
DLS Instrument Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS90
Doxorubicin Hydrochloride (DOX) Apollo Scientific BID0120
DSC Instrument TA Instruments TA Q200 DSC
DSC Tzero Hermetic Lids TA Instruments 901684.901 For DSC measurement
DSC Tzero Pans TA Instruments 901683.901 For DSC measurement
DSC Tzero Sample Press Kit TA Instruments 901600.901 For DSC measurement
Ethanol VWR 20821.330 Absolute, ≥99.8%
FC-808 Fibre Coupled Laser System CNI Optoelectronics Tech FC-808-8W-181315 FOC-01-B Fiber Collimator included.
Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-200 For the outlet
Fibre Optic Temperature Probe Osensa PRB-G40
Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) Darwin Microfluidics Herringbone Mixer - Glass Chip
Heating Tape Omega DHT052020LD Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models
Indocyanine Green Adooq A10473-100 Distributed by Bioquote Limited (U.K.)
Luer-lock Syringe, 5 mL VWR 613-2043 Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm
Microplate Reader BMG Labtech FLUOstar Omega Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters
Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom ThermoFisher Scientific 611F96BK For fluorescence measurement in microplate reader
Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom Grenier 655101 For absorbance measurement microplate reader
Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-245 For the outlet
PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft World Precision Instruments NE-PC7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 World Precision Instruments SYRINGE-PUMP-PRO-02 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft World Precision Instruments NE-NET7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Size exclusion chromatography (SEC) column GE Life Science 17085101 Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 31434-1KG-M
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881-500G
Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) World Precision Instruments ALADDIN2-220/AL1000-220
Thermostat Temperature Controller Inkbird ITC-308 Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Tubing, ETFE (1/16" OD) IDEX Health & Science 1516
USB To RS-232 Converter World Precision Instruments CBL-USB-232 Optional: For computer without RS-232 port
Water Bath Grant Instruments Ltd. JB Nova 12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
  2. Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
  3. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  4. Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
  5. Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
  6. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
  7. Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
  8. Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
  9. Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
  10. Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
  11. Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  13. Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
  14. Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
  15. Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
  16. Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
  17. Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
  18. Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
  19. Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
  20. Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
  21. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  22. Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
  23. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
  24. Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
  25. Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 157، microfluidics، الليبوزومات، الحرارية، الليسوبيد، LTSLs، مترنح الرنجة المجهرية، خالية من الكوليسترول، الإندوسياين الأخضر (ICG)، doxorubicin تحميل (DOX)
إنتاج ميكرووبوبي من الليسوبيد اتووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheung, C. C. L., Ma, G., Ruiz, A.,… More

Cheung, C. C. L., Ma, G., Ruiz, A., Al-Jamal, W. T. Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes. J. Vis. Exp. (157), e60907, doi:10.3791/60907 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter