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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

Published: March 3, 2020 doi: 10.3791/60907
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Pharmacy, Queen's University Belfast

Summary

Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.

Abstract

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine kontinuierliche Hochdurchsatz-Vorbereitung von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen (LTSLs), die in der Lage sind, Chemotherapeutika wie Doxorubicin (DOX) zu laden. Dazu werden ein Ethanol-Lipid-Gemisch und eine Ammoniumsulfatlösung in einen gestaffelten Fischgrät-Mikromixer (SHM) injiziert. Die Lösungen werden schnell vom SHM gemischt und bieten eine homogene Lösungsmittelumgebung für die Liposomen-Selbstmontage. Gesammelte Liposomen werden zuerst geglüht, dann dialysiert, um Restethanol zu entfernen. Durch Pufferaustausch der externen Lösung wird durch Verwendung der Größenausschlusschromatographie ein Ammoniumsulfat-pH-Gradient hergestellt. DOX wird dann mit hoher Verkapselungseffizienz (> 80%) aus der Ferne in die Liposomen geladen. Die erhaltenen Liposomen sind homogen in der Größe mit einem Z-Durchschnittsdurchmesser von 100 nm. Sie sind in der Lage, bei leichter Hyperthermie (42 °C) eine temperaturgesteuerte Burstfreisetzung von gekapseltem DOX zu erreichen. Indocyaningrün (ICG) kann auch in die Liposomen für die nahinfrarote Laser-trigger DOX-Freisetzung mitgeladen werden. Der mikrofluidische Ansatz gewährleistet eine hohe Durchsatz-, reproduzierbare und skalierbare Aufbereitung von LTSLs.

Introduction

Die LTSL-Formulierung ist ein klinisch relevantes liposomales Produkt, das zur Abgabe des Chemotherapeutikums Doxorubicin (DOX) entwickelt wurde und eine effiziente Freisetzung von Burst-Medikamenten bei klinisch erreichbarer leichter Hyperthermie (T bei 41 °C)ermöglicht 1. Die LTSL-Formulierung besteht aus 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC), dem Lysolipid 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (MSPC; M steht für "mono") und PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Nach Erreichen der Phasenübergangstemperatur (Tm bei 41 °C) erleichtern Lysolipid und DSPE-PEG2000 zusammen die Bildung von Membranporen, was zu einer Burstfreisetzung des Medikaments2führt. Bei der Herstellung von LTSLs wird in erster Linie ein Bulk-Top-Down-Ansatz verwendet, nämlich Lipidfilmhydratation und Extrusion. Es bleibt schwierig, große Chargen mit identischen Eigenschaften und in ausreichenden Mengen für klinische Anwendungen zu reproduzierbar vorzubereiten3.

Mikrofluidik ist eine neue Technik zur Herstellung von Liposomen und bietet abstimmbare Nanopartikelgröße, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit3. Sobald die Fertigungsparameter optimiert sind, kann der Durchsatz durch Parallelisierung skaliert werden, mit Eigenschaften, die mit denen identisch sind, die auf der Tischskala3,4,5vorbereitet werden. Ein großer Vorteil der Mikrofluidik gegenüber herkömmlichen Schüttgütertechniken ist die Fähigkeit, kleine Flüssigkeitsvolumina mit hoher Beherrschung in Raum und Zeit durch Miniaturisierung zu handhaben, was eine schnellere Optimierung ermöglicht, während sie kontinuierlich und automatisiert arbeitet6. Die Herstellung von Liposomen mit mikrofluidischen Geräten wird durch einen Bottom-up-Nanopräzipitierungsansatz erreicht, der zeit- und energieeffizienter ist, da Homogenisierungsprozesse wie Extrusion und Beschallung unnötig sind7. Typischerweise wird eine organische Lösung (z. B. Ethanol) von Lipiden (und hydrophoben Nutzlast) mit einem mischbaren Nichtlösungsmittel (z. B. Wasser und hydrophile Nutzlast) vermischt. Da sich das organische Lösungsmittel mit dem Nichtlösungsmittel vermischt, wird die Löslichkeit für die Lipide reduziert. Die Lipidkonzentration erreicht schließlich eine kritische Konzentration, bei der der Fällungsprozess ausgelöst wird7. Nanopräzipitate von Lipiden wachsen schließlich in der Größe und nähern sich in einem Liposom. Die wichtigsten Faktoren für die Größe und Homogenität der Liposomen sind das Verhältnis zwischen nicht-solvent und lösungsmittel (d. h. wässrig-organisches Durchflussverhältnis; FRR) und die Homogenität der Lösungsmittelumgebung bei der Selbstmontage von Lipiden in Liposomen8.

Effizientes Flüssigkeitsmischen in der Mikrofluidik ist daher für die Herstellung homogener Liposomen unerlässlich, und verschiedene Ausführungen von Mischern wurden in verschiedenen Anwendungen eingesetzt9. Staggered Heringbone Micromixer (SHM) stellt eine der neuen Generationen von passiven Mischern dar, die einen hohen Durchsatz (im Bereich von mL/min) mit einem niedrigen Verdünnungsfaktor ermöglicht. Dies ist den herkömmlichen mikrofluidischen hydrodynamischen Mischvorrichtungen8,10überlegen. Die SHM hat gemusterte Fischgrätrillen, die Flüssigkeiten durch chaotische Advektion schnell mischen9,11. Die kurze Mischzeitskala von SHM (< 5 ms, kleiner als die typische Aggregationszeitskala von 10–100 ms) ermöglicht die Lipidselbstmontage in einer homogenen Lösungsmittelumgebung und erzeugt Nanopartikel mit gleichmäßiger Größenverteilung3,12.

Die Herstellung von LTSLs mit Mikrofluidik ist jedoch nicht so einfach im Vergleich zu herkömmlichen liposomalen Formulierungen aufgrund des Mangels an Cholesterin8, ohne die Lipid-Doppelschichten anfällig für Ethanol-induzierte Interdigitation13,14,15sind. Bisher ist die Wirkung von Restethanol während der mikrofluidischen Produktion von Liposomen nicht gut verstanden worden. Die meisten der gemeldeten Formulierungen sind von Natur aus resistent gegen Interdigitation (mit Cholesterin oder ungesättigten Lipiden)16 ,die im Gegensatz zu LTSLs sowohl gesättigt als auch cholesterinfrei sind.

Das hier vorgestellte Protokoll verwendet SHM, um LTSLs für die Lieferung von Temperatur-Trigger-Freisetzungsmedikamenten vorzubereiten. In der vorgestellten Methode haben wir sichergestellt, dass die mikrofluidisch hergestellten LTSLs nanogroß (100 nm) und gleichmäßig (Dispersity < 0.2) durch dynamische Lichtstreuung (DLS) sind. Darüber hinaus haben wir DOX mit der Transmembran-Ammoniumsulfat-Gradientenmethode (auch als Fernbelastung bezeichnet)17 als Validierung der Integrität der LTSL Lipid-Bilayer gekapselt. Die Fernbelastung von DOX erfordert das Liposom, um einen pH-Gradienten beizubehalten, um eine hohe Verkapselungseffizienz (EE) zu erreichen, was ohne eine intakte Lipid-Bilayer unwahrscheinlich ist. Bei dieser vorgestellten Methode, die sich von typischen mikrofluidischen Liposomenpräparationsprotokollen unterscheidet, ist ein Glühschritt erforderlich, bevor das Ethanol entfernt wird, um die Remote-Ladefähigkeit zu ermöglichen; d.h. die Integrität der Lipid-Bilayer wiederherzustellen.

Wie bereits erwähnt, können hydrophile und hydrophobe Nutzlasten auch in die ersten Lösungen für die gleichzeitige Verkapselung von Nutzlasten während der Bildung von LTSLs eingeführt werden. Als Proof-of-Concept wird Indocyaningrün (ICG), ein von der FDA zugelassener Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, der auch ein vielversprechendes photothermisches Mittel ist, in das ursprüngliche Lipidgemisch eingeführt und erfolgreich in die LTSLs eingeladen. Ein 808 nm Laser wird verwendet, um die DOX/ICG-geladenen LTSLs zu bestrahlen und innerhalb von 5 min erfolgreich photothermische, heizausgelöste Burst-Freisetzung von DOX zu induzieren.

Alle Instrumente und Materialien sind im Handel erhältlich, gebrauchsfertig und ohne Anpassungsbedarf. Da alle Parameter für die Formulierung von LTSLs optimiert wurden, konnten Forscher ohne Vorkenntnisse in der Mikrofluidik auch die LTSLs vorbereiten, die als Grundlage für ein thermosensitives Arzneimittelabgabesystem dienen.

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Protocol

1. Ausrüstungsaufbau

  1. Montieren Sie die Spritzenpumpen und SHM wie folgt.
    1. Schließen Sie den "To Computer"-Anschluss der sekundären Spritzenpumpe (Pumpe 02, für wässrige Lösung) mit dem Netzwerkkabel "An Netzwerk" der Master-Spritzenpumpe (Pumpe 01, für Ethanol-Lipid-Lösung) mit dem Netzwerkkabel Pumpe zu Pumpeanden Anschluss "To Network"an.
    2. Schließen Sie den "An Computer"-Anschluss der Masterpumpe an den "RS232 Serial"-Anschluss des Computers mit dem PC-to-Pump-Netzwerkkabel an (Abbildung 1, blau).
    3. Verbinden Sie Schläuche mit jedem der Ein- und Auslässe des SHM mit einer Mutter und Ferrule. Konvertieren Sie die Klemme des Schlauches für beide Einlässe in weibliche Luer mit einer anderen Mutter und Ferrule und einer Union-Montage. Längere Schläuche der Einlässe ermöglichen eine einfachere Befestigung an den Spritzen (Abbildung 2).
  2. Richten Sie die Pumpensteuerungssoftware ein.
    1. Weisen Sie die Adresse der Hauptspritzenpumpe und der Sekundärspritzenpumpe "Ad:01" bzw. "Ad:02" mit der Taste "Setup" der Spritzenpumpe zu. Dies muss nur zum ersten Mal geschehen.
    2. Öffnen Sie die Pumpensteuerungssoftware am Computer. Die beiden Spritzenpumpen sollten automatisch erkannt werden, gefolgt von einem Piepton. Andernfalls klicken Sie auf Pumpen und Suchen nach Pumpen, um die Verbindung zu aktualisieren. (Abbildung 3).
    3. Weisen Sie den Durchmesser 12,45 (mm) zu, indem Sie "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)" wählen.
    4. Zuweisen von 0,25 ml/min für Pumpe 01 (Ethanol-Lipidlösung) und 0,75 ml/min für Pumpe 02 (wässrige Lösung). Die Durchflussraten entsprechen einer Gesamtdurchflussrate (TFR) von 1 ml/min und einem wässrigen Ethanol-Durchflussverhältnis (FRR) von 3.
    5. Weisen Sie Volumen allen Werten über 5 ml zu.
      HINWEIS: Das angestrebte Infusionsvolumen ist unter Berücksichtigung des Hohlraumvolumens der Schläuche größer als das geladene Flüssigkeitsvolumen eingestellt.
    6. Wählen Sie den INF-Modus (Infusion) für beide Pumpen.
    7. Drücken Sie Set, um die Einstellungen zu bestätigen.

2. Bereiten Sie die LTSLs vor

  1. Vorbereiten eines LTSL10- oder LTSL10-ICG-Lipidgemisches (siehe Tabelle 1).
  2. 1 ml Lipidmischung und mindestens 3 ml (NH4)2SO4 Lösung mit zwei 5 ml Luer-Sperrspritzen zurückziehen.
  3. Installieren Sie die beiden Spritzen auf die Spritzenpumpen in aufrechter Position, indem Sie den Fassflansch der Spritze auf den Spritzenhalter der Pumpe und den Kolbenflansch der Spritze auf den Schubblock der Pumpe schieben (Abbildung 4).
  4. Wickeln Sie das Ende des Heizbandes mit der wässrigen Lösung in die Spritze. Wickeln Sie das andere Ende des Heizbandes und der Temperatursonde des Thermostats um die Spritze mit der Lipidlösung. Es ist hilfreich, diesen Schritt mit leeren Spritzen an Ort und Stelle zu üben, um den Montageprozess zu erleichtern (Abbildung 5A).
  5. Schließen Sie die beiden Spritzen an die weiblichen Luer-Adapter der entsprechenden Einlässe des SHM an. Stellen Sie sicher, dass die Spritzen, die das Lipidgemisch und (NH4)2SO4 Lösungen enthalten, Ethanol- bzw. wässrige Einlass enthalten. Passen Sie die Kolbenposition an, um Luftblasen von den Spritzen zu entfernen (Abbildung 5B).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spritzen noch sicher auf dem Spritzenhalter der Pumpen positioniert sind.
  6. Erhitzen Sie die Spritzen mit einem Heizband mit einer 10 s-Heizsitzung auf über 51 °C. Lassen Sie den Thermostat die Temperatur der Spritzen aktualisieren. Wiederholen Sie diesen Schritt in den folgenden Schritten, um die Temperatur während der Infusion beizubehalten.
    VORSICHT: Schalten Sie das Heizband nach 10 s aus, um Temperaturüberschreitungen zu verhindern und dem Thermostat zu ermöglichen, die tatsächliche Temperatur zu aktualisieren. Das Heizband sollte auch mit Vorsicht behandelt werden, da seine Temperatur sehr schnell ansteigt. Durch die kontinuierliche Erwärmung können die Geräte und Spritzen beschädigt werden, da der Thermostat die gemessene Temperatur aktualisiert.
  7. Sobald die Temperatur über 51 °C liegt, führen Sie die Spritzenpumpen durch Drücken von Run All in der Pumpensteuerungssoftware aus (Abbildung 3).
  8. Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsfluss frei von Luftblasen und Leckagen ist. Entsorgen Sie das Anfangsvolumen (ca. 0,5 ml) Flüssigkeit aus dem Auslauf als Abfall.
    HINWEIS: Dieses anfängliche Abfallvolumen ist nicht eindeutig und hängt vom internen Volumen des Setups ab, d. h. vom Volumen für Flüssigkeit, das von den Spritzen durch die Schläuche und SHM zum Auslass wandern soll.
  9. Sammeln Sie den Rest der Flüssigkeit als Liposomenproben in ein Mikrozentrifugenrohr oder eine Bijou-Durchstechflasche.
  10. Halten/stoppen Sie die Infusion, wenn die Flüssigkeit in einer der Spritzen fast leer ist.
    HINWEIS: Die Pumpen sollten manuell gestoppt werden, da die Pumpen die Position, wenn die Spritzen leer sind, möglicherweise nicht genau erkennen.
  11. Die gesammelten Liposomenlösungen in ein 60 °C-Wasserbad für 1,5 h in Diene geben.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um die Beladung von Medikamenten in die Liposomen zu ermöglichen.
  12. Übertragen Sie die Lösungen auf Dialyserohre. Dialyze die Lösungen gegen 1 L von 240 mM (NH4)2SO4 bei 37 °C für mindestens 4 h, um gereinigte Liposomen zu erhalten.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Liposomen in diesem Schritt sind bei 5 mM Phospholipid. Gereinigte Liposomen können bei 4 °C gelagert werden.
  13. Um den SHM für den wiederholten Gebrauch zu reinigen, spülen Sie den SHM sequenziell mit entionisiertem Wasser, Ethanol und trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas.

3. Fernladen von DOX in LTSLs durch Transmembran-pH-Gradient

  1. Tauschen Sie den externen Puffer von LTSLs in HEPES-gepufferte Saline (HBS) aus, indem Sie die Größenausschlusschromatographie (SEC) verwenden, um einen pH-Gradienten für Transmembranen zu erstellen.
    1. Fügen Sie insgesamt 25 ml HBS am oberen Rand einer SEC-Spalte hinzu, um die Spalte vorzubereiten. Lassen Sie alle Eluenten durch die Säule zu löschen und entsorgen Sie das Eluat.
    2. 1 ml dialysierte Liposomen, die ab Schritt 2.12 zubereitet werden, in die Säule geben und die Elute entsorgen.
    3. Fügen Sie 1,5 ml HBS in die Spalte und entsorgen Sie die Elute.
    4. Fügen Sie der Spalte 3 ml HBS hinzu und sammeln Sie die 3 ml Elute.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Liposomen werden bei diesem Schritt gesammelt und sind bei 1,67 mM Phospholipid. Pufferausgetauschte Liposomen können bei 4 °C gelagert werden.
  2. INkubieren Sie LTSLs mit Doxorubicin (DOX) und reinigen Sie LTSLs.
    1. Fügen Sie doX-Lösung in 1:20 DOX-zu-Phospholipid-Molar-Verhältnis in 1 ml puffergetortes Liposomenlösung (1,67 mmol) in einer Bijou-Durchstechflasche enthalten. Dies kann durch Zugabe von 48,4 l von 1 mg/ml DOX-Lösung (83,4 x mol) erreicht werden.
    2. Legen Sie die Bijou-Durchstechflasche 1,5 h in ein 37 °C-Wasserbad, damit DOX in die Liposomen geladen werden kann.
    3. Mischen Sie 10 l der Liposomen mit 170 l HBS und 20 l von 1% (v/v) Triton X-100 Lösung in einer schwarzen 96-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für drei Bohrungen. Diese Brunnen entsprechen dem DOX-Gehalt "vor der Reinigung".
    4. Bei der Herstellung von LTSL10-ICG 40 l der Liposomen mit 160 l DMSO in einer klaren 96-Well-Platte mischen. Wiederholen Sie dies für drei Bohrungen. Diese Brunnen entsprechen dem ICG-Gehalt "vor der Reinigung".
    5. Reinigen Sie die Liposomenlösung, wie in Schritt 3.1 beschrieben.
      ANMERKUNG: Um die Säule für die zukünftige Reinigung wiederzuverwenden, reinigen Sie die Säule von kostenlosem DOX, indem Sie zuerst 1 ml verdünnte 0,5 M NaOH-Lösung hinzufügen, bevor Sie Schritt 3.1.1 ausführen. Free DOX in rot wird violett-blau und elute durch die Säule schnell.
    6. Mischen Sie 30 l der gereinigten Liposomenlösung mit 150 l HBS und 20 l von 1% (v/v) Triton X-100 Lösung in einer schwarzen 96-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für drei Bohrungen. Diese Brunnen entsprechen dem DOX-Gehalt "nach der Reinigung".
    7. Mischen Sie bei LTSL10-ICG 40 l der gereinigten Liposomenlösung mit 160 l DMSO in einer klaren 96-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für drei Bohrungen. Diese Brunnen entsprechen dem ICG-Gehalt "nach der Reinigung".
    8. Messen Sie die DOX-Fluoreszenzintensität der Brunnen vor (Schritt 3.2.3) und nach (Schritt 3.2.5) Reinigung mit hilfe eines Mikroplattenlesers (z.B. = 485 nm, -em = 590 nm).
    9. Berechnen Sie die Verkapselungseffizienz von DOX (DOX EE), indem Sie das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten vor und nach der Reinigung nehmen.
      Equation 1
    10. Messen Sie die ICG-Absorption der Brunnen vor und nach der Reinigung mit einem Mikroplattenleser (600 bis 1000 nm).
    11. Berechnen Sie die Verkapselungseffizienz von ICG (ICG EE), indem Sie das Verhältnis der Absorption bei 792 nm vor und nach der Reinigung unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (3-mal) während der Reinigung berücksichtigen.
      Equation 2

4. Dynamische Lichtstreuung (DLS)

  1. Fügen Sie die Liposomenlösung (Schritt 2,12) 50 l auf 450 l entionisiertes Wasser hinzu.
  2. Legen Sie die Küvette in das DLS-Instrument und führen Sie die Messung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  3. Zeichnen Sie den mittleren Z-Durchschnittsdurchmesser und die Dispergität von drei Messungen für jede Probe auf.

5. Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC)

  1. Konzentrat 1 ml der Liposomenproben (Schritt 2.12) mit einer Zentrifugalfiltereinheit auf 0,5 ml (endgültige Lipidkonzentration von 10 mM). Drehen Sie mit einem Festwinkelrotor ca. 15 min bei 7500 x g.
  2. Übertragen Sie 20 l (NH4)2SO4 Lösungs- und Liposomenproben auf zwei entsprechende DSC-Pfannen. Versiegeln Sie die Pfannen mit DSC-Hermetikdeckeln mit dem DSC-Probenpresskit.
  3. Messen Sie die Probe von 30 °C bis 60 °C bei einer Heizrate von 1 °C/min mit einem Differential-Scanning-Kalorimeter.
  4. Analysieren Sie die Daten mit entsprechender Software. Nehmen wir die Phasenübergangstemperatur (Tm) als Beginn des Phasenübergangs (Schmelzspitze), der durch den x-Abfang der Tangente des Punkts der maximalen Steigung gemessen wird.

6. Doxorubicin-Freisetzung

  1. HBS bei einer bestimmten Temperatur (37 oder 42 °C) mit einem Wasserbad vorheizen. Bereiten Sie ein Eiswasserbad zum Abschrecken der Proben vor.
  2. Fügen Sie 100 l gereinigte DOX-belastete Liposomen (Schritt 3.2.5) in 1,9 ml HBS in einem Mikrozentrifugenrohr hinzu. Legen Sie das Rohr in das Wasserbad der angegebenen Temperatur.
  3. Ziehen Sie sofort 200 l Proben aus der Röhre ab und legen Sie sie schnell in das Eiswasserbad, um jede nachfolgende Wirkstofffreisetzung zu löschen. Diese Stichprobe entspricht dem Anfangszeitpunkt (t = 0).
  4. Ziehen Sie 200 l Proben zu den nachfolgenden Zeitpunkten (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) ab und legen Sie sie schnell in das Eiswasserbad, um jede Wirkstofffreisetzung zu löschen.
  5. Mischen Sie 50 l der Probe von jedem Zeitpunkt mit 150 l HBS in einer schwarzen 96-Well-Platte. Messen Sie die DOX-Fluoreszenzintensität mit einem Plattenleser.
  6. Fügen Sie 20 L von 1% (v/v) Triton X-100 in zufällig ausgewählte Brunnen, die in Schritt 6.5 vorbereitet werden. Messen Sie die DOX-Fluoreszenzintensität dieser Brunnen mit einem Plattenleser. Diese Werte entsprechen dem vollständig freigegebenen (t = 100 % Release) Zeitpunkt.
  7. Berechnen und zeichnen Sie den Prozentsatz von DOX, der durch Interpolation der Fluoreszenzintensität jedes Zeitpunktes (I(t)) im Vergleich zum ursprünglichen (I(0)) und vollständig freigegebenen Wert (I()) freigesetzt wird.
    Equation 3

7. Laserheizung und ausgelöste Freisetzung

  1. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 37 °C ein und lassen Sie die Temperatur stabilisieren.
  2. Fügen Sie 200 L VON DOX geladenen LTSL10-ICG ([ICG] = 10 g/ml) zu einer klaren 96-Well-Platte hinzu, legen Sie sie dann in das Wasserbad, halten Sie den Boden in Wasser getaucht.
  3. Stellen Sie den Strom des Lasersystems auf 2,27 A ein. Stellen Sie den Kollimator des Lasersystems auf 5 cm vertikal über der Oberfläche der 96-Well-Platte, was einem Energiefluss von 0,5 W/cm2 entspricht [Abbildung 6].
    VORSICHT: Das Lasersystem sollte in Übereinstimmung mit den einschlägigen Lasersicherheitsmaßnahmen betrieben werden.
  4. Schalten Sie den Laser ein und überwachen Sie die Temperatur jede Minute mit einer Lichtwellenleiter-Temperatursonde.
  5. Bei 5 und 10 min 10 l laserbestrahlte Liposomen von der klaren 96-Well-Platte abziehen und mit 190 l HBS für drei Bohrungen in einer schwarzen 96-Well-Platte mischen.
  6. Mischen Sie 10 l der Liposomen mit 170 l HBS und 20 l von 1% (v/v) Triton X-100 Lösung für drei Bohrungen in einer schwarzen 96-Well-Platte. Diese Brunnen entsprechen den "100% veröffentlichten" DOX-Inhalten. Messen Sie die DOX-Fluoreszenzintensität und berechnen Sie die DOX-Freisetzung, wie in Schritt 6.7 beschrieben.

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Representative Results

Die Herstellung von LTSLs durch Mikrofluidik erfordert die Lipidzusammensetzung von DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, Molverhältnis; LTSL10). Abbildung 7A (links) zeigt das Auftreten von hergestelltem LTSL10 ab Schritt 2.9 als klare und nicht-viskose Flüssigkeit. LtSL10-Formulierung wird aus der herkömmlichen Formulierung LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, Molar-Verhältnis) entwickelt, da LTSL4 eine gelartige viskose Probe bildet, wie die große Menge an Inderblasen zeigt(Abbildung 7A; rechts).

Die DLS-Messung von LTSL10 (Abbildung 7B, rot) zeigte, dass der Z-Durchschnittliche Durchmesser und die Dispergität von LTSL10 95,28 x 7,32 nm bzw. 0,100 x 0,022 betrugen, was auf den Erfolg des Experiments hindeutet. Abbildung 7B (grau) zeigt auch eine suboptimale Probe, die bei 20 °C hergestellt wurde, wo größere und dispergiertere Liposomen erhalten wurden.

Abbildung 7C zeigt, dass der DOX EE von LTSL10. DOX EE sollte in der Regel etwa 80% betragen. LTSLs, die nach der herkömmlichen Methode der Lipidfilmhydratation mit Extrusion (LF) hergestellt werden, sind zum Vergleich enthalten, wie an anderer Stelle beschrieben18. DOX EE von LTSL4 (LF) und LTSL10 (LF) zeigte eine anständige DOX-Belastung von rund 70 % bzw. 50 %. Das Glühen von ltSL10 (Schritt 2.11) ist unerlässlich, um das LADEN von DOX zu ermöglichen. In Ermangelung des Glühschritts ist low DOX EE (< 20%) unabhängig von der Inkubationstemperatur (20 °C bis 42 °C) und der Dauer (1 bis 24 h). Dies deutete auf den Ausfall von LTSL10 hin, um einen Transmembran-pH-Gradienten beizubehalten, bei dem DOX stattdessen passiv oder durch Adsorption geladen wurde. Durch das Glühen des vorbereiteten LTSL10 erhöhte sich DOX EE deutlich auf einen Mittelwert von 85%, was auf den Erfolg der Fernbeladung von DOX und das Vorhandensein des pH-Gradienten der Transmembran hindeutet.

Abbildung 7D zeigt das DOX-Releaseprofil von LTSL10. Bei 37 °C betrug die Freisetzung von gekapseltem DOX über 60 min etwa 10%. Im Gegensatz dazu wurde bei 42 °C der gesamte gekapselte DOX innerhalb von 5 Minuten freigesetzt, was die Temperaturempfindlichkeit von LTSL10 demonstriert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit LTSL10 (LF) als Steuerung beobachtet.

Abbildung 8 zeigt die Phasenübergangstemperatur (Tm) von LTSL10, die durch Differentialscanning Calorimetrie (DSC) gekennzeichnet ist. Gepunktete Linien als Tangente des Punkts der maximalen Steigung werden als visuelle Hilfe der Übergangstemperatur der Anfangsphase (x-Intercept der Tangentenlinie) hinzugefügt. LTSL10 hat einen relativ breiten Phasenübergang mit Beginn bei 41,6 °C und Spitze bei 42,6 °C. Ähnliche Ergebnisse wurden mit LTSL10 (LF) beobachtet, was auf einen geringfügigen Unterschied zwischen den Zubereitungstechniken hindeutet. Zum Vergleich: LTSL4 (LF) hat einen niedrigeren und schärferen Phasenübergang, in Übereinstimmung mit der Literatur1.

Abbildung 9 zeigt die Charakterisierung von LTSL10-ICG. Der Effekt der anfänglichen ICG-Konzentration auf die Größe (Abbildung 9A) und die Belastungseffizienz von DOX und ICG (Abbildung 9B) sind in drei Konzentrationsbereiche eingeteilt. Bei niedriger ICG-Konzentration (ICG-zu-Lipid-Molarverhältnis von 0,003; Anfangskonzentration von 60 m ICG und 20 mM Lipid) ähnelten Z-Durchschnitt, Dispersität und DOX EE LTSL10 ohne ICG-Belastung; ICG EE lag bei rund 75 %. Das effiziente Zusammenladen von DOX und ICG in LTSL10 kann bei dieser ICG-Konzentration erreicht werden. Bei den ICG-Zwischenkonzentrationen, während Größe und Dispergität der Proben zufriedenstellend waren, wurden sowohl DOX als auch ICG EE reduziert. Insbesondere die Abnahme von DOX EE deutete auf die Störung der liposomalen Membran und damit des pH-Gradienten hin. Bei hohen ICG-Konzentrationen wurden erneut Proben gegelt; DOX und ICG EE wurden deutlich verringert.

LTSL10-ICG wurde mit Nahinfrarotlaser (Abschnitt 7) bestrahlt, um photothermische Erwärmung zu induzieren und löste die Freisetzung von DOX aus (Abbildung 10). Bei Laserbestrahlung erhitzte sich die Probe zunächst auf 49,7 °C mit einer allmählichen Temperaturreduktion. Die anschließende Laserbestrahlung erhöhte die Temperatur auf 36,7 °C. Die Quantifizierung des freigegebenen DOX ergab, dass nach dem ersten Heizzyklus eine vollständige Burst-Freisetzung von gekapseltem DOX erreicht wurde. Dies war erwartungsgemäß, da die Temperatur über 42 °C erreichte, in Übereinstimmung mit dem in Abbildung 7Ddargestellten DOX-Freigabeprofil. Im Gegensatz dazu kann LTSL10 ohne ICG keine photothermische Erwärmung bieten und hat daher DOX bei Laserbestrahlung nicht freigesetzt.

Figure 1
Abbildung 1: Foto des Spritzenpumpen-Setups. Der "To Network"-Anschluss der Hauptpumpe (Pumpe 01) ist an den "To Computer" der Sekundärpumpe angeschlossen (Pumpe 02; gelb); der "Zum Computer"-Anschluss der Masterpumpe ist an den RS-232-Anschluss des Computers angeschlossen (blau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Foto des SHM-Setups. (A) Zusammengebaute Ansicht des SHM-Setups. (B) Explosionsansicht des SHM-Setups. Ein- und Auslässe des SHM werden mit einer Mutter und Einer Ferrule mit Schläuchen verbunden. Die Schläuche beider Einlässe werden durch einen längeren Schlauch mit Mutter und Ferrule an jedem Ende verlängert, der durch einen weiblichen Luer-Adapter mittels einer Union-Baugruppe beendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Schnittstelle der Pumpensteuerungssoftware. Die beiden Spritzenpumpen sollten beim Starten der Software automatisch erkannt werden; Andernfalls klicken Sie auf Pumpen in der oberen linken Ecke und Suchen nach Pumpen. Die zu konfigurierenden Parameter werden in roten Feldern hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Foto der Spritzenpumpen und Einbau einer Spritze. (A) Spritzenhalterung und Spritzenhalter-Daumenschraube (2, eine auf jeder Seite) der Spritzenpumpe (gelbe Box). Pusher-Block, Einstellungs-Daumenschraube und Antriebsmutter-Taste (weißer Knopf links) der Spritzenpumpe (grüne Box). (B) Position einer installierten Spritze auf der Spritzenpumpe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Foto der Montage von Spritzen, Heizelement und SHM. (A) Montage von Spritzen, Heizband und Thermostat. (B) Montage von Spritzen, Heizband, Thermostat und SHM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Foto des Laseraufbaus. (A) Foto des fasergekoppelten Lasersystems während des Betriebs. (B) Position des Kollimators 5 cm über der 96-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Charakterisierung von LTSL10. (A) Foto von (links) LTSL10 und (rechts) LTSL4, vor der Dialyse. LTSL10 erschien als klare und nicht-viskose Flüssigkeit, während LTSL4 gel-like und viskos war. (B) Z-Durchschnitt und Dispergität von 10 mM LTSL10 bei 20 und 51 °C. Feste Balken und offene Kreise () geben den Durchmesser des Z-Durchschnitts und die Dispergität an. (C) DOX EE von LTSL4 (LF; weiß), LTSL10 (LF; weiß) und LTSL10 vor (grau) und nach dem Glühen (rot). (D) DOX-Freisetzung von LTSL10 (Kreis) und LTSL10 (LF; Kreuz) bei 37 °C (schwarz) und 42 °C (rot). Die Daten stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. p < 0,001; zweischwanzige ungepaarte T-Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Thermische Eigenschaften von LTSL10. Thermographen von LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) und LTSL10, gekennzeichnet durch DSC. Gepunktete Linien werden als visuelle Hilfe für die Übergangstemperatur der Beginnphase hinzugefügt. Die Daten stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Charakterisierung von LTSL10-ICG. (A) Z-Durchschnittsdurchmesser (rot) und Dispergität (blau) des ICG-belasteten LTSL10. (B) DOX EE (rot) und ICG EE (grün) von ICG-geladenem LTSL10. Die Daten stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: Laserinduzierte photothermische Erwärmung löste die Loslösung von DOX-geladenem LTSL10 und LTSL10-ICG aus. (A) Die Temperatur der bestrahlten Proben und (B) DOX-Freisetzung von DOX-belasteten LTSL10 (blau) und LTSL10-ICG (rot) während der laserinduzierten photothermischen Erwärmung. Die Daten stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Lipidmischungen, Puffer und Lagerlösungen.

20 mM LTSL10 Lipidmischung
(DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, Molverhältnis)		 Für 1 ml 20 mM LTSL10 Lipidmischung:
Lösen Sie 11,75 mg DPPC mit 210 l MSPC-Ethanolbestand (5 mg/ml), 558 l DSPE-PEG2000 Ethanolbestand (10 mg/ml) und 232 l Ethanol auf.
Alternativ kann eine entsprechende Menge an MSPC (1,05 mg) und DSPE-PEG2000 (5,58 mg) als Pulver hinzugefügt werden.
20 mM LTSL10-ICG Lipidmischung
(DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, Molverhältnis;
ICG-zu-Lipid-Molarenverhältnis = 0,003)		 Für 1 ml 20 mM ICG-belastetes LTSL10 Lipidgemisch:
Lösen Sie 11,75 mg DPPC mit 210 l MSPC-Ethanolbestand (5 mg/ml), 558 l DSPE-PEG2000 Ethanolbestand (10 mg/ml) und 46,5 l ICG-Ethanolbestand (1 mg/ml) und 185,5 l Ethanol auf.
Alternativ kann eine entsprechende Menge an MSPC (1,05 mg) und DSPE-PEG2000 (5,58 mg) als Pulver hinzugefügt werden.
Enthält 60 m ICG und 20 mM Lipid.
240 mM Ammoniumsulfatlösung (NH4)2SO4, pH 5,4 31,71 g (NH4)2SO4 pro L entionisiertes Wasser auflösen.
Der pH-Wert der Lösung beträgt nativ 5,4, eine zusätzliche pH-Einstellung ist nicht erforderlich.
Doxorubicin-Lösung (DOX), 1 mg/ml 1 mg DOX pro ml entionisiertem Wasser auflösen.
DSPE-PEG2000 Ethanolvorrat, 10 mg/ml 10 mg DSPE-PEG2000 pro ml Ethanol auflösen.
HEPES-gepufferte Saline (HBS), pH 7,4 8,0 g NaCl und 4,766 g HEPES pro L entionisiertem Wasser auflösen.
Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 2,5 M NaOH-Lösung ein.
ICG Ethanollager, 1 mg/ml 1 mg ICG pro ml Ethanol auflösen.
MSPC Ethanollager, 5 mg/ml 5 mg DPPC pro ml Ethanol auflösen.

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Discussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Herstellung von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen (LTSLs) mit einem gestaffelten Fischgrät-Mikromixer (SHM). Die LTSL10-Formulierung ermöglicht eine temperaturgesteuerte Burstfreisetzung von Doxorubicin innerhalb von 5 Minuten bei einer klinisch erreichbaren hyperthermischen Temperatur von 42 °C. Indocyaningrün (ICG) kann auch für photothermische Erwärmung mitgeladen werden, ausgelöst die Freisetzung von DOX. Die Methode beruht auf: (i) Selbstmontage von Phospholipiden in Liposomen unter einer homogenisierten Lösungsmittelumgebung, die durch die schnelle, chaotische Vermischung von Ethanol und Ammoniumsulfatlösung im SHM11bereitgestellt wird; ii) Glühen der Liposomen zur Erhaltung der Integrität der Lipid-Doppelschicht, die für die DOX-Belastung unerlässlich ist; und (iii) Fernbeladung von DOX in LTSLs durch einen Ammoniumsulfat-pH-Gradienten17. Da die in diesem Protokoll verwendeten Geräte handelsüblich sind und die Parameter optimiert sind, ist dieser Ansatz für Anwender ohne Vorkenntnisse oder Mikrofluidik-Erfahrung überschaubar.

Einer der wichtigsten Schritte innerhalb des Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass die gesamte Baugruppe ordnungsgemäß gesichert ist und Flüssigkeit ordnungsgemäß infundiert werden kann (Schritt 2.5). Da die Reproduzierbarkeit der Selbstmontage von Liposomen auf einer homogenisierten Lösungsmittelumgebung beruht, stört jede Instabilität, wie z. B. das Lösen von Spritzen oder das Einbringen von Luftblasen, die Stabilität des Flüssigkeitsflusses und führt zu suboptimalen Liposomengröße und Dispergität. Dies ist auch die Begründung für Schritt 2.8, wo das Volumen, bestehend aus der Flüssigkeit, die zunächst den Kanal besetzt und bevor ein stabiler Fluss erreicht wird, entsorgt werden sollte.

Ein zweiter wichtiger Schritt für ein erfolgreiches Experiment ist der Glühschritt, um einen hohen DOX EE (Schritt 2.11) zu ermöglichen. Bei cholesterinfreien Liposomen akkumulieren micellebildende Membrankomponenten (z.B. MSPC und DSPE-PEG2000) an Korngrenzen mit einem hohen Grad an Defekten, um eine hohe Membrankrümmung2aufzunehmen. Diese Anordnungen begünstigen thermodynamisch die Bildung und Stabilisierung von Membranporen, geöffneten Liposomen oder Bilayer-Scheiben. Der niedrige DOX EE von LTSL10 ohne Glühen deutete darauf hin, dass poröse Strukturen sogar unter Tmexistierten, was dazu führte, dass der für die DOX-Belastung erforderliche pH-Gradient fehlte (Abbildung 7C). Die vorzeitige Bildung von Poren unter Tm wurde bei LTSLs, die durch Lipidfolie (LTSL4 (LF) und LTSL10 (LF)) hergestellt wurden, nicht beobachtet, wo kein Glühen erforderlich ist. Darüber hinaus erfordern cholesterinhaltige Formulierungen, die mit Mikrofluidika hergestellt werden, auch kein Glühen8. Es wird daher spekuliert, dass die vorzeitige Bildung von Poren eine kombinierte Wirkung des Vorhandenseins von Ethanol während der Zubereitung und des Mangels an Cholesterin in der Lipid-Bilayer ist. Strukturelle Defekte innerhalb der Bilayer-Membran wurden durch Glühen der Liposomen oberhalb von Tmeliminiert, so dass Lipidmoleküle homogen verteilt und Defekte korrigiert werden können19. Darüber hinaus ist der Glühprozess ein irreversibler Prozess, bei dem geglühte Liposomen, die auf eine Temperatur unter Tm zurückkehren, nicht undichte Vesikel19in Übereinstimmung mit dem geglühten LTSL10 nachbilden.

Die Natur der mikrofluidischen Präparation von Liposom ist ein Nanopräzipitierungsprozess, der zwei mischbare Lösungsmittel mit ausgeprägter Löslichkeit für die Lipide erfordert: typischerweise Ethanol (als Lipidlösungsmittel) und wässrige Lösung (als Lipid-Nichtlösungsmittel). Somit ist das Vorhandensein von Ethanol unvermeidbar. Daher können Formulierungen, die empfindlich oder anfällig für alkoholinduzierte Interdigitation13sind, wie cholesterinfreie Liposomen20, eine Änderung der Formulierung oder Neuoptimierung des Protokolls erfordern. Wie bei der Herstellung von LTSL4 nachgewiesen wurde, wurde das hochviskose Gel erhalten (Abbildung 7A), das wahrscheinlich auf die Bildung einer interdigitatierten Gelphase15zurückzuführen war. Auf der anderen Seite wurde LTSL10 mit seiner höheren Polymerkonzentration, die die Interdigitation21verhindert, erfolgreich vorbereitet. Folglich muss auch ein Ethanolentfernungsverfahren durchgeführt werden; hier wurde es einfach durch Dialyse entfernt. Während on-chip kontinuierliche Reinigungstechniken wie tangentiale Strömungsfiltration (sowohl zur Ethanolentfernung als auch zum Pufferaustausch)entwickeltwurden, sind ihre Implementierung (als One-Chip oder modular) über das Ziel dieses Protokolls hinaus. Nichtsdestotrotz erwarten wir in Zukunft, dass diese modularen oder standardisierten Designs optimiert und in der Verfügbarkeit erhöht werden, wodurch der mikrofluidische Produktionsprozess rationalisiert wird.

Eine weitere Einschränkung des Protokolls ist der Probenverlust aufgrund der Entfernung der Flüssigkeiten, nämlich das anfängliche Abfallvolumen (Schritt 2.8) sowie der letzte Bruchteil von Lösungen, die injiziert würden, aber nicht den Auslass erreichten. Diese Probenverluste sind nahezu unvermeidbar und können zu einem erheblichen Teil des Vorbereitungsvolumens bei der Herstellung im Labormaßstab beitragen, insbesondere wenn ein kleines Volumen oder wertvolle Proben vorbereitet werden sollen. Bei Bedarf könnte die Lipidrückgewinnung durch eine hochleistungsstarke flüssige chromatographie-verdunstende Lichtstreudetektormethode quantifiziert werden, die eine schnelle Quantifizierung der Lipidkonzentrationen24ermöglicht. Sobald der Prozess jedoch optimiert und skaliert ist, z. B. durch die Verwendung einer größeren Spritze oder eines Flüssigkeitsreservoirs, könnte der Durchsatz weiter skaliert werden und Probenverluste wären weniger signifikant.

Der Hauptunterschied zwischen dieser Methode und der bestehenden Aufbereitungsmethode besteht darin, dass Liposomen in einer kontrollierbaren Lösungsmittelumgebung in einer durchgängigen, kontinuierlichen Art und Weise selbst zusammengesetzt werden. Das Lipidfilmverfahren ist ein Batch-Herstellungsprozess und erfordert eine Größenhomogenisierung. Obwohl es im Bench-Scale sehr machbar ist, bleibt es schwierig, für die klinische Produktion zu skalieren. Innerhalb bestehender mikrofluidischer Techniken, z. B. mikrofluidischer hydrodynamischer Fokussierung, bietet SHM eine kürzere Mischzeitskala11 und einen höheren Durchsatz (im Bereich von ml/min) mit geringerem Verdünnungsfaktor; Ungeachtet der Herstellung von LTSLs wurde bisher nicht mit anderen mikrofluidischen Geräten berichtet. Der große Vorteil unseres Ansatzes ist die hochdurchsatzige, skalierbare Herstellung thermoempfindlicher Liposomen.

Bisher bietet unser mikrofluidisches Protokoll eine kontinuierliche Produktion von LTSL10 mit Drogenbeladefähigkeit. Auch andere Nutzlasten als DOX und ICG sind tragfähig. Die Ethanolentfernung durch Dialyse, Die Fernbeladung von Medikamenten und die Reinigung durch die SEC-Säule bleiben jedoch als Batch-Prozesse und sind die Engpässe des gesamten Formulierungsprozesses. Zukünftige Entwicklung könnte sich auf die Verwendung mikrofluidischer Ansätze (z. B. tangentiale Strömungsfiltration) konzentrieren, um den Durchsatz dieser nachgelagerten Prozesse zu erhöhen und die Skalierbarkeit des Protokolls zu erhöhen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) und dem Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) für die Finanzierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Lipoid PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) Lipoid PE 18:0/18:0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) Avanti Polar Lipid 855775P-500MG Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC
(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375-100G
Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-624 Requires 2 units. For the inlets
Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-630 Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)
Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich 31119-1KG-M
Bijou vial VWR 216-0980 7 mL, clear, polystyrene vial
Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801008 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit
Centrifuge ThermoFisher Scientific Heraeus Megafuge 8R With HIGHConic III Fixed Angle Rotor
Cuvette Fisher Scientific 11602609 Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement
Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi Sigma-Aldrich PURX12015-1KT 12-14 kDa MWCO
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34943-1L-M
DLS Instrument Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS90
Doxorubicin Hydrochloride (DOX) Apollo Scientific BID0120
DSC Instrument TA Instruments TA Q200 DSC
DSC Tzero Hermetic Lids TA Instruments 901684.901 For DSC measurement
DSC Tzero Pans TA Instruments 901683.901 For DSC measurement
DSC Tzero Sample Press Kit TA Instruments 901600.901 For DSC measurement
Ethanol VWR 20821.330 Absolute, ≥99.8%
FC-808 Fibre Coupled Laser System CNI Optoelectronics Tech FC-808-8W-181315 FOC-01-B Fiber Collimator included.
Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-200 For the outlet
Fibre Optic Temperature Probe Osensa PRB-G40
Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) Darwin Microfluidics Herringbone Mixer - Glass Chip
Heating Tape Omega DHT052020LD Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models
Indocyanine Green Adooq A10473-100 Distributed by Bioquote Limited (U.K.)
Luer-lock Syringe, 5 mL VWR 613-2043 Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm
Microplate Reader BMG Labtech FLUOstar Omega Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters
Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom ThermoFisher Scientific 611F96BK For fluorescence measurement in microplate reader
Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom Grenier 655101 For absorbance measurement microplate reader
Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-245 For the outlet
PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft World Precision Instruments NE-PC7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 World Precision Instruments SYRINGE-PUMP-PRO-02 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft World Precision Instruments NE-NET7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Size exclusion chromatography (SEC) column GE Life Science 17085101 Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 31434-1KG-M
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881-500G
Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) World Precision Instruments ALADDIN2-220/AL1000-220
Thermostat Temperature Controller Inkbird ITC-308 Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Tubing, ETFE (1/16" OD) IDEX Health & Science 1516
USB To RS-232 Converter World Precision Instruments CBL-USB-232 Optional: For computer without RS-232 port
Water Bath Grant Instruments Ltd. JB Nova 12

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References

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Bioengineering Ausgabe 157 Mikrofluidik Liposomen thermoempfindlich Lysolipid LTSLs versetzter Fischgrät-Mikromixer cholesterinfrei indocyaningrün (ICG) Doxorubicin-Belastung (DOX)
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