वीवो फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण में प्रोटीन (चतुर्थ-एफपीओपी) एक हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक है जो उनके मूल वातावरण में प्रोटीन संरचना के मानचित्रण के लिए अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल चतुर्थ-एफपीओ माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की असेंबली और सेट-अप का वर्णन करता है।
प्रोटीन का फास्ट ऑक्सीकरण (एफपीओपी) प्रोटीन संरचना, प्रोटीन-लिगामेंट इंटरैक्शन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) विधि है। एफपीओ हाइड्रोक्सिल कण उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस के लिए 248 एनएम पर एक KrF एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है जो ऑक्सीडेटिव रूप से सॉल्वेंट-सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन को संशोधित करता है। हाल ही में, हमने वीवी-एफपीओ पीडब्ल्यूओ नामक कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)में वीवो ऑक्सीडेटिव लेबलिंग में एफपीओ के उपयोग का विस्तार किया। पारदर्शी सूत्रकृमि का उपयोग कई मानव रोगों के लिए मॉडल सिस्टम के रूप में किया गया है। चतुर्थ-एफपीओ द्वारा सी एलिगेंस में संरचनात्मक अध्ययन हाइड्रोजन पेरोक्साइड को तेज करने की जानवर की क्षमता, 248 एनएम पर लेजर विकिरण के लिए उनकी पारदर्शिता और संशोधन की अपरिवर्तनीय प्रकृति के कारण संभव है। चतुर्थ-एफपीओ लेबलिंग, आईवी-एफपीओ पैरामीटर, प्रोटीन निष्कर्षण, और एलसी-एमएस/एमएस अनुकूलित मापदंडों के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की असेंबली यहां वर्णित है ।
प्रोटीन इंटरैक्शन और संरचनापरिवर्तन का अध्ययन करने के लिए हाल के वर्षों में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ प्रोटीन फुटप्रिंटिंग का उपयोग किया गया है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) विधियां प्रोटीन अमीनो एसिड साइड चेन को संशोधित करके प्रोटीन सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी की जांच करती हैं। HRPF विधि, प्रोटीन के तेजी से फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP)1,विट्रो2में प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इन सेल (आईसी-FPOP)3,और सबसे हाल ही में वीवो (चतुर्थ-FPOP)4में । एफपीओ हाइड्रोक्साइल रेडिकल1बनाने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस द्वारा हाइड्रोक्सिल कणों को तेजी से उत्पन्न करने के लिए 248 एनएम तरंगदैर्ध्य एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है। बदले में, इन कणों एक माइक्रोसेकंड समय पैमाने पर 20 अमीनो एसिड में से 19 लेबल कर सकते हैं, तेजी से प्रोटीन से प्रकट कर सकते हैं । हालांकि, हाइड्रोक्सिल कणों के साथ प्रत्येक अमीनो एसिड की प्रतिक्रिया 1000-गुना फैली हुई है, एक सुरक्षा कारक (पीएफ)5की गणना करके साइड चेन ऑक्सीकरण को सामान्य करना संभव है।
चूंकि एफपीओ अपने आकार या प्राथमिक अनुक्रम की परवाह किए बिना प्रोटीन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित कर सकता है, इसलिए यह इन-सेल और वीवो प्रोटीन अध्ययनों के लिए लाभप्रद साबित होता है। चतुर्थ-FPOP सी एलिगेंस में प्रोटीन संरचना की जांच इसी तरह इन विट्रो और इन-सेल अध्ययन4के लिए करता है । सी elegans सूत्रकृमि परिवार का हिस्सा है और व्यापक रूप से मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है । निष्क्रिय और सक्रिय प्रसार दोनों द्वारा हाइड्रोजन पेरोक्साइड को तेज करने की कीड़ा की क्षमता विभिन्न शरीर प्रणालियों में प्रोटीन संरचना के अध्ययन के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, एफपी6के लिए आवश्यक 248 एनएम लेजर तरंगदैर्ध्य में उनकी पारदर्शिता के कारण सी एलिगेंस चतुर्थ-एफपीपी के लिए अनुकूल हैं। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस विधि का युग्मन पारंपरिक बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण ों का उपयोग करके कई संशोधित प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम सी एलिगेंस में प्रोटीन संरचना के विश्लेषण के लिए आईवी-एफपीओ का प्रदर्शन करने का वर्णन करते हैं। प्रायोगिक प्रोटोकॉल के लिए कोनरमैन एट अल7से अनुकूलित चतुर्थ-एफपीओके के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की असेंबली और सेट-अप की आवश्यकता होती है। चतुर्थ-एफपीओ के बाद, प्रोटीन निष्कर्षण के लिए नमूने समरूप होते हैं। प्रोटीन के नमूनों को प्रोटेलियोज़ किया जाता है और पेप्टाइड्स का विश्लेषण तरल क्रोमेटोग्राफ (एलसी) टैंडेम एमएस द्वारा किया जाता है, जिसके बाद क्वांटिफिकेशन होता है।
वीवो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) के अध्ययन के लिए वर्तमान बेंचमार्क फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) है। अपने सबसे सरल रूप में, यह तकनीक पीपीआई का अध्ययन दो अणुओं के बीच ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा करती है जब वे एक-दूसरे15के करीब निकटता में होते हैं। एमएस तकनीकों के विपरीत, FRET में अमीनो-एसिड स्तर पर संरचना परिवर्तन और बातचीत साइटों की विशेषता का संकल्प नहीं है। पीपीआई16के अध्ययन के लिए एमएस आधारित तकनीकों का तेजी से उपयोग किया गया है । चतुर्थ-एफपीओ एक एचआरपीएफ विधि है जो सी एलिगेंस में वीवो प्रोटीन संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। चतुर्थ-एफपीओ द्वारा सी एलिगेंस को सफलतापूर्वक लेबल करने के लिए, नमूना हानि को कम करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली को ठीक से इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है। 250 माइक्रोन यानी केशिका ने छोटे यानी केशिकाओंकीतुलना में नमूना वसूली को अधिकतम करने के लिए दिखाया है। बड़े यानी केशिकाओं का परीक्षण नहीं किया गया है, हालांकि माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली को सी एलिगेंसकी छंटाई के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह साइटोमेट्री प्रणाली के रूप में एक केशिका का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया है। 17 कृमि नमूना आकार भी महत्वपूर्ण है, FPOP से पहले प्रति नमूना ~१०,००० से कम का नमूना आकार एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए पर्याप्त उच्च प्रोटीन सांद्रता उपज नहीं है । प्रारंभिक प्रारंभिक प्रारंभिक मात्रा (चरण 4.5) को समायोजित करके उच्च नमूनों के आकार (और 10,000 कीड़े) का भी उपयोग किया जा सकता है।
माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की उचित असेंबली महत्वपूर्ण है। नमूना मार्ग में लीक कीड़े या एच2ओ2के असंगत प्रवाह में परिणाम है । प्रत्येक प्रयोग के बाद ठीक से साफ होने पर कई चतुर्थ-एफपीओ प्रयोगों से फर्रूल्स, आस्तीन और 3-2 वाल्व का पुन: उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, हम हर जैविक दोहराने के लिए एक नया माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली को इकट्ठा करने की सलाह देते हैं। यदि माइक्रोफ्लुइडिक्स को ठीक से इकट्ठा किया जाता है, तो कीड़े और एच2ओ2 मिश्रण-टी पर न्यूनतम बैक प्रेशर के साथ मिश्रण करेंगे। माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली के गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) के रूप में, हम रंगीन रंगों का उपयोग करके मिश्रण दक्षता का परीक्षण करने की सलाह देते हैं। चतुर्थ-एफपीओ के दौरान कृमि सिरिंज के अंदर चुंबकीय उभारक की गति की निगरानी करना महत्वपूर्ण है, कृमि सिरिंज पर अनुचित नमूना मिश्रण या मिश्रण-टी के परिणामस्वरूप लीक होने का दबाव हो सकता है। इसके अलावा, खराब मिश्रण स्थितियों बड़े नमूना नुकसान, लेजर खिड़की पर कीड़े के गरीब लेजर जोखिम, और clogging के लिए सीसा ।
पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण को कम करने के लिए सी एलिगेंस रखरखाव महत्वपूर्ण है। हम कम तनाव की स्थिति में कम तापमान पर कीड़े उगाने की सलाह देते हैं क्योंकि उच्च तापमान कुल पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण को प्रभावित कर सकता है। केवल कीड़े का एक नियंत्रण नमूना सेट, कोई एच2ओ2 और कोई लेजर विकिरण, प्रयोगशाला रखरखाव के कारण पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण के लिए खाते में सभी चतुर्थ-FPOP प्रयोगों के लिए सिफारिश की है। इस तकनीक की वर्तमान सीमाओं में से एक ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान की गई कुल संख्या है और उच्च प्रोटीन संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रति पेप्टाइड ऑक्सीकृत अवशेषों की कुल संख्या है। हालांकि अनुशंसित नहीं है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उच्च सांद्रता का उपयोग करके ऑक्सीडेटिव संशोधनों में वृद्धि प्राप्त की जा सकती है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड में वृद्धि महत्वपूर्ण जैविक रास्तों को काफी बदल सकती है और साथ ही ऑक्सीकरण-प्रेरित खुलासा करने के लिए नेतृत्व कर सकती है । यदि आईवी-एफपीओ के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता में वृद्धि की जाती है, तो कृमि व्यवहार्यता और पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि 200 मीटर से अधिक सांद्रता का परीक्षण नहीं किया गया है।
वर्णित एलसी-एमएस/एमएस प्रोटोकॉल को अन्य प्रयोगशालाओं के एमएस क्यूसी को पूरा करने के लिए अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है । 2D-क्रोमेटोग्राफी तकनीकों का उपयोग पहले ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स और प्रोटीन18की पहचान बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। बहरहाल, प्रोटीन संवर्धन तकनीक है कि ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्य की सिफारिश नहीं कर रहे हैं, सहित लेकिन एंटीबॉडी वर्षा या पुल नीचे assays तक ही सीमित नहीं है । यदि प्रोटीन की एपिटोप/बाध्यकारी साइट को चतुर्थ-एफपीओद्वारा संशोधित किया गया है तो ये तकनीक ें एक प्रोटीन कंपआम की ओर पूर्वाग्रह कर सकती हैं । इस तरह के सल्फेट कट्टरपंथी एनीऑन10 या ट्राइफ्लोरोथाइलेशन19 के रूप में कट्टरपंथी अभिकर्मकों, पैरों के निशान में नए विकास चतुर्थ-FPOP की बहुमुखी प्रतिभा में वृद्धि हो सकती है । हालांकि वीवो में परीक्षण किए गए एकमात्र लेबलिंग रिएजेंट हाइड्रोजन पेरोक्साइड है, अन्य लेजर-सक्रिय कणों को अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य कणों का उपयोग कृमि व्यवहार्यता, कोशिका चालगम्य, और 248 एनएम लेजर तरंगदैर्ध्य के साथ संगत साबित होना चाहिए। कई मानव रोगों के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में सी एलिगेंस के उपयोग के कारण, चतुर्थ-FPOP रोग रोगजनकन में प्रोटीन संरचना की भूमिका का अध्ययन करने में एक मजबूत प्रभाव की क्षमता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को मैरीलैंड विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर और एनआईएच 1R01 जीएम 127595 से स्टार्ट-अप फंडों द्वारा समर्थित किया गया था एलएमजे को सम्मानित किया गया था। लेखक पांडुलिपि के संपादन में मदद के लिए डॉ डेनियल डेएज का शुक्रिया अदा करते हैं ।
15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |