Summary
Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsillare da esseri umani sani sottoposti a tonsillectomia chirurgica parziale per studiare le risposte immunitarie innate dopo l'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali.
Abstract
Lo studio di cellule isolate da tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) consente di comprendere la risposta delle cellule immunitarie nelle patologie che coinvolgono l'immunità mucosale, perché possono modellare le interazioni ospite-patogeno nel tessuto. Mentre le cellule isolate derivate dai tessuti sono state il primo modello di coltura cellulare, il loro uso è stato trascurato perché il tessuto può essere difficile da ottenere. Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsille (TMC) da tonsille umane sane per studiare le risposte immunitarie innate al momento dell'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali. L'isolamento dei TMC dalle tonsille è rapido, perché le tonsille hanno a malapena alcun epitelio e producono fino a miliardi di tutti i principali tipi di cellule immunitarie. Questo metodo consente di rilevare la produzione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui immunoassays, qPCR, microscopia, citometria di flusso, ecc., simili all'uso di cellule mononucleari periferiche (PBMC) dal sangue. Inoltre, i TMC mostrano una maggiore sensibilità ai test antidroga rispetto ai PMC, che devono essere considerati per i test di tossicità futuri. Pertanto, le colture ex vivo TMC sono un modello mucosale facile e accessibile.
Introduction
Gli studi sugli organi umani sono limitati a causa dell'accessibilità e di ovvie ragioni etiche. Tuttavia, sono essenziali per comprendere appieno la complessità della biologia umana. Le colture di cellule isolate (colture primarie o linee cellulari) sono un sistema standard negli studi di biologia cellulare a causa della loro disponibilità. Mentre le colture di cellule isolate hanno permesso scoperte eccezionali, l'uso di linee cellulari è venuto su un esame più attento perché non imitano completamente la biologia degli organi in vivo. Tuttavia, la coltura di cellule tridimensionali o espianti tissutali è altamente complessa4,5,6. Infatti, un pezzo di tessuto o organo è altamente eterogeneo perché la sua composizione cellulare differisce a seconda della localizzazione nel tessuto. Pertanto, l'utilizzo di blocchi di tessuto richiede l'analisi di molti repliche tecniche e biologiche, portando alla necessità di un gran numero di donatori o pazienti.
I tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) sono strutturalmente simili ai linfonodi ma hanno funzioni uniche, perché il loro ruolo principale è quello di regolare l'immunitàmucosale 7. A differenza dei linfonodi, che di solito si trovano ad una certa distanza dai tessuti, i MALT si trovano generalmente immediatamente sotto l'epitelio del tessuto mucosale. Istologicamente, sono composti principalmente da alte concentrazioni di cellule B e T, ma anche cellule che presentano antigene come macrofagi e cellule dendritiche. MALT costituiscono circa il 50% del tessuto linfoide nel corpo umano. I MALT sono suddivisi in nove gruppi a seconda della loro posizione: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizzato) e D-MALT (diffuso). L'O-MALT è composto principalmente dalle tonsille dell'anello tonsillare di Waldeyer ed è il MALT8,,9più accessibile. Infatti, le tonsille situate nell'oropharynx costituiscono la principale barriera che protegge le vie digerenti e respiratorie dai microrganismi invasivi10. Inoltre, le tonsille sono coperte da un sottile epitelio squamoso non-cheratinizzante, supportato da una capsula di tessuto connettivo contenente vasi sanguigni, nervi e linfatici, fornendo un facile accesso alle cellule immunitarie11,12. Inoltre, la tonsillectomia, l'atto chirurgico di rimozione delle tonsille, è una procedura comune eseguita sui bambini che hanno la respirazione disordinata di sonno, rendendo le tonsille un tessuto facilmente disponibile13 in contesti fisiologici.
Tonsils permettono lo studio della risposta delle cellule immunitarie in patologie che coinvolgono l'immunità mucosale. Infatti, nell'infezione da HIV, perché le tonsille sono composte da un'alta concentrazione di cellule immunitarie, sono il bersaglio principale della replicazione virale ma producono anche una grande quantità di citochine che non vengono rilevate nella circolazione14,15. A stati costanti, popolazioni rare di cellule simili innate sono presenti in vari tessuti mucosali, comprese le tonsille, ma sono essenzialmente assenti dal sangue.
Pertanto, le cellule mononucleari provenienti da tonsille (TMC) sono un modello più rilevante e complesso dei PBMC e possono rispondere a domande più profonde. D'altra parte, l'uso di espianti tissutali può essere complesso e non sempre rilevante per studi immunitari innati. Così, abbiamo stabilito un modello per studiare l'attivazione immunitaria mucosale utilizzando TMC16. Qui, descriviamo un metodo per un isolamento efficiente dei TMC dalle tonsille umane fresche. Questo metodo consente il recupero di un gran numero di cellule immunitarie pur mantenendo la loro integrità per gli studi ex vivo.
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Protocol
Gli esemplari non vengono raccolti specificamente per scopi di ricerca e lo studio non è considerato invasivo. Tuttavia, la raccolta delle tonsille umane richiede l'approvazione etica da parte delle autorità locali competenti. Nel nostro caso, è stato approvato dalla Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Inoltre, viene richiesto il consenso di ogni paziente o rappresentante legale per ottenere i dati personali dei donatori (ad esempio, sesso, età, storia di infezioni ent) che possono aiutare a interpretare i risultati sperimentali.
1. Manipolazione del tessuto delle Tonsillari Umane
- Mettere al laboratorio tonsille di ogni donatore in una fiala sterile da 50 mL contenente 25 mL PBS 1x e trasportare al laboratorio (RT) secondo le raccomandazioni dell'autorità (utilizzare tre livelli di protezione: fiale, una cassetta di sicurezza e un sacchetto).
NOT: L'intera procedura deve essere eseguita in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2. Tutti i campioni umani devono essere trattati con cura in quanto non sono stati precedentemente qualificati e possono contenere agenti infettivi. -
Pulire tutti gli strumenti tra ogni utilizzo.
- Dopo l'uso, smontare il colino cellulare e tenere con tutti gli altri strumenti (ad esempio pestello, pinze) in un bagno contenente una soluzione di detersivo (1/10 di detersivo volume in H2O) durante la notte.
- Spennellare ogni utensile per rimuovere il tessuto e lavare con acqua limpida.
- Asciugare bene tutte le parti, quindi preparare il colino cellulare (85 mL, 37 mm di diametro) posizionando una griglia in acciaio a 60 maglie sopra una griglia in acciaio a 10 maglie e chiudere strettamente l'anello.
- Mettere tutti gli strumenti in sacchetti sterili e autoclave.
2. Dissezione del tessuto tonsillare umano e isolamento delle celle mononucleari tonsillare (TMC)
- Posizionare il colino cellulare su un piatto di coltura cellulare 150 x 25 mm2 (SPL150) e tutti gli strumenti in un altro SPL150 per mantenerli sterili.
- Trasferire le tonsille dalla fiala nel colino a cellule utilizzando pinze sterili. Versare anche in tutto il PBS, che contiene alcune cellule che hanno eseguito le tonsille. Se necessario, aggiungere altro PBS per immergere la griglia.
NOT: Il tessuto deve essere immerso in ogni momento per evitare l'esidratazione. - Rimuovere il tessuto cauterizzato, sanguinante e fibroma usando la pinza e un bisturi.
NOT: Tonsils rimosso dai bambini non hanno bisogno di questo passaggio. - Tagliare i tessuti in piccoli pezzi di meno di 0,5 cm di diametro utilizzando il bisturi e le pinzette curve. Tagliare tutto il tessuto in modo che i piccoli pezzi possano essere immersi in ogni momento.
- Mettere alcuni pezzi di tessuto nel colino cellulare e raschiarli sulla griglia con un pestello di vetro fino a quando rimane solo uno strato davvero sottile di stroma bianco. Rimuovere e scartare lo stroma per evitare di intasare la griglia.
- Una volta che tutti i tessuti sono stati spremuti attraverso la griglia, utilizzare una pipetta da 10 mL per trasferire tutte le sospensioni cellulari sulla griglia e raschiarla un'ultima volta.
- Trasferire la sospensione cellulare con una pipetta da 10 mL in una fiala sterile. Lavare la griglia e il colino cellulare con PBS 1x. Lasciare riposare la sospensione cellulare per 5 min a RT sul banco. Questo passaggio permette la precipitazione e l'agglomerazione dello stroma, delle cellule morte e di qualsiasi DNA rilasciato, e faciliterà il passo successivo.
- Posizionare uno sterile setaccio di 70 m sopra una nuova fiala da 50 mL (rimuovere con attenzione dall'involucro) e trasferire delicatamente la sospensione cellulare su di esso con una pipetta da 10 mL. Non mescolare le sospensioni, perché un pellet è spesso presente. Se il setaccio è intasato, utilizzare la parte posteriore di una punta sterile da 1 mL pipetta per graffiare le cellule attraverso il setaccio. Cambiare il setaccio tutte le volte che è necessario.
- Centrifugare le cellule a 250 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Scartare il supernatante e risospendere il pellet mescolando delicatamente la fiala, quindi risospendere le cellule in 35 mL di PBS.
- In una nuova fiala, posizionare un nuovo setaccio di 70 m sulla parte superiore e trasferire la sospensione cellulare su di esso con una pipetta da 10 mL. Se il setaccio è intasato, utilizzare la tecnica descritta nel passaggio 2.7.
3. Isolamento dei TMC in base al gradiente di densità delle celle
NOT: I TMC possono essere utilizzati dopo il passaggio 2.10. Tuttavia, per ottenere una soluzione cellulare più chiara e per rimuovere altri detriti cellulari e le cellule rosse, si consiglia di eseguire un isolamento del gradiente di densità cellulare delle cellule mononucleari.
- Aggiungete 15 mL del gradiente medio di densità (d - 1,076 g/mL) in una nuova flaconla da 50 mL. Versare la soluzione TMC sopra il mezzo di sfumatura di densità, facendo attenzione a ridurre al minimo la miscelazione delle sospensioni con il mezzo di sfumatura di densità.
- Centrifugare la soluzione a 1.000 x g per 30 min a RT con accelerazione e rottura.
- Rimuovere con una pipetta da 10 mL ed eliminare lo strato superiore (contenente principalmente PBS 1x) senza disturbare l'interfaccia tra i TMC e il mezzo di sfumatura di densità.
NOT: I TMC contengono un basso numero di eritrociti, quindi la soluzione è chiara. Pertanto, l'interfaccia tra la soluzione dei TMC in PBS e il mezzo di sfumatura di densità può essere difficile da visualizzare. Di conseguenza, le celle possono essere risospese in RPMI 1640 integrate con 20 m HEPES (senza FBS) prima che venga eseguito il gradiente di densità. - Rimuovere i TMC con una punta sterile da 1 mL e metterli in una nuova fiala da 50 mL.
- Lavare le cellule aggiungendo 50 mL di PBS contenente il 2% del siero bovino fetale (FBS) e 2 mM EDTA e centrificare il tubo a 250 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per rimuovere le piastrine rimanenti.
- Ripetere il passaggio 3.5, ma centricarlo a 400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Preparare il mezzo di coltura (R10) integrando RPMI 1640 con FBS inattivato al calore al 10%, 2 mM L-glutamine e la soluzione antibiotica (100 U/mL penicillium e 100g/mL streptomicina).
- Risospendere i TMC in 10 mL di R10 e contare le celle. In media, questa tecnica produce 5 x 108-2 x 109 TBC per coppia di tonsille. Le cellule possono ora essere utilizzate per indagini come pMC da sangue intero (ad esempio, purificazione di un tipo di cellula specifico, coltura cellulare, citometria di flusso, RT-qPCR, congelamento, ecc.).
-
Se necessario, congelare le celle per un ulteriore utilizzo utilizzando tecniche standard per il congelamento delle cellule primarie.
- Contare il numero di celle.
- Centrifugare le cellule e rimuovere il super-natante. Sciogliere il pellet in abbastanza 100% FBS per una concentrazione finale di 1 x 108 celle / mL, quindi aggiungere lo stesso volume di una soluzione 80% FBS - 20% DMSO. Le celle saranno quindi a 5 x 107 celle / mL. Questo passaggio deve essere effettuato a 4 gradi centigradi e la soluzione FBS e DMSO deve essere mantenuta a 4 gradi centigradi prima dell'uso.
- Distribuire 1 mL della soluzione cellulare in criotubi e metterli in un contenitore di congelamento lento che è stato a 4 gradi durante la notte per controllare il tasso di congelamento cellulare. Collocarlo a -80 gradi centigradi.
- Per scongelare le cellule, mettere i crioviali in un bagno caldo a 37 gradi centigradi per alcuni secondi con agitazione costante. Non appena le cellule iniziano a scongelarsi, trasferirle a 49 mL di R10 e centrifugare per rimuovere il DMSO. Contare le celle e utilizzarle come PBMC.
NOT: Anche se il congelamento e lo scongelamento dei TMC rimuoveranno i detriti, danneggerà anche alcuni tipi di cellule rare. Se sono presenti grumi o detriti dopo lo scongelamento, è meglio passare la sospensione cellulare attraverso uno sterile setaccio di 70 m prima di usarlo.
4. Fenotipizzazione dei TMC per Citometria di flusso
- Recuperare 5 x 106 cellule dalla soluzione precedente per ogni pannello di miscela anticorpale che deve essere testato e posto in un tubo di citometria 5 mL. Recuperare 1 x 106 celle per il controllo non colorato.
- Lavare le cellule in PBS e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospenderli in 500 gradi l di PBS (1 x 106 celle/mL) e incubarli con una macchia di vitalità per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.
- Aggiungere il calore di 5 gradi di calore inattivato dal siero ab umano per 100 gradi di sospensione cellulare e incubare per 15 minuti a 4 gradi centigradi al buio.
- Lavare le cellule in PBS : 2% FBS - 2 mM EDTA (Wash Buffer) e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Risospendere i TMC in 500 -L di Wash Buffer contenenti gli anticorpi, come descritto nella tabella 1. Incubare le cellule per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.
- Lavare le cellule in Wash Buffer e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospendere i TMC in 500 - L di PBS contenenti lo 0,5% di paraformaldeide (PFA). Mantenere al buio a 4 gradi centigradi fino all'acquisizione da citometria di flusso.
NOT: La PFA è pericolosa. Utilizzare una soluzione commerciale pronta all'uso per preparare la soluzione PFA 0.5%.
| Anticorpo | Clone | Fluorocromo | Azienda |
| Vivi morti | BV405 (in modo | ThermoFisher Scientifico | |
| CD3 (in questo caso) | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 (in questo caso) | SK1 | Amcyano | BD Pharmingen |
| CD8 (in questo caso) | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 (in questo caso) | NUMERO di giochi di posta elettronica | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 (informazioni in stato indue) | HI30 (in questo MODO 30) | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 (informazioni in stato INstato CD1 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 (informazioni in due) | 2H7 (in via di inadem | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 (informazioni in due) | M5E2 (in questo stato del sistema) | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 (informazioni in due) | M5E2 (in questo stato del sistema) | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 (informazioni in inglese) | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 (in inglese) | MEM188 (in detto) | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 (informazioni in confronto a 3: CD12 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 (in inglese) | Blu Pacifico | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c (informazioni in base al nome) | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebioscienze |
Tabella 1: Elenco degli anticorpi per la caratterizzazione delle cellule per citometria di flusso.
5. Esempio di attivazione di TMC e misurazione della produzione di Cytokine
- Diluire i TMC in R10 medio per ottenere una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL.
- Distribuire 400.000 TMC in 200-L di R10 in una piastra inferiore ben rotonda 96.
- Per attivare le cellule, aggiungere 5 g/mL della resiquimod orista TLR7/8 (R848) durante la notte.
- Centrificare le piastre e recuperare il supernatale dei TMC e congelarlo per ulteriori analisi. La produzione di citochine sarà valutata utilizzando immunoasisti a base di perline per quantificare simultaneamente citochine solubili multiple utilizzando un citometro a flusso seguendo il protocollo del produttore.
- Valutare la vitalità delle cellule utilizzando un saggio di vitalità cellulare luminescente seguendo il protocollo del produttore. In breve, aggiungere 60 l di soluzione di vitalità cellulare ai pozzi e misurare la luminescenza entro 10 min (acquisizione per 1 s/well).
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Representative Results
Per prima cosa abbiamo caratterizzato il profilo immunitario delle cellule presenti nella coltura e analizzato la quantità di TMC. Abbiamo fenotipato i TMC da tonsille con citometria di flusso. Come mostrato nella Figura 1, tutti i principali tipi di cellule immunitarie presenti nei PBMC dal sangue erano rappresentati nei TMC da tonsille. Tuttavia, nei TMC la frequenza di tutti i tipi di cellule, ad eccezione delle cellule B, era inferiore a quella dei PBMC.
Figura 1: Fenotipizzazione dei TMC in tonsille. I TMC provenienti da donatori sani sono stati ottenuti dopo la dissezione del tessuto tonsillare umano e l'isolamento delle cellule. (A) Le celle sono state macchiate e i dati sono stati acquisiti dalla citometria di flusso. I dati rappresentano un esperimento rappresentativo. (B) La tabella riassume la percentuale di ogni tipo di cellula in MPC vivi in tonsille provenienti da sei diversi donatori sani e confronta ciascuna con la percentuale di ogni tipo di cellula in PBMC Dal sangue, come definito nella letteratura18,19. I dati sono mostrati come la percentuale di celle vive SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo quindi testato le risposte immunologiche dei TMC. Un modo per riprodurre l'attivazione di una cellula contro un agente patogeno è quello di stimolare i sensori immunitari innati della famiglia Toll-Like Receptors (TLR). I TLR sono presenti principalmente nei monociti/macrofagi, in tutti i sottotipi di cellule dendritiche (DC), nelle cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) e anche nelle cellule B. In questo esempio, abbiamo studiato TLR7 e TLR8, perché sono specializzati in risposte antivirali e la maggior parte dei casi di tonsillite (cioè le infezioni da tonsille) sono causati da un'infezione virale. Così, i TMC provenienti da tonsille (grafico in blu) di sette donatori sani sono stati stimolati durante la notte con il ligando TLR7/8 resiquimod (R848). Come nei PBMC (grafico in verde), l'attivazione attraverso la segnalazione TLR7/8 ha innescato la produzione di interferoni di tipo I (IFN) e citochine pro-infiammatorie. Infatti, la citochina più altamente prodotta nei TMC al momento dell'attivazione era IFN, un membro della famiglia IFN di tipo I che è principalmente coinvolta nell'immunità innata contro l'infezione virale ed è per lo più prodotta dai PDC. Tutte le citochine testate, ad eccezione di IFN2/3 e IL-8, sono state prodotte da TMC, anche se a livelli inferiori rispetto ai PBMC. È interessante notare che alcune citochine (principalmente IL-8, ma anche IL-6, IL-10 e TNF) erano presenti in quantità maggiore a livelli basali. Inoltre, abbiamo confrontato la citochina prodotta da TMC isolati o da blocchi di tessuto tonsillare preparati come descritto in precedenza6. Abbiamo misurato tutti i tipi di IFN prodotti nel supernatale di entrambe le colture cellulari utilizzando l'asdetto del reporter della linea cellulare STING-37, come descritto in precedenza17, e abbiamo dimostrato che potevamo misurare solo i livelli IFN nei TMC isolati.
Figura 2: TMC ha prodotto citochine al momento della stimolazione. (A) I TMC purificati e isolati (blu) e i PMC (verde) sono stati stimolati durante la notte con R848 (5 g/mL). I supernatanti sono stati recuperati e congelati fino all'uso. È stata eseguita un'immunoanalisi a base di perline per quantificare più citochine solubili contemporaneamente utilizzando un citometro a flusso. I grafici rappresentano la concentrazione in picogrammi per millilitore di ogni citochina misurata. Gli aumenti di piegatura sono annotati in rosso sui grafici. Test Mann-Whitney U. ((B)I TON purificati e isolati da blocchi di tonsilli (blu) e di tessuto tonsillare (arancione) sono stati stimolati per 24 h con virus Influenza A (IAV). Un test della linea cellulare reporterS-37 è stato utilizzato per misurare la produzione di IFN nel supernatore. Box e baffi plot con mediana - minimo-massimo. Test Mann-Whitney U. P < 0,001,srl < 0,01,P < 0,05. NS - non stimolato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Infine, abbiamo testato la fattibilità dei TMC. Sono disponibili diverse tecniche per misurare la vitalità cellulare. Qui, abbiamo usato un saggio di fattibilità cellulare luminescente, un saggio in due fasi facile e veloce. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo chiaramente rilevato la citotossicità indotta dal composto 1 nei TMC, che non era tossico per i PBMC. Così, TMC ha mostrato una maggiore sensibilità al farmaco testato.
Figura 3: Il composto 1 era tossico per i TMC. I TMC e i PMC purificati e isolati sono stati preincubati con composto 1 (C1) a varie concentrazioni per 1 h e poi stimolati durante la notte con R848 (5 g/mL). Sono stati recuperati i supernatanti, sono stati aggiunti 60 l di soluzione di vitalità cellulare e è stata misurata la luminescenza. Il simbolo : rappresenta l'analisi statistica confrontando C1 e NS. Box e baffi plot con mediana - minimo-massimo. Test Kruskal-Wallis con correzione post hoc di Dunn. P < 0,0001, s.r.l. P < 0.001,P < 0,01,P < 0,05.P NS - non stimolato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le tonsille umane rappresentano un modello ex vivo integrativo e fisiologico per studiare le risposte immunitarie innate nell'interfaccia mucosale, perché imitano il ruolo di un organo linfoide secondario. È interessante notare che la composizione cellulare dei TMC è simile ai PMC e include tutte le principali popolazioni di cellule, anche se la loro percentuale può essere diversa dai PMC dal sangue (Figura 1). Ulteriori popolazioni possono anche essere trovate, come tutte le risposte immunitarie sono iniziate nei tessuti (mucosa o organi linfoidi secondari) e non nel sangue.
L'uso di espianti del tessuto umano così come l'uso di colture cellulari o cellule del sangue hanno ciascuno i loro vantaggi. Tuttavia, per lo studio della secrezione di citochine e dell'attivazione cellulare, gli espianti tissutali non erano il modello migliore. Infatti, non siamo riusciti a rilevare alcuna produzione IFN nel supernatale degli espianti tissutali (Figura 2B). Ipotizziamo che sia direttamente consumato dalle cellule circostanti. D'altra parte, la stimolazione delle cellule del sangue (PBMC) può imitare la risposta primaria all'infezione, ma non imitare ciò che sta accadendo nei tessuti, dove la maggior parte delle citochine sono prodotte e dove i virus si replicano. Pertanto, abbiamo istituito un protocollo per isolare e purificare le cellule derivanti da un tessuto linfoide secondario, la tonsilla. Abbiamo purificato i TMC da tonsille umane sane, che ci permettono di studiare l'attivazione delle cellule immunitarie dopo la stimolazione. Tuttavia, una delle limitazioni di questo modello è che i TMC non producono tante citochine pro-infiammatorie come i PBMC stucchedi ex vivo sulla stimolazione TLR7/8, anche se i livelli di IFN, la principale citochina antivirale, sono simili in entrambe le colture.
Lo studio della tossicità dei composti sui TMC rispetto ai PMC ha rivelato che i TMC sono più sensibili a un farmaco tossico (Figura 3). Pertanto, la tossicità di nuovi farmaci e trattamenti futuri dovrebbe essere testata nelle cellule provenienti dai tessuti e non solo su linee cellulari, PBMC o espedienti tissutali. Pertanto, l'uso di TMC per i test antidroga sembra essere una futura applicazione del metodo descritto.
Tonsils da adulti o bambini possono essere ottenuti ed elaborati come descritto. Tuttavia, si consiglia di ottenere tonsille dai bambini per due motivi principali: 1) Le tonsille dei bambini contengono più cellule rispetto ai20adulti. Infatti, l'ipertrofia tonsillari è particolarmente comune nei bambini, perché combattono più virus infantili. Così, queste grandi tonsille possono diventare tonsille ostruttive e devono essere rimossi da una tonsillectomia parziale per evitare complicazioni come l'apnea del sonno13; 2) Poiché le tonsille degli adulti vengono solitamente rimosse dopo diversi episodi di infezioni orecchio-naso-gola (ENT), queste tonsille sono meno ingenue e contengono meno cellule.
E 'fondamentale per lavorare sulle tonsille il più presto possibile dopo l'intervento di rimozione, idealmente <3 h dopo la raccolta. Infatti, subito dopo la rimozione e fino alla dissezione, le tonsille da ogni lato sono tenute insieme in una fiala sterile da 50 mL contenente circa 20 mL di PBS, in modo che siano totalmente sommerse.
La variabilità degli interdonatori può rappresentare un problema importante per la riproducibilità. In effetti, la variabilità nella composizione cellulare tra donatori può essere significativa. Il nostro protocollo, utilizzando TMC e non espemanti di tessuto, limita questa variabilità perché le cellule dell'intera tonsilla vengono mescolate prima di essere placcate e messe in coltura, mentre gli espianti tissutali portano variabilità intradonori nella composizione cellulare perché i pezzi provengono da diverse aree all'interno dello stesso esemplare. La tonsillectomia parziale può essere eseguita solo su tonsille non infiammate, il che limita la variabilità dello stato infiammatorio tra i pazienti. Si consiglia inoltre di raccogliere tonsille rimosse chirurgicamente in giorni diversi. Abbiamo chiaramente notato che le variabili interchirurghe e intergiorni sono superiori alla variabilità interdonor (dati non mostrati).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) per gli esperimenti e la borsa di studio N.B. (AAP 2017 166). N.S. riconosce il sostegno dell'ANRS per la borsa di studio (AAP 2016 1), l'Organizzazione europea di biologia molecolare EMBO for Fellowship (LT 834 2017), il programma di finanziamento per le startup "Baustein" della Facoltà di Medicina dell'Università di Ulm (LSBN.0147) e la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
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