Isolering av tonsillar mononukleære celler for å studere ex vivo medfødte immunresponser i et humant slimhinnelymfoid vev
Summary
I den nåværende protokollen forklarer vi hvordan man enkelt kan behandle og kultur tonsillar mononukleære celler fra friske mennesker som gjennomgår delvis kirurgisk mandlene for å studere medfødte immunresponser ved aktivering, etterligne virusinfeksjon i slimhinnevev.
Abstract
Ved å studere isolerte celler fra slimhinne-assosiert lymfoidvev (MALT) kan forståelse av immuncellers respons i patologier som involverer slimhinneimmunitet, fordi de kan modellere vertspatogeninteraksjoner i vevet. Mens isolerte celler avledet fra vev var den første cellekulturmodellen, har bruken blitt neglisjert fordi vev kan være vanskelig å få tak i. I den nåværende protokollen forklarer vi hvordan man enkelt kan behandle og kultur tonsillar mononukleære celler (TMCer) fra friske menneskelige mandler for å studere medfødte immunresponser ved aktivering, etterligne virusinfeksjon i slimhinnevev. Isolering av TMCer fra mandlene er rask, fordi mandlene knapt har noe epitel og gir opp til milliarder av alle store immuncelletyper. Denne metoden tillater påvisning av cytokinproduksjon ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunanalyser, qPCR, mikroskopi, strømningscytometri, etc., lik bruk av perifere mononukleære celler (PBMCer) fra blod. Videre viser TMCs en høyere følsomhet for narkotikatesting enn PBMCs, som må vurderes for fremtidige toksisitetsanalyser. Dermed er ex vivo TMCs kulturer en enkel og tilgjengelig slimhinnemodell.
Introduction
Studier på menneskelige organer er begrenset på grunn av tilgjengelighet samt åpenbare etiske årsaker. Imidlertid er de avgjørende for å fullt ut forstå kompleksiteten i menneskelig biologi. Kulturer av isolerte celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologistudier på grunn av deres tilgjengelighet. Mens isolerte cellekulturer har tillatt fremragende funn, har bruken av cellelinjer kommet nærmere gransking fordi de ikke fullt ut etterligner in vivo organbiologi. Imidlertid er kulturen av tredimensjonale celler eller vevsekplanter svært komplekse4,5,6. Faktisk er et stykke vev eller organ svært heterogen fordi cellesammensetningen varierer avhengig av lokaliseringen i vevet. Dermed, ved hjelp av vev blokker krever analyse av mange tekniske og biologiske replikerer, noe som fører til behov for et stort antall donorer eller pasienter.
Slimhinne-assosiert lymfoid vev (MALT) er strukturelt lik lymfeknuter, men har unike funksjoner, fordi deres hovedrolle er å regulere slimhinne immunitet7. I motsetning til lymfeknuter, som vanligvis ligger i en viss avstand fra vevet, er MALT vanligvis plassert umiddelbart under epitelet i slimhinnevevet. Histologisk består de hovedsakelig av høye konsentrasjoner av B- og T-celler, men også antigen-presenterende celler som makrofager og dendrittiske celler. MALT utgjør ca 50% av lymfoidvevet i menneskekroppen. MALT er delt inn i ni grupper avhengig av deres plassering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strupehode-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisert) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsakelig av mandlene til Waldeyers tonsillarring og er den mest tilgjengelige MALT8,,9. Faktisk utgjør mandler som ligger i oropharynx den store barrieren som beskytter fordøyelses- og luftveiene mot (potensielle) invasive mikroorganismer10. I tillegg er mandlene dekket av en fin stratifisert plateepitel ikke-keratinizing epitel, støttet av en kapsel av bindevev som inneholder blodkar, nerver og lymfekreft, noe som gir enkel tilgang til immuncellene11,12. Videre er mandlene, den kirurgiske handlingen med å fjerne mandler, en vanlig prosedyre utført på barn som har søvnrelatert pust, noe som gjør mandlene til et lett tilgjengelig vev13 i fysiologiske omgivelser.
Mandler tillater studiet av immuncellerespons i patologier som involverer slimhinneimmunitet. Faktisk, i HIV-infeksjon, fordi mandlene består av en høy konsentrasjon av immunceller, er de hovedmålet for viral replikering, men produserer også en stor mengde cytokiner som ikke oppdages i sirkulasjonen14,15. Ved steady states er sjeldne populasjoner av medfødte celler tilstede i ulike slimhinnevev, inkludert mandlene, men er i hovedsak fraværende fra blod.
Mononukleære celler fra mandlene (TMCer) er dermed en mer relevant og kompleks modell enn PBMCs og kan svare på mer dyptgripende spørsmål. På den annen side kan bruken av vevsekplanter være komplisert og ikke alltid relevant for medfødte immunstudier. Dermed etablerte vi en modell for å studere slimhinne immunaktivering ved hjelp av TMCs16. Her beskriver vi en metode for effektiv isolering av TMCer fra friske menneskelige mandler. Denne metoden gjør det mulig å gjenopprette et stort antall immunceller samtidig som de holder sin integritet for ex vivo-studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menneskelige mandler representerer en integrerende og fysiologisk ex vivo modell for å studere medfødte immunresponser ved slimhinnegrensesnittet, fordi de etterligner rollen som et sekundært lymfoid organ. Interessant, den cellulære sammensetningen av TMCs er lik PBMCs og inkluderer alle de store cellepopulasjonene, selv om deres prosentandel kan være forskjellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Ytterligere populasjoner kan også bli funnet, da alle immunresponser initieres i vev (slimhin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenter og N.B. fellesskap (AAP 2017 166). N.S. anerkjenner støtte fra ANRS for fellesskap (AAP 2016 1), European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), oppstartsfinansieringsprogrammet “Baustein” ved Det medisinske fakultet ved Ulm University (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
