Isolering av tonsiller mononukleära celler att studera Ex Vivo medfödda immunsvar i en mänsklig mukosal lymfoid vävnad
Summary
I det nuvarande protokollet förklarar vi hur man enkelt bearbeta och kultur tonsillar mononukleära celler från friska människor genomgår partiell kirurgiska tonsillektomi att studera medfödda immunsvar vid aktivering, härma virusinfektion i mucosal vävnader.
Abstract
Att studera isolerade celler från slemhinnor-associerade lymfoida vävnader (MALT) gör det möjligt att förstå immunceller svar i patologier som involverar mukosal immunitet, eftersom de kan modellera värd-patogeninteraktioner i vävnaden. Medan isolerade celler som härrör från vävnader var den första cellkultur modell, deras användning har försummats eftersom vävnad kan vara svårt att få. I det nuvarande protokollet förklarar vi hur man enkelt bearbeta och kultur tonsillar mononukleära celler (TMCs) från friska mänskliga tonsiller att studera medfödda immunsvar vid aktivering, härma virusinfektion i mucosal vävnader. Isolering av TMCs från tonsiller är snabb, eftersom tonsiller knappt har någon epitel och ger upp till miljarder av alla större immuncelltyper. Denna metod gör det möjligt att upptäcka cytokinproduktion med hjälp av flera tekniker, inklusive immunoassays, qPCR, mikroskopi, flödescytometri, etc., liknande användningen av perifera mononukleära celler (PBMCs) från blod. Dessutom visar TMCs en högre känslighet för drogtester än PBMCs, som måste beaktas för framtida toxicitetsanalyser. Således är ex vivo TMCs kulturer en enkel och tillgänglig slemhinnor modell.
Introduction
Studier på mänskliga organ är begränsade på grund av tillgänglighet samt uppenbara etiska skäl. Men de är nödvändiga för att fullt ut förstå komplexiteten i mänsklig biologi. Kulturer av isolerade celler (primära kulturer eller cellinjer) är ett standardsystem i cellbiologistudier på grund av deras tillgänglighet. Medan isolerade cellkulturer har tillåtit enastående upptäckter, har användningen av cellinjer kommit på närmare granskning eftersom de inte helt efterlikna in vivo orgelbiologi. Emellertid, kulturen av tredimensionella celler eller vävnad explants är mycket komplex4,5,6. Faktum är att en bit vävnad eller organ är mycket heterogen eftersom dess cellsammansättning skiljer sig beroende på lokaliseringen i vävnaden. Således, med hjälp av vävnadsblock kräver analys av många tekniska och biologiska replikat, vilket leder till behovet av ett stort antal givare eller patienter.
De slemhinna-associerade lymfoida vävnader (MALT) är strukturellt liknar lymfkörtlarna men har unika funktioner, eftersom deras huvudsakliga roll är att reglera mucosal immunitet7. Till skillnad från lymfkörtlarna, som vanligtvis ligger på ett visst avstånd från vävnaderna, malt är i allmänhet ligger omedelbart under epitelet av slemhinna vävnad. Histologiskt består de huvudsakligen av höga koncentrationer av B- och T-celler, men också antigenpresenterande celler som makrofager och dendritiska celler. MALT utgör cirka 50% av lymfoid vävnad i människokroppen. MALT är indelade i nio grupper beroende på var de befinner sig: GALT (gut-), BALT (bronkerna-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (struphuvud-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiserad) och D-MALT (diffust). O-MALT består huvudsakligen av tonsillerna i Waldeyers tonsillring och är den mest tillgängliga MALT8,,9. Faktum är att tonsiller som ligger i svalget utgör den största barriären som skyddar mag- och luftvägarna från (potentiella) invasiva mikroorganismer10. Dessutom är tonsiller omfattas av en fin stratifierad skivepitelcancer icke-keratiniserande epitel, med stöd av en kapsel av bindväv som innehåller blodkärl, nerver och lymfatik, vilket ger enkel tillgång till immuncellerna11,12. Dessutom tonsillektomi, den kirurgiska handlingen att ta bort tonsiller, är ett vanligt förfarande som utförs på barn med sömn-störd andning, vilket gör tonsiller en lätt tillgänglig vävnad13 i fysiologiska inställningar.
Tonsiller tillåter studier av immuncellsvar i patologier som involverar mukosal immunitet. Faktum är att i HIV-infektion, eftersom tonsiller består av en hög koncentration av immunceller, de är det huvudsakliga målet för virusreplikation men också producera en stor mängd cytokiner som inte upptäcks i cirkulationen14,15. Vid steady states, sällsynta populationer av medfödda-liknande celler finns i olika slemhinnor vävnader, inklusive tonsiller, men är i huvudsak frånvarande från blod.
Mononukleära celler från tonsiller (TMCs) är alltså en mer relevant och komplex modell än PBMCs och kan svara på mer djupgående frågor. Å andra sidan kan användningen av vävnad explants vara komplex och inte alltid relevant för medfödda immunstudier. Således etablerade vi en modell för att studera mucosal immunaktivering med TMCs16. Här beskriver vi en metod för effektiv isolering av TMCs från färska mänskliga tonsiller. Denna metod möjliggör återvinning av ett stort antal immunceller samtidigt som deras integritet för ex vivo studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mänskliga tonsiller representerar en integrativ och fysiologisk ex vivo modell för att studera medfödda immunsvar vid mucosal gränssnittet, eftersom de efterliknar rollen av en sekundär lymfoida organ. Intressant nog är den cellulära sammansättningen av TMCs liknar PBMCs och omfattar alla de stora cellpopulationerna, även om deras andel kan skilja sig från PBMCs från blod (figur 1). Ytterligare populationer kan också hittas, eftersom alla immunsvar initieras i vävnader (slemhinn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) för experiment och N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. bekräftar stöd från ANRS for fellowship (AAP 2016 1), European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), startup funding program “Baustein” vid medicinska fakulteten vid Ulm University (LSBN.0147) och Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
